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1 INTRODUCCIÓN: Durante mi estancia en la empresa ALKEMI S.A. he podido realizar diversos procedimientos utilizados de cara al control de calidad de aguas, alimentos, medicamentos, piensos También en dichos laboratorios llevábamos a cabo la preparación de medios de cultivo, de los cuales también se realiza un control de calidad, y su posterior esterilización en autoclave. Además se realizan de forma periódica controles de contaminación de ambiente y superficie para conocer las condiciones higiénicas del laboratorio. Para llevar a cabo todos estos procesos se siguen una serie de procedimientos normalizados de trabajo. 1

2 PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE Legionella sp EN AGUAS: Legionella sp es una bacteria aerobia que crece intracelularmente en macrófagos humanos. Crece en medio enriquecido con hierro y L-cisteina. Se trabaja en campana de seguridad biológica y posteriormente hay que realizar una desinfección con lejía y lámpara ultravioleta. Este procedimiento se puede subdividir en tres partes: -Concentración de la muestra y tratamientos de ácido y calor. -Siembra en agar selectivo. Incubar 10 días a 37º C. -Subcultivos selectivos. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: Encendemos la campana de seguridad biológica en la cual llevaremos a cabo todo el procedimiento, conectamos la lámpara de luz blanca. Añadimos al agua recibido 0,1ml de tiosulfato al 10% por cada 100ml de muestra. El tiosulfato se emplea para eliminar la actividad del cloro y ha de estar previamente esterilizado. Homogeneizar la muestra y dejar reposar. CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA: Filtraremos un volumen de 1000ml. Colocamos la goma Guko en la boca del kitasato. Ponemos el embudo en el kitasato. Introducimos un filtro de membrana 2

3 microporosa con unas pinzas flameadas con la cuadrícula hacia arriba. Vertemos la muestra en el embudo y conectamos el Kitasato a una bomba de vacío. Una vez filtrados los 1000ml, cogemos el filtro con unas pinzas flameadas y lo colocamos en una placa petri. Troceamos el filtro utilizando un bisturí estéril e introducimos los trozos en un tubo estéril, resuspendemos en 10ml de agua destilada. Agitamos en vortex 5minutos. Sembramos 0,1ml en GVPC. TRATAMIENTO CON CALOR: Ponemos 0,9-1ml del concentrado de la muestrea en un tubo estéril. Introducimos el tubo en un baño a 50ºC durante 30minutos. Sembramos 0,1ml en placas de GVPC. TRATAMIENTO ÁCIDO: Ponemos 0,9ml del concentrado en un tubo estéril junto con 0,1ml de buffer ácido (HCl/KCl) 10x.Dejamos reposar 5minutos y sembramos 0,1ml en placas de GVPC. Las placas de GVPC deben ser rotuladas previamente con la clave de la muestra, la fecha y concentrado o, en su caso, ácido o calor. Después de la siembra se introducen las placas en una estufa a 36ºC durante 10 días en atmósfera húmeda. LECTURA: Las placas se leen cada 2-4 días. 3

4 Legionella sp puede aparecer con un color blanco, gris o azul formando colonias mayores a 2mm de diámetro. También puede presentar un color marrón, rosa, verde, rojo o azul púrpura. Las placas que presenten este tipo de colonias pueden contener la bacteria, por ello se resiembran en agar BCYE y agar sangre y se dejan crecer 2 días a 36ºC. Si crecen en BCYE y no en agar sangre es legionella. Se siembra en BCYE sin cisterna y si es legionella no debe crecer. PREPARACIÓN Y CONTROL DE MEDIOS DE CULTIVO: Existen tres tipos de medios de cultivo: -Agar. -Fluido. -Caldo. Generalmente se utilizan medios deshidratados sensibles a la humedad, a la luz, al calor Cogemos un erlenmeyer y lo rotulamos con las siglas correspondientes al medio a preparar, pesamos en báscula de precisión y con una espátula echamos la cantidad de medio deshidratado indicada en el prospecto. Añadimos la mitad del agua destilada necesaria y agitamos. Con el resto de agua lavamos las paredes del recipiente y agitamos. Aplicamos calor, si es necesario, en agitación. 4

5 -Los caldos y soluciones nutritivas se preparan con agua precalentada. -Los agares medios fluidos hay que calentarlos. -El agar-agar hay que llevarlo a ebullición para que posteriormente solidifique. Si el medio tiene un ph =5 o menor es preferible no calentar sino es necesario. Se lleva a cabo una esterilización durante 15minutos a 121ºC en autoclave. Después plaqueamos en condiciones de esterilidad para obtener un control de ph y un control para incubación. Llevaremos a cabo un: CONTROL MACROSCÓPICO: Observamos el color, la transparencia, humedad, aparición de precipitados, presencia de gases en campana Durham. CONTROL DE ESTERILIDAD: Cultivamos a 37ºC durante 72horas y observamos aspecto, transparencia... Se comprueba la esterilidad por falta de crecimiento. CONTROL DE ph. -Líquido. 10ml del medio de cultivo en un vaso de precipitados, enfriamos y medimos el ph. 5

6 -Sólido. Medimos ph en placa petri con un electrodo de superficie. CONTROL DE EFICACIA: Se utilizan cepas de referencia. Hay que preparar el inóculo el día de antes de la siguiente forma: Debemos obtener un 0,5 de McFarland mediante la inoculación de colonias de una determinada cepa en agua de peptona. Se realiza una dilución hasta >1 y < ufc/ml. En criotubos: Obtenemos 0,5 de McFarland. Realizamos una dilución 1/100 de esta suspensión y de esta suspensión 1/10. Añadimos a cada tubo glicerol broth y 0,150ml de suspensión. Congelamos a -20ºC. DETECCIÓN DE RESIDUOS DE ANTIBIÓTICO Y SULFAMIDAS: TÉCNICA DE CRIBADO DE LAS CUATRO PLACAS: Se realiza en animales de abastos, piensos, aguas o huevos. Es un método microbiológico de difusión en agar. Las muestras se sitúan en placas con bacillus subtilis y micrococcus luteus inoculados en medios de cultivo a diferentes phs. El antibiótico inhibe el crecimiento de dichos microorganismos. Además ponemos discos con antibióticos en las diferentes placas que nos 6

7 servirán como control. Emplearemos bencilpenicilina, sulfamidina y estreptomicina como antibióticos para los discos control. MEDIOS DE CULTIVO: -Agar de ensayo para sustancias inhibitorias de ph6. -Agar de ensayo para sustancias inhibitorias de ph7,2. -Agar de ensayo para sustancias inhibitorias de ph8. MODO OPERATIVO: Según se trate de carnes, aguas, piensos utilizaremos un método u otro. Para carnes se extraen cilindros de la muestra congelada utilizando un sacabocados que posteriormente cortaremos en fracciones. Los piensos han de ser homogeneizados y cortados. Los huevos han de ser lavados con alcohol de 70º y algodón, después hay que homogeneizar la clara y la yema de varios huevos en stomacher y en un recipiente estéril se ponen en un baño a 70ºC durante 45minutos. Posteriormente se congelan. Las aguas no requieren ningún procesamiento. PROCEDIMIENTO: Para carnes y huevos pondremos 2 discos de muestra en posiciones opuestas en cada una de las cuatro placas. Para piensos y aguas se excavan en las placas pocillos de 8mm que serán rellenados con la muestra. 7

8 En el centro de cada placa pondremos un disco de papel con antibiótico. En ph 6 será bencilpenicilina, en ph7,2 sulfametazina y en ph8 estreptomicina. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: Comprobar la existencia de inhibición de crecimiento alrededor de las muestras. Los discos control deben de dar zonas de inhibición a su alrededor. El ph6 detecta tetraciclina y B-Lactámicos, ph7,2 sulfamidas y ph8 aminoglucósidos y macrólidos. USO DEL AUTOCLAVE COMO MÉTODO PARA ESTERILIZAR: En primer lugar debemos conectarlo, abrir la tapa superior, verificar que las válvulas de vapor y desagüe están cerradas, se llena con agua descalcificada y se introduce el material a esterilizar, nosotros lo envolvíamos en papel de aluminio y lo marcábamos con cinta de autoclavar. En caso de material limpio introducimos el datalogger en el autoclave, si es sucio introducimos un termómetro en un recipiente de vidrio. Es muy importante comprobar el nivel de agua, que ha de llegar a la rejilla, ya que sino alcanza este nivel puede quemarse la resistencia del autoclave. Cerramos la tapa y seleccionamos la temperatura de esterilización mediante el mando de manocontacto teniendo en 8

9 cuenta la presión. Seleccionamos la temperatura de esterilización girando el mando del temporizador. Para material sucio: 121ºC con una presión de 1Kg/cm2 durante 30minutos. Para material limpio: 121ºC con una presión de 1Kg/cm2 durante 15 minutos. El datalogger se utiliza para con posterioridad al proceso comprobar que la temperatura, tiempo y presión del proceso han sido correctos. Una vez al mes debe realizarse una limpieza y cambio de agua. En cada uso verificaremos la temperatura y tiempo del proceso. Mensualmente se realiza un control con esporas en dos puntos del autoclave. Anualmente se realiza una verificación del ciclo temperaturatiempo del autoclave. Para el cual se realizan: -Calibración de la sonda con la que se medirá la temperatura del ciclo del autoclave. -Verificación del cronómetro con el que se medirá el tiempo de autoclavado. -Verificación del temporizador del autoclave. -Estudio de la rampa de temperatura de un ciclo completo de autoclavado, así como estabilidad de la misma cuando llega a la temperatura de autoclavado y correcto funcionamiento del temporizador. 9

10 CONTROL DE LA CONTAMINACIÓN AMBIENTAL Y DE SUPERFICIE: El objetivo es conocer las condiciones higiénicas del laboratorio. Se va ha llevar a cabo un recuento de aerobios mesófilos en superficie y ambiente. Nos permite comprobar la eficacia de mátodos de limpieza y desinfección, ubicar las fuentes de contaminación, establecer una frecuencia adecuada de limpieza y desinfección para asegurar la calidad e integridad de los resultados de los análisis microbiológicos. Utilizaremos placas petri de PCA para el control ambiental y placas rodac de PCA para superficie. Se preparan tantas placas como puntos debamos controlar, estos puntos serán las zonas de trabajo y de depósito de las muestras, no se realiza en las campanas de flujo laminar y de seguridad biológica ya que tienen otros métodos de control. El control se debe realizar de forma mensual. CONTROL DE AMBIENTE: Sacamos las placas del frigorífico 10minutos antes para atemperar. Colocamos las placas de sedimentación de PCA previamente rotuladas con fecha y posición en cada uno de los puntos indicados. Abrimos la tapa y la dejamos boca abajo apoyada sobre el borde de la placa sin que cubra el medio de cultivo. 10

11 Tras el tiempo de exposición se cierran las placas y se incuban en posición invertida en estufa de 30ºC durante 72horas. El tiempo de exposición suele ser de 15minutos. Tras el periodo de incubación se realiza un recuento de colonias. CONTROL DE SUPERFICIE: Sacamos 10minutos antes las placas para atemperar. Consignamos en la tapa de las placas rodac los datos de identificación. Abrimos la tapa y aplicamos el agar directamente sobre la superficie seca a testar durante unos 10segundos. Cerramos la placa e incubamos en posición invertida en estufa de 30ºC durante 72horas. Realizamos el recuento de colonias. Si el número de colonias supera unos límites previamente establecidos se debe llevar a cabo un proceso de descontaminación. CONCLUSIÓN: Estos procedimientos son los que principalmente he realizado durante los tres meses de prácticas en el laboratorio de microbiología, he aprendido no solo como llevarlos a cabo sino también el porqué de la utilización del procedimiento. También he podido observar y conocer el procedimiento de otros métodos de análisis como por ejemplo el recuento de aerobios mesófilos en aguas, recuento de mohos y levaduras en alimentación, recuento de enterobacterias en alimentación, recuento de 11

12 Staphylococcus aureus en alimentos, como se preparan las muestras para análisis microbiológicos, como preparar diluciones decimales, presencia de corticosteroides mediante técnica Elisa También he podido comprender porque se debe utilizar un medio de cultivo para detectar un determinado microorganismo y no otro, que medio de cultivo es el más adecuado para realizar un recuento de un microorganismo y cual es el indicado para detectar su presencia o ausencia, como se debe preparar correctamente cada medio de cultivo 12

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