UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS UNIDAD DIDACTICA DE INMUNOLOGIA Y MICROBIOLOGIA TERCER AÑO

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1 UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS UNIDAD DIDACTICA DE INMUNOLOGIA Y MICROBIOLOGIA TERCER AÑO ACTIVIDAD PRACTICA NO. 15 METODOS DIAGNOSTICOS DE HEPATITIS Dr. Fernando Mérida INTRODUCCION Para el diagnóstico de las enfermedades, el médico debe tomar en consideración el patrón epidemiológico de la enfermedad, así como sus síntomas y signos es decir lo que el paciente presenta en la historia clínica, como en la mayoría de las enfermedades den las hepatitis los datos del laboratorio pueden ser útiles para confirmar el diagnóstico. En las hepatitis, se puede confirmar el diagnóstico con la búsqueda de los agentes infectivos directamente o por la respuesta que estimula la presencia del virus en el hospedero. Para el primer parámetro o aspecto se utiliza, la microscopía electrónica, en la búsqueda del antígeno viral, ya sea el virus completo o la detección de ácidos nucleares, así mismo se utilizan técnicas especiales, por ejemplo ELISA. Hemaglutinación, inmunocromatografía en membrana, Western Blot y PCR, la mayoría de los cuales por su alto costo solo los realizan laboratorios de referencia. En forma indirecta el diagnóstico se puede realizar por medio de la determinación de anticuerpos, como ensayos inmunoenzimaticos y la inhibición de la hemaglutinación. Así mismo el diagnóstico anatomo-patológico es de gran ayuda. Objetivo General Esta práctica tiene como objetivo general que el estimulante conozca los aspectos más importantes relacionados con la hepatitis y los métodos más utilizados en nuestro medio para la detección de antígenos y anticuerpos contra la hepatitis. Objetivos específicos Conocer las pruebas de Inmunocromatografía en Membrana que se utilizan en Hepatitis B (antígenos virales y anticuerpos virales) Conocer las pruebas de ELISA en microplaca que se utilizan en la determinación de anticuerpos contra el virus de la Hepatitis A. Conocer las técnicas de PCR y electroforesis en gel

2 Materiales proporcionados por el laboratorio a. Cassettes de prueba rápida en combo para detección de marcadores serológicos de Hepatitis B b. Microplaca de ELISA con reacciones positivas y negativas para anticuerpos contra el virus de la Hepatitis A c. Gel de Agarosa con bandas de ARN virales, teñidas con bromuro de etidio. d. Transiluminador con luz ultravioleta, con pantalla bloqueadora de rayos UV. Fundamentos: Detección de Antígenos y Anticuerpos mediante la técnica de Inmunocromatografía en Membrana (Pruebas rápidas) En estas pruebas se procede a formar un complejo antígeno anticuerpo (específico) los cuales se diseminan en un papel filtro y reacción con un marcador cromógenico, reacción que se observa sin ningún aparato, son sencillas (2 pasos), baratas y rápidas (menos de 20 minutos). Prueba rápida en combo (panel) para identificación de marcadores de Hepatitis B en suero. Esta es una prueba de un solo paso que detecta simultáneamente la presencia de dos antígenos del Virus de la Hepatitis B y de tres anticuerpos contra sus respectivos antígenos. Detección de antígenos: La membrana dentro del cassette está impregnada de una mezcla compuesta de oro coloidal u otra sustancia unida a anticuerpos, contra el antígeno de superficie (anti-hbs) y contra el antígeno e (anti-hbe) en carriles separados. Si en el suero se encuentran dichos antígenos virales, estos se unirán al complejo anticuerpo-oro y migran por capilaridad hacia una zona T, en donde se encontrara otro anticuerpo. También específico para los antígenos uniéndose este al complejo anterior por los antígenos virales precipitándose formando una banda cuando no existe antígenos, el anticuerpo conjugado reaccionara con un anticuerpo especifico contra él y se depositara en una banda de control (véase Fig-1) Detección de anticuerpos: Para la detección de anticuerpos Anti-HBs, la membrana contiene oro coloidal y otra sustancia unida a antígenos de superficie, si el paciente tiene anticuerpos, estos se difunden reaccionando con os antígenos de superficie unidas con el oro, formando complejos, difundiéndose hacia la zona denominada T en donde se encuentran anticuerpos anti-anticuerpo observándose precipitación por una banda de color

3 Detección de Anticuerpos Anti-HBc y Anti-HBe En este caso la reacción, se basa en un principio de unión competitivo. Por lo tanto se interpreta como resultado positivo cuando NO se forma la banda de color. Detección de Antígenos y Anticuerpos mediante la técnica de ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a enzimas) La técnica de ELISA combina la especificidad de la unión antígeno-anticuerpo con la sensibilidad de los análisis enzimáticos. Son pruebas en las que se inmovilizan ya sea un antígeno o anticuerpo en superficies sólidas (microplacas de poliestireno). Se realizan en varios procesos. Primeramanete se pega el antígeno contra el que se va a estudias. Luego se aplica la secreción plasma del paciente que contiene el anticuerpo, luego se procede a aplicar un conjugado (anticuerpo ligado a una enzima) que reaccionaria específicamente al anticuerpo estudaindo, luego se aplicaría el sustrato de la enzima del conjugado (véase pasos en fig. 2) Lecturas obligatorias: Murray Patrick. Microbiología 7ma edición, capitulo 63 Referencias Dra. Velez Möller, Patricia. Practica de laboratorio de virus. Facultad de Ciencias Médicas USAC documento 2008 Dra. Villagrán de Tercero. Carmen. Video técnicas de diagnóstico viral por PCR. Agosto 2012 GUIA DE TRABAJO Y ESTUDIO: ACTIVIDAD PRACTICA DE HEPATITIS El estudiante con su grupo debe de completar los datos que se le solicitan en los siguientes cuadros: 1. Indique las características principales de los virus de las hepatitis Virus Familia Genoma Transmisión Evolución Complicaciones A B C D E F 2. Explique la fisiopatología de los siguientes síntomas de las hepatitis a. Fiebre b. Exantema

4 c. Orina oscura d. Anorexia e. Dolor en cuadrante superior derecho f. Prurito g. Elevación de transaminasas h. Elevación de las fosfatasas. 3. Tomando como base la figura de su libro de texto complete el cuadro haciendo las curvas que presentan los procesos serológicos en la evolución de la Hepatitis B aguda Interpretación de marcadores serológicos de la infección por virus de la Hepatitis B Ictericia Síntomas Diseminación del virus HBsAg HBeAg Anti-HBs Anti-HBc Anti-HBe Enzimas hepáticas 1 mes 2 meses 3 meses 4 meses 5 meses 6 meses 12 meses 24 meses 4. Indique como se encuentran los marcadores serológicos de la Hepatitis B en las siguientes fases ESTADO PATOLOGICO ESTADO SANO Marcador Aguda Crónica Tardía aguda Anti-HBc Anti-HBe Anti-HBs HBeAg HBsAg Curado vacunado 5. El estudiante debe leer los casos clínicos que aparecen en su libro de texto (página 596) y responda las interrogantes

5 PROCEDIMIENTOS A REALIZAR Identificación directa e indirecta viral A. Pruebas rápidas para detección de antígenos virales y anticuerpos contra virus de la hepatitis B Observar las reacciones de las diferentes pruebas rápidas que se presentan, discutir la interpretación y la utilidad en el diagnóstico. B. Microplaca de Elisa para detección de anticuerpos contravirus Observar las reacciones en los diferentes pozos de la microplaca de ELISA que se presenta, discutir la técnica de realización e interpretar resultados. C. Gel de Agarosa con ADN amplificado (Virus de la hepatitis B) por PCR para deteccipon de ácido nucleico viral Observar el gel de Agarosa que se presenta, discutir la técnica de realización, interpretar resultados. Lecturas obligadas: 1. Murray, Patrick. Microbiología 7ª edición capítulo 63