PCR Punto de No Retorno de la Biología Molecular

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1 TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR CURSO DE BIOTECNOLOGÍA ELEMENTAL Biotechnology Explorer Julio 2012 PCR Punto de No Retorno de la Biología Molecular Qué es un gen Técnicas de aislamiento y estudio de los genes La PCR como técnica alternativa Aplicaciones adicionales de la PCR La nueva generación de la Genómica Ricardo Ramos Ruiz Unidad de Genómica, Cantoblanco Parque Científico de Madrid TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR BIOTECNOLOGÍA BASADA EN LAS TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR Qué es un gen Técnicas de aislamiento y estudio de los genes La PCR como técnica alternativa Aplicaciones adicionales de la PCR La nueva generación de la Genómica Genoma DESCODIFICADA CODIFICADA Proteína: función celular l UNIDAD GENÉTICA: UN GEN (UN GEN ---UNA FUNCIÓN) 1

2 GENOMICS las tres funciones esenciales de los ácidos nucleicos Finalidad: <<The study of genes and their function>> 1. REPLICACIÓN PERPETUACIÓN DNA paterno DNA hijo 2. TRANSCRIPCIÓN 3. TRADUCCIÓN EXPRESIÓN GÉNICA Cells organize their genetic material in genes that can be investigated at the molecular level DNA GENÓMICO RNA intermediario proteína transcripción traducción ESTRUCTURA DEL DNA: Bases nitrogenadas A number of 20,000 genes is estimated in humans Most cells are supposed to actively express some thousands 2

3 DNA: Enlaces de hidrógeno HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DNA: Enlaces de hidrógeno DNA: Doble hélice G C A T C G T A HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS LA ESTRUCTURA DETERMINA LA FUNCIÓN 3

4 LA HIBRIDACIÓN / DESNATURALIZACIÓN ES UN PRCESO REVERSIBLE Factores que afectan la eficacia de hibridación: Longitud de bases (tramo que se aparea) Temperatura Presencia de mismatches Porcentaje de G-C Especificidad / Eficaciai HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR Qué es un gen Cómo describimos un gen Técnicas de aislamiento y estudio de los genes La PCR como técnica alternativa Aplicaciones adicionales de la PCR La nueva generación de la Genómica CARACTERIZACIÓN DE UN GEN 1. LOCALIZACIÓN DENTRO DEL GENOMA 2. DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA 3. CONOCIMIENTO DE LOS ELEMENTOS REGULADORES 4. PERFIL DE EXPRESIÓN GÉNICA 5. GENES REGULADORES, GENES ASOCIADOS, GENES RELACIONADOS 6. VARIANTES PRESENTES EN LA POBLACIÓN 7. VARIANTES ASOCIADAS A ENFERMEDAD 4

5 17/07/2012 CÓMO SE CARACTERIZA UN GEN CÓMO SE AISLA UN GEN AISAMIENTO DEL RESTO DEL GENOMA PURIFICACIÓN PERPETUACIÓN (COPIAR, CRECER, MANTENER) RECORTAR NUCLEÓTIDOS PURIFICAR PERPETUAR (COPIAR, CRECER, MANTENER) GENOMA HUMANO: 3x 10 9 GEN (DNA): ~ 10 5 GEN (RNA): ~ 10 3 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (endonucleasas) ORIGEN BIOLÓGICO DE LAS ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN 4 6 = 4096 PROMEDIO DE APARICIÓN DE UNA SECUENCIA CUALQUIERA DE HEXANUCLEÓTIDOS TRANSFORMACIÓN BACTERIANA CON DNA EXÓGENO procedente de otra bacteria o de un origen distinto 5

6 17/07/2012 MAPAS DE RESTRICCIÓN LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DEFIENDEN A LAS BACTERIAS DE UN ATAQUE EXCESIVO DE DNA EXÓGENO = CÓMO SE CARACTERIZA UN GEN LOS DOS COMPONENTES DEL CLONAJE AISAMIENTO DEL RESTO DEL GENOMA PURIFICACIÓN PERPETUACIÓN (COPIAR, CRECER, MANTENER) Fragmentos (específicos) Vector (No específico) PLÁSMIDOS OBTENCIÓN DE UN CLON (UNA COLONIA) DE BACTERIAS TRANSFORMADAS (HAN INTEGRADO) DNA EXÓGENO ( RECOMBINANTES ) OTROS VECTORES: virus, YACs 6

7 SELECCIÓN DE UN CLON RECOMBINANTE MEDIANTE HIBRIDACIÓN COLONIA POSITIVAS : Crecen en Amp Blancas en X-Gal Positivas para una sonda específica Selección de clones positivos CARACTERÍSTICAS DEL CLONAJE DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR Algunos resultados ESTABLE AUTOPERPETUACIÓN DNA VIAJA DENTRO DE OTRO DNA REQUIERE PURIFICACIÓN MATERIAL BIOLÓGICO 7

8 TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR Qué es un gen Cómo describimos un gen Técnicas de aislamiento y estudio de los genes La PCR como técnica alternativa Aplicaciones adicionales de la PCR La nueva generación de la Genómica UNA ALTERNATIVA AL CLONAJE DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN PCR 8

9 LA PCR ES UNA COPIA DEL MECANISMO NATURAL DE REPLICACIÓN (POLIMERIZACIÓN DE NUCLEÓTIDOS COPIANDO UN MOLDE) Semiconservativa: cada cadena sirve de molde La incorporación se basa en la complementariedad de bases Elongación a partir de un cebador Síntesis en condiciones de fidelidad (reparación de errores) Baja especificidad (nulo efecto de secuencia ni organismo) enzima (catalizador): polimerasa termoestable 9

10 10

11 11

12 Cómo funciona la PCR? OLIGOS, PRIMERS, CEBADORES cada producto es molde de la siguiente reacción MÁXIMA SENSIBILIDAD DIDEOXINUCLEOTIDOS COMPARACIÓN PCR - CLONAJE ESTABLE AUTOPERPETUACIÓN DNA VIAJA DENTRO DE OTRO DNA: REQUIERE PURIFICACIÓN MATERIAL BIOLÓGICO NO REQUIERE PURIFICACIÓN SENSIBILIDAD EXCEPCIONAL NO SE AUTOPERPETÚA SUJETO A ERRORES DE COPIA REACCIÓN IN VITRO 12

13 LA PCR RESUELVE EL PROBLEMA DE ENCONTRAR UNA AGUJA EN UN PAJAR: MILES DE MILLONES DE AGUJAS SE LOCALIZAN CON FACILIDAD PRINCIPALES APLICACIONES Técnicas preparativas: Clonaje de fragmentos, reacciones de secuenciación Técnicas analíticas: Detección de patógenos Colonias positivas en un clonaje Cuantificación génica REQUISITOS PREVIOS Conocimiento previo de secuencia LIMITADO HOMOLOGÍA con otras especies VENTAJAS Amplificación hasta millones de veces: producto ciclo n = sustrato ciclo n+1 Sensibilidad d desde 1 copia Automatización por cambios de temperatura enzimas termoestables Sencillez: componentes: buffer, primers molde, dntps Modificable por: composición de primers, aditivos del buffer, polimerasa, temperatura Estandarización componentes controlados Adaptable a múltiples necesidades (hot start, XL-PCR nucleótidos modificados...) INCONVENIENTES Introducción de errores que quedan fijados producto ciclo n = sustrato ciclo n+1 Sensibilidad d desde 1 copia, también detecta contaminantes Limitaciones inherentes a la reacción de polimerización longitud, agotamiento, reparación de errores Sistema in vitro No es ilimitada a pesar de los cuales se ha transformado en la técnica de elección para clonar fragmentos, detectar variantes, buscar positivos TÉCNICAS AVANZADAS BASADAS EN PCR 13

14 Reacción exponencial PCR a tiempo real 96-replicate - Real Time PCR experiment Finalización: Agotamiento de reactivos (oligos,dntps) Inhibición por producto Competición de los productos amplificados con los primers Normalized Reporter signal PCR-Q Number of cycles END POINT + +/- - SEQUENCING: Revealing the primary structure of DNA Sanger sequencing on 1,000 base pairs C G T G T [A/G] T C C C T Perfiles de expresión asociados a procesos biológicos patient #28 patient #21 patient #202 [G/G] [A/G] [A/A] 14

15 MÚLTIPLES APLICACIONES DE SECUENCIACIÓN: SE DEFINE REGIÓN DE INTERÉS PERO NO SE RESTRINGE SU LOCALIZACIÓN Identify contaminant bacteria or fungi TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR Qué es un gen Cómo describimos un gen Técnicas de aislamiento y estudio de los genes La PCR como técnica alternativa Aplicaciones adicionales de la PCR La nueva generación de la Genómica La nueva Generación de la genómica NGS or MASIVE PARALLEL SEQUENCING consists in ultra high throughput sequencing of whole genomes BasedonPCR amplification PREPARACIÓN DE GENOTECAS SIN ETAPA DE CLONAJE EN BACTERIAS Demanding high capacities in DNA or cdna library preps Enrichment Computing Offering: No previous knowlwdge No matter how complex > 1 Gb per day Binding to primer specific beads or to primer bound surfaces 15

16 RESULTADO: LECTURA DE ALTÍSIMA PRODUCTIVIDAD (HASTA 4 Gb al DÍA) DOS EJEMPLOS CANCER ATLAS READ ASSEMBLY GENOMES MEDICINA PERSONALIZADA GENOME SEQUENCING Gracias por vuestra atención! Clinical application: Acceso al genoma individual al alcance de la mano = LA VERDADERA MEDICINA PERSONALIZADA 16

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