en plasma es un enfoque valioso para estudiar la heterogeneidad

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1 Clinical Chemistry 59: (2013) Diagnóstico del cáncer Exploración del genoma de cáncer en plasma: Detección de los tumores asociados a las aberraciones del número de copias, variantes de nucleótido único y heterogeneidad tumoral mediante la secuenciación masiva en paralelo K.C. Allen Chan, 1,2,3 Peiyong Jiang, 1,2 Yama W.L. Zheng, 1,2 Gary J.W. Liao, 1,2 Hao Sun, 1,2 John Wong, 4 Shing Shun N. Siu, 5 Wing C. Chan, 6 Stephen L. Chan, 3,7 Anthony T.C. Chan, 3,7 Paul B.S. Lai, 4 Rossa W.K. Chiu, 1,2 y Y.M.D. Lo 1,2,3* ANTECEDENTES: El ADN de origen tumoral puede encontrarse en el plasma de pacientes con cáncer. En este estudio, investigamos el uso de una secuenciación shotgun masiva en paralelo (MPS) de ADN en plasma de pacientes con cáncer para examinar un genoma de cáncer no invasivo. MÉTODOS: Se incorporaron cuatro pacientes con carcinoma hepatocelular y una paciente con cáncer sincrónico de mama y ovarios. Se extrajo el ADN de los tejidos tumorales y se analizaron las muestras de plasma anteriores y posteriores a la operación de esos pacientes mediante MPS shotgun. RESULTADOS: Logramos obtener el perfil genómico de las aberraciones del número de copias y mutaciones puntuales en el plasma de pacientes con cáncer. Al detectar y cuantificar las mutaciones puntuales y la pérdida alélica agregadas del genoma, determinamos las concentraciones fraccionales de ADN de origen tumoral en plasma y correlacionamos estos valores con el tamaño del tumor y el tratamiento quirúrgico. También demostramos la utilidad potencial de este enfoque para el análisis de escenarios oncológicos complejos al estudiar al paciente con dos tipos de cáncer sincrónico. A través del uso de secuenciación multiregional de tejidos tumorales y de secuenciación shotgun de ADN en plasma, hemos mostrado que la secuenciación de ADN en plasma es un enfoque valioso para estudiar la heterogeneidad tumoral. CONCLUSIONES: La secuenciación shotgun de ADN en plasma es una herramienta potencialmente poderosa para la detección, el control y la investigación del cáncer American Association for Clinical Chemistry La presencia de ADN de origen tumoral en el plasma de pacientes con cáncer ofrece magníficas oportunidades para la detección y el control del cáncer (1, 2 ). De hecho, se han encontrado alteraciones de microsatélite asociadas con el cáncer (3, 4 ), mutaciones genéticas (5 9 ), cambios de metilación de ADN (10, 11 ) y los ácidos nucleicos virales (12 ) en el plasma de pacientes con distintos tipos de cáncer. La mayoría de los trabajos anteriormente publicados sobre ADN en plasma como un marcador del cáncer se han enfocado en la detección de objetivos moleculares específicos y predeterminados conocidos por su asociación con el cáncer por medio de métodos tales como PCR (3, 4, 12 ), PCR digital (5 7 ) y ensayos de ligadura digitales (9 ). Con la llegada de la secuenciación masiva en paralelo (MPS), 8 diversos grupos han incorporado este enfoque para desarrollar nuevos marcadores de cáncer basados en ADN de 1 Li Ka Shing Institute of Health Sciences; 2 Departamento de Patología Química; 3 State Key Laboratory in Oncology en China del Sur, Sir Y.K. Pao Centre for Cancer; 4 Departamento de Cirugía, y; 5 Departamento de Obstetricia y Ginecología, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, Shatin, Nuevos Territorios, RAE de Hong Kong, China; 6 Departamento de Cirugía, North District Hospital, Sheung Shui, Nuevos Territorios, RAE de Hong Kong, China; 7 Departamento de Oncología Clínica, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, Shatin, Nuevos Territorios, RAE de Hong Kong, China. * Dirigir correspondencia para estos autores a: Department of Chemical Pathology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, Ngan Shing St., Shatin, New Territories, Hong Kong SAR. Fax ; correo electrónico: loym@cuhk.edu.hk. Recibido para la publicación el 6 de septiembre de Aceptado para la publicación el 27 de septiembre de Previously published online at DOI: /clinchem Abreviaturas no estándar: MPS, secuenciación masiva en paralelo (massively parallel sequencing); HCC, carcinoma hepatocelular (hepatocellular carcinoma); SOAP2, programa de alineamiento de oligonucleótidos corto 2 (Short Oligonucleotide Alignment Program 2); SNP, polimorfismo de nucleótido único (singlenucleotide polymorphism); LOH, pérdida de heterocigosidad (loss of heterozygosity); LOESS, suavizado por ponderación local del gráfico de registros (locally weighted scatterplot smoothing); SNV, variantes de nucleótido único (single nucleotide variant); GAAL, pérdida alélica agregada de genotipo (genomewide aggregated allelic loss). 211

2 plasma. Uno de los enfoques consiste en usar la MPS en las muestras del tumor para identificar primero los reajustes que pueden detectarse posteriormente en el plasma (13, 14 ). Otro enfoque está basado en el uso de la secuenciación de amplicones dirigida para buscar las mutaciones de genes que se encuentran comúnmente en el cáncer (8 ). Debido a su naturaleza específica, los enfoques definidos anteriormente pueden brindar solo una mirada parcial del genoma del tumor en el plasma de pacientes con cáncer. Para obtener una vista genómica completa del genoma del tumor en la circulación, sería conveniente un enfoque de secuenciación aleatoria no dirigida (o shotgun). En este sentido, ha habido grandes avances en el campo del diagnóstico prenatal no invasivo gracias a los resultados obtenidos con MPS shotgun de ADN a partir del plasma de mujeres embarazadas (15 ). Este enfoque ha permitido la detección no invasiva de aneuploidías cromosómicas fetales (16 18 ) y la exploración genómica fetal (19, 20 ). En el presente artículo, informamos acerca del uso de MPS shotgun para obtener una vista genómica no invasiva de las variaciones en el número de copias asociadas con cáncer y mutaciones en el ADN en plasma. También hemos intentado demostrar el uso de este enfoque para esclarecer las características tumorales importantes, con la heterogeneidad tumoral usada como ejemplo. Materiales y métodos OBTENCIÓN DE MUESTRAS Se seleccionaron pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC) y portadores de hepatitis B crónica del Departamento de Cirugía y del Departamento de Medicina y Terapia, respectivamente, del hospital Prince of Wales Hospital, Hong Kong, y se obtuvieron los consentimientos informados y la aprobación de la junta institucional de revisión. Todos los pacientes con HCC presentaban la enfermedad en la etapa A1 conforme al sistema Barcelona Clinic Liver Cancer. El consentimiento informado se obtuvo después de haber explicado la naturaleza y las posibles consecuencias de los estudios. La paciente con cáncer sincrónico de mama y ovarios se seleccionó del Departamento de Oncología Clínica del hospital Prince of Wales Hospital. Las muestras de sangre periférica de todos los participantes se extrajeron en tubos colectores de EDTA. Los tejidos tumorales de los pacientes con HCC se obtuvieron durante las cirugías de resección de cáncer. PROCESAMIENTO DE LA SANGRE Las muestras de sangre periférica se centrifugaron a 1600 g durante 10 minutos a 4 C. La porción de plasma se volvió a centrifugar a g durante 10 minutos a 4 C y luego se realizó el almacenamiento a 80 C. Las moléculas de ADN de células libres de 4.8 ml de plasma se extrajeron de acuerdo con el protocolo sangre y líquido corporal del kit QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit (Qiagen). El ADN en plasma se concentró mediante SpeedVac Concentrator (Savant DNA120; Thermo Scientific) en un volumen final de 40- L por caso para la preparación posterior de la genoteca de secuenciación de ADN. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO El ADN genómico se obtuvo de las muestras de capa leucocitaria de los pacientes de acuerdo con el protocolo de sangre y líquido corporal del kit QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. El ADN se obtuvo de los tejidos tumorales con el QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). SECUENCIACIÓN DEL ADN Las genotecas de secuenciación de las muestras de ADN genómico se realizaron con el Kit de preparación de muestras de extremos emparejados (Illumina) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, en primer lugar, se cizalló 1 5 g de ADN genómico con un ultrasonicador centrado Covaris S220 en fragmentos de 200-bp. Después, se volvieron a emparejar los extremos de las moléculas de ADN con ADN polimerasa T 4 y polimerasa Klenow; luego se utilizó T 4 polinucleótido quinasa para fosforilar los extremos de 5. Se creó un saliente de 3 con un fragmento Klenow deficiente de exonucleasa de 3 a5. Los oligonucleótidos del adaptador Illumina se ligaron con los extremos pegajosos. El ADN ligado al adaptador se enriqueció con PCR de 12 ciclos. Debido a que las moléculas de ADN en plasma fueron fragmentos pequeños(21 ) y las cantidades del ADN total en las muestras de plasma fueron relativamente pequeñas, omitimos los pasos de fragmentación y usamos una PCR de 15 ciclos al crear las genotecas de ADN de las muestras de plasma. Se utilizó un Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies) para comprobar la calidad y el tamaño de las genotecas de ADN ligado al adaptador. Las genotecas de ADN se midieron luego con un Kit de cuantificación de genotecas KAPA (KAPA Library Quantification Kit, Kapa Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La genoteca de ADN se diluyó e hibridó a las células del flujo de secuenciación de extremos emparejados. Los grupos de ADN se generaron sobre un sistema de generación de grupos cbot (Illumina) con el kit v2 de generación de grupos TruSeq PE (TruSeq PE Cluster Generation Kit v2, Illumina), seguido por 51 2 ciclos o76 2 ciclos de secuenciación sobre un sistema HiSeq 2000 (Illumina) con el kit TruSeq SBS Kit v2 (Illumina). 212 Clinical Chemistry 59:1 (2013)

3 Genoma del cáncer detectado en plasma FILTRACIÓN Y ALINEACIÓN DE SECUENCIAS Los datos de secuenciación de extremos emparejados se analizaron mediante el Programa de alineamiento de oligonucleótidos corto 2 (SOAP2) (Short Oligonucleotide Alignment Program 2) en el modo de extremos emparejados (22 ). Para cada lectura de extremos emparejados, se alinearon 50 bp o 75 bp de cada extremo al genoma humano de referencia de enmascaramiento sin repetición (Hg18). Se permitieron hasta 2 emparejamientos incorrectos de nucleótidos para la alineación de cada extremo. Luego, se analizaron las coordenadas genómicas de estas alineaciones posibles de los 2 extremos para determinar si alguna combinación permitiría la alineación de los 2 extremos al mismo cromosoma con la orientación correcta, que abarque un tamaño de inserción 600 bp y que se equipare a única locación en el genoma humano de referencia. Las lecturas duplicadas se definieron como lecturas de extremos emparejados en las cuales la molécula de ADN de inserción demostró idénticas ubicaciones de inicio y finalización en el genoma humano; las lecturas duplicadas se eliminaron como se describió anteriormente (19 ). ANÁLISIS DE MICROMATRIZ Se determinó el genotipo del ADN extraído de la capa leucocitaria y los tejidos tumorales de los pacientes con HCC con el sistema Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0, como se describió anteriormente (23 ). Los datos de micromatriz se procesaron con la consola de genotipificación de Affymetrix (Affymetrix Genotyping Console) versión 4.1. Se realizó el análisis de genotipificación y la invocación de polimorfismo de nucleótido único (SNP) con el algoritmo Birdseed v2, como se describió anteriormente (24 ). Se usaron los datos de genotipificación de la capa leucocitaria y los tejidos tumorales para identificar las regiones de pérdida de heterocigosidad (LOH) y para realizar el análisis de número de copias. El análisis de número de copias se realizó mediante la consola de genotipificación con parámetros predeterminados de Affymetrix y con un tamaño de segmento genómico mínimo de 100 bp y un mínimo de 5 marcadores genéticos dentro del segmento. Las regiones con LOH se identificaron como regiones con 1 copia en el tejido tumoral y 2 copias en la capa leucocitaria, y los SNP dentro de estas regiones eran heterocigotos en la capa leucocitaria pero homocigóticos en el tejido tumoral. Para una región genómica que presenta LOH en un tejido tumoral, los alelos de SNP que estuvieron presentes en la capa leucocitaria pero ausentes, o en intensidad reducida, en los tejidos tumorales se consideraron como los alelos en el segmento eliminado de la región cromosómica. Los alelos que estuvieron presentes en la capa leucocitaria y el tejido tumoral se consideraron derivados del segmento no eliminado de la región cromosómica. ANÁLISIS DE HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVO DE MATRICES Las muestras de ADN obtenidas de la capa leucocitaria y los tejidos tumorales de los pacientes con HCC se analizaron con el kit de microensayo humano de alta resolución G3 SurePrint (SurePrint G3 Human High Resolution Microarray Kit, Agilent) como se describió anteriormente (25 ). Se analizaron los datos de hibridación genómica comparativa de matrices para los pacientes con HCC a fin de obtener la variación en el número de copias con Partek Genomics Suite. En pocas palabras, las intensidades primarias de la sonda se ajustaron de acuerdo con el contenido de GC de la secuencia. Este ajuste estuvo seguido por la normalización al nivel de sonda de la intensidad de la señal durante el ajuste simultáneo de la longitud del fragmento y las secuencias de sonda a través de todas las muestras. Se detectaron las ganancias y pérdidas del número de copias al aplicar los parámetros predeterminados del algoritmo de segmentación genómica Genomic Segmentation disponible en Partek Genomics Suite versión 6.5 para obtener las diferentes particiones del estado del número de copias. DETECCIÓN DE ABERRACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS EN LAS MUESTRAS DEL TEJIDO TUMORAL MEDIANTE SECUENCIACIÓN Para investigar las aberraciones del número de copias genómicas (p. ej., ganancias y pérdidas del número de copias), dividimos el genoma en segmentos de igual tamaño (1 Mb por ventana/recipiente) y llevamos la cuenta del número de asignación de lecturas de secuencia para cada recipiente. Debido a la presencia de los sesgos de secuenciación dependientes de GC con tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (26 ), usamos un método de corrección estadística, suavizado por ponderación local del gráfico de registros (LOESS), para corregir el sesgo asociado con GC (27 ). En este método, se calcula un factor de corrección para cada recipiente de acuerdo con el modelo de regresión LOESS, como se describió anteriormente (28 ). Luego, los recuentos de lecturas de cada recipiente se ajustaron con el factor de corrección específico según el recipiente y se normalizó con los recuentos de lectura mediana de todos los recipientes. Después de la corrección de GC, se calculó una proporción de los recuentos de lectura ajustados del tumor en relación con aquellos de la capa leucocitaria mediante la siguiente ecuación: R A tumor A BC, Clinical Chemistry 59:1 (2013) 213

4 donde A tumor representa los recuentos de lectura con ajuste de GC normalizado del tejido tumoral y A BC constituye los recuentos de lectura con ajuste de GC normalizado de la capa leucocitaria. Luego, elaboramos una distribución de frecuencia de log 2 (R) para todos los recipientes. Este lote de distribución se usó para estimar la proporción de las células tumorales (F) en el tejido tumoral que demostró una distribución particular del número de copias y, posteriormente, el cambio del número de copias en cada recipiente. En el lote de distribución de frecuencia, se identificó un pico central en el cual R es aproximadamente igual a 1 [es decir, log 2 (R) 0]; este pico representa las regiones genómicas sin las aberraciones del número de copias. Luego, se identificaron los picos que se ubican a la izquierda y derecha del pico central. Estos picos representaron regiones con una pérdida de 1 copia y una ganancia de 1 copia, respectivamente. Las distancias de los picos de la izquierda y la derecha desde el pico central se usaron para determinar la proporción de las células tumorales (F) en el tejido tumoral, de acuerdo con la siguiente ecuación: F R right R left, donde R right es el valor R del pico derecho y R left es el valor de R del pico izquierdo. Luego, los valores del cambio de valores del número de copias (CN) para todos los recipientes de 1-Mb se calcularon con la siguiente ecuación: CN R bin R cen 0.5 F, donde R bin es el valor de R del recipiente y R cen es el valor de R del pico central. DETECCIÓN DE ABERRACIONES DEL NÚMERO DE COPIAS EN PLASMA Analizamos la representación genómica del ADN en plasma para diferentes regiones genómicas. Primero, se dividió el genoma completo en ventanas de 1-Mb, similar al análisis de aberraciones del número de copias en los tejidos tumorales. Luego se determinó el recuento de lectura con corrección de GC (como se describe anteriormente) para cada ventana de 1-Mb. Se usó una estadística de puntuación z para determinar si la representación de ADN en plasma en una ventana de 1-Mb se aumentaría o reduciría significativamente al compararse con el grupo de referencia. El grupo de referencia incluyó muestras de plasma de 16 individuos de control sanos. En el estudio actual, los recuentos de lectura con corrección de GC de cada recipiente de 1-Mb se normalizaron conforme a los recuentos de lecturas con corrección de GC medianas de todos los recipientes de la muestra. La representación de ADN en plasma normalizado se comparó luego con los datos de los controles. A continuación, se calculó una puntuación z para cada ventana de 1-Mb mediante el uso de la media y SD de los controles. Las regiones con puntuaciones z 3 y 3 se consideraron significativamente por debajo y por encima de la representación, respectivamente. NÚMERO DE MOLÉCULAS NECESARIAS PARA IDENTIFICAR ABERRACIONES DEL NÚMERO DE COPIAS EN PLASMA Para el análisis de aberración de número de copias, la sensibilidad y especificidad de la detección de las aberraciones en el número de copias en plasma relacionada con el tumor se determinaron mediante la precisión en la medición de la representación del ADN en plasma en una región cromosómica y la concentración fraccional del ADN de origen tumoral en el pasma del paciente con cáncer. La precisión en la medición de la representación del ADN en plasma a su vez se vio afectada por el número de moléculas de ADN en plasma analizadas. En relación con esto, realizamos análisis de simulación para determinar la relación entre el número de moléculas de ADN en plasma necesarias para el análisis y la concentración fraccional del ADN de origen tumoral en el plasma para poder lograr una sensibilidad de 95% para la detección de las aberraciones en el número de copias relacionadas con el tumor. Se realizaron simulaciones de computadora para escenarios en los cuales la región afectada tuvo un cambio de número de copias de 1, 1, y 2 y para concentraciones fraccionales del ADN de origen tumoral en un rango del 1% al 50%. En cada análisis de simulación, el genoma completo se dividió en 3000 recipientes. Este número fue similar al que usamos en el análisis experimental real cuando se usó una resolución de 1-Mb. Asumimos que el 10% de los recipientes exhibiría aberraciones cromosómicas en el tejido tumoral. En el tejido tumoral, la fracción esperada (P) de las moléculas totales que recaen en un recipiente dentro una región afectada sería: P 2 CN % CN, donde CN es el cambio de número de copias. A partir de esta información, calculamos el cambio esperado en el plasma. En el plasma, la proporción esperada de las moléculas totales (E) que recaen en un recipiente dentro una región afectada puede calcularse de la siguiente forma: E P f 1 f 3000, 214 Clinical Chemistry 59:1 (2013)

5 Genoma del cáncer detectado en plasma donde f es la concentración fraccional del ADN de origen tumoral en plasma. Las simulaciones de 1000 casos normales y 1000 casos de cáncer se realizaron asumiendo una distribución binominal de las moléculas de ADN en plasma, con las representaciones de plasma esperadas conforme al cálculo superior y con un número creciente de moléculas bajo análisis hasta alcanzar la tasa de detección del 95%. La simulación se condujo con la función rbinom en R ( DETECCIÓN DE LAS VARIANTES DE NUCLEÓTIDO ÚNICO DE ORIGEN TUMORAL Realizamos la secuenciación del tumor emparejado y las muestras de ADN general para identificar las variantes de nucleótido único relacionadas con el tumor (SNV). Nos enfocamos en las SNV producidas en los sitios homocigóticos en el ADN general (p. ej., ADN de capa leucocitaria). En principio, cualquier variación de nucleótido detectada en los datos de secuenciación del tejido tumoral pero ausente en el ADN general podría ser una posible mutación (p. ej., una SNV). No obstante, debido a los errores de secuenciación (0.1% 0.3% de los nucleótidos secuenciados) (29 ), se identificarían millones de falsos positivos en el genoma si una única manifestación de cualquier cambio de nucleótido en los datos de secuenciación del tejido tumoral fuera a considerarse como SNV relacionada con el tumor. Una manera de reducir el número de falsos positivos podría ser establecer el criterio de observación de múltiples manifestaciones del mismo cambio de nucleótido en los datos de secuenciación del tejido tumoral antes de que pueda invocarse una SNV relacionada con un tumor. Dado que la manifestación de los errores de secuenciación es un proceso estocástico, el número de falsos positivos causados por errores de secuenciación se disminuiría exponencialmente con el incremento del número de manifestaciones requeridas para que una SNV observada califique como SNV relacionada con un tumor. Por otra parte, el número de falsos positivos aumentaría exponencialmente con el aumento en la profundidad de la secuenciación. Estas relaciones podrían predecirse con las funciones de distribución binomiales o Poisson. En relación con esto, hemos desarrollado un algoritmo matemático para determinar el umbral dinámico de manifestaciones para calificar a una SNV observada como tumor relacionado. Este algoritmo toma en cuenta la cobertura existente del nucleótido particular en los datos de secuenciación del tumor, la proporción de errores de secuenciación, la proporción máxima de falsos positivos permitidos y la sensibilidad deseada para la detección de la mutación. En este estudio, definimos criterios muy estrictos para reducir los falsos positivos. Necesitábamos que la mutación estuviera completamente ausente en la secuenciación de ADN general y la profundidad de la secuenciación para la posición particular del nucleótido tenía que ser más de 20 veces mayor. Este umbral de manifestación fue necesario para controlar la proporción de detección de falsos positivos a En este algoritmo también filtramos las SNV que estuvieron dentro de las regiones centroméricas, teloméricas y de baja complexidad para minimizar falsos positivos debidos a los artefactos de secuenciación. Asimismo, se eliminó la presunta cartografía de SNV a SNP conocidos en la base de datos de SNP dbsnp Build135. Resultados ABERRACIONES DEL NÚMERO DE COPIAS RELACIONADAS CON EL TUMOR EN PLASMA Investigamos si las aberraciones del número de copias relacionadas con el tumor podrían detectarse en el plasma de pacientes con cáncer mediante MPS shotgun. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron tanto antes como 1 semana después de la resección quirúrgica con propósitos curativos en 4 pacientes con HCC. Las muestras de sangre se fraccionaron en células sanguíneas y plasma. El ADN también se obtuvo de cada uno de los tumores. Se analizaron las aberraciones del número de copias en las 4 muestras del tumor con MPS y con 1 o 2 plataformas de micromatriz (Affymetrix y Agilent). Las aberraciones del número de copias se analizaron en ventanas de 1-Mb a través del genoma en los tejidos tumorales y se compararon con las muestras de plasma de un grupo de 16 individuos de control sanos. Los datos fueron uniformes en las 3 plataformas (ver Fig. 1 en el Suplemento de datos anexo a la versión en línea de este artículo en A continuación, usamos la MPS para analizar las muestras de plasma anteriores y posteriores a la resección obtenidas de los 4 pacientes con HCC. La profundidad de secuenciación media fue de una cobertura 17 veces mayor del genoma humano haploide (rango, 15.2 veces a 18.5 veces). La Fig. 1 muestra los lotes Circos (30 ) de las aberraciones del número de copias a través del genoma en el tumor, la muestra de plasma anterior a la resección y la muestra de plasma posterior a la resección de cada paciente. En cada caso, las aberraciones del número de copias características observadas en la muestra de tejido tumoral también se observaron en pacientes en la muestra de plasma anterior a la resección (Fig. 1). Un cambio significativo en la representación regional del ADN en plasma se definió como 3 SD de la representación media de los 16 controles sanos para la correspondiente ventana de 1-Mb. Clinical Chemistry 59:1 (2013) 215

6 Fig. 1. Aberraciones del número de copias detectadas en la muestra de tejido tumoral (anillo interno), muestra de plasma anterior a la cirugía (anillo medio) y muestra de plasma posterior a la cirugía (anillo externo) para los 4 casos de HCC (A-D) y representación genómica de muestras de ADN en plasma para un portador del virus de hepatitis B (HBV1) sin HCC (E). Los ideogramas de cromosomas (afuera de las gráficas) están orientados de pter a qter en la dirección de las agujas del reloj. Para los tejidos tumorales, están presentes los números de copias ganadas (verde) o perdidas (rojo). Para las muestras de plasma, las regiones con representación en plasma ampliadas y reducidas se muestran en verde y rojo, respectivamente. Las regiones con las puntuaciones z entre 3 y 3 están representadas por puntos grises. Para HCC1, la distancia entre las 2 líneas horizontales consecutivas representa una puntuación z de 30. Para los demás casos, la distancia representa una puntuación z de Clinical Chemistry 59:1 (2013)

7 Genoma del cáncer detectado en plasma Fig. 2. (A), Tasas de detección para diferentes clases de aberraciones del número de copias relacionadas con el tumor en el plasma de pacientes con HCC. La concentración fraccional del ADN de origen tumoral (entre paréntesis) determinada para cada caso mediante análisis GAAL. (B), Número de moléculas requeridas para el análisis de cada región de interés (ventana de 1-Mb) para detectar el 95% de las aberraciones del número de copias relacionada con el cáncer en plasma. En todos los casos, tales aberraciones del número de copias desaparecieron casi por completo en la muestra de plasma posterior a la resección (Fig. 1). La detectabilidad de las diferentes clases de alteraciones genéticas relacionadas con el tumor en plasma se observan en la Fig. 2. Para la comparación, usamos el mismo enfoque para analizar las muestras de ADN en plasma de 4 portadores de hepatitis B sin HCC (Fig. 1E; ver Fig. 2 en el Suplemento de datos en línea). Se realizó un seguimiento de estos individuos durante 1 añomás después del muestreo de sangre y no se demostró evidencia de HCC. Para estos individuos, el 99% de los recipientes secuenciados demostró representaciones normales en plasma (ver Tabla 1 en el Suplemento de datos en línea). De forma similar, una media del 98.9% de los recipientes secuenciados en los 16 controles sanos demostró representaciones normales en plasma (ver Tabla 2 y Fig. 3 en el Suplemento de datos en línea). Estos resultados indican que el análisis de las aberraciones Tabla 1. Concentración fraccional del ADN de origen tumoral en plasma mediante el análisis GAAL. Caso Dimensión máxima del tumor, cm SNP con LOH en el tumor, n Plasma Tiempo de la Concentración fraccional del obtención N nondel a N del ADN de origen tumoral HCC Antes de la cirugía % Después de la cirugía % HCC Antes de la cirugía % Después de la cirugía % HCC Antes de la cirugía % Después de la cirugía % HCC Antes de la cirugía % Después de la cirugía % a Un número N nondel, de lecturas secuenciadas portadoras de los alelos no eliminados en los tejidos tumorales; número N del, de lecturas secuenciadas portadoras de los alelos eliminados en los tejidos tumorales. Clinical Chemistry 59:1 (2013) 217

8 Tabla 2. Concentraciones fraccionales de ADN de origen tumoral en plasma determinado mediante análisis de SNV. Caso N. de SNV detectadas en tejido tumoral Punto temporal N. de SNV relacionadas con el tumor secuenciadas del plasma (porcentaje de SNV observadas en tejidos tumorales) N. de lecturas de secuencia de ADN en plasma que muestran SNV (p) N. de lecturas de secuencia de ADN en plasma que muestran secuencias naturales (q) Concentración fraccional deducida de ADN de origen tumoral mediante análisis de SNV Concentración fraccional deducida de ADN de origen tumoral mediante análisis GAAL HCC Antes de la cirugía 2569 (94%) % 52% Después de la cirugía 44 (1.5%) % 0.9% HCC Antes de la cirugía 1097 (35%) % 5.6% Después de la cirugía 72 (2.3%) % 0.9% HCC Antes de la cirugía 461 (15%) % 4.3% Después de la cirugía 31 (1%) % 1.4% HCC Antes de la cirugía 201 (15%) % 7.6% Después de la cirugía 74 (5.5%) % 2.7% Para estimar la especificidad del enfoque de análisis de SNV, analizamos el plasma de los controles sanos para las SNV relacionadas con el tumor (ver Tabla 4 en el Suplemento de datos en línea). La presencia de un número reducido de estas posibles mutaciones relacionadas con el tumor en el plasma de los 16 controles sanos representó el ruido estocástico de este método y fue probable debido a errores de secuenciación. La concentración fraccional media estimada de dicho ruido fue del 0.38%. del número de copias en plasma es específico para la diferenciación entre los pacientes con cáncer y los individuos que no presentan cáncer; sin embargo, la especificidad para el análisis del número de copias de plasma pareció reducirse en los pacientes con HCC. Por consiguiente, en los 4 pacientes con HCC, una mediana del 15% (rango, 2% 48%) de las regiones en las cuales no ocurrieron aberraciones del número del copias en el tejido tumoral correspondiente demostró una representación de ADN en plasma aberrante (ver Tabla 1 en el Suplemento de datos en línea). Este tema se analizará en mayor detalle en la sección Análisis. CONCENTRACIÓN FRACCIONAL DEL ADN TUMORAL EN PLASMA DETERMINADO MEDIANTE EL ANÁLISIS DE PÉRDIDA ALÉLICA AGREGADA DE GENOTIPO Las concentraciones fraccionales de ADN en plasma de origen tumoral se determinaron mediante el análisis, de manera genómica, de los recuentos alélicos de las SNP que presentaban LOH en los datos de MPS de shotgun en plasma, al que denominamos análisis de pérdida alélica agregada de genotipo (GAAL). Para dicho análisis, escogimos las SNP que presentaban LOH en los tumores como se demostró con la micromatriz Affymetrix SNP 6.0. Los alelos eliminados en los tumores tendrían concentraciones más bajas en el plasma que aquellos que no se eliminaron. La diferencia en sus concentraciones se relacionó con la concentración de ADN de origen tumoral en la muestra de plasma. Por lo tanto, la concentración de plasma del ADN de origen tumoral (C) puede deducirse con la siguiente ecuación: C N nondel N del N nondel, donde N nondel representa el número de lecturas secuenciadas portadoras de los alelos no eliminados en los tejidos tumorales y N del representa el número de lecturas secuenciadas portadoras de los alelos eliminados en los tejidos tumorales. La Tabla 1 enumera las concentraciones fraccionales del ADN en las muestras de plasma para cada uno de los 4 casos. El tamaño del tumor parece correlacionarse con la concentración fraccional estimada del ADN de origen tumoral en plasma antes de la resección quirúrgica. Por ejemplo, estimamos que el ADN de origen tumoral registró el 52% del ADN en plasma total en el paciente que presentaba el tumor de mayor tamaño (13 cm) de los 4 casos con HCC. Para cada uno de los 4 casos, se observó una reducción en la concentración fraccional del ADN de origen tumoral después de la resección quirúrgica del tumor (Tabla 1). FACTORES QUE INFLUYEN EN LA DETECCIÓN DE ABERRACIONES DEL NÚMERO DE COPIAS EN PLASMA La concentración fraccional del ADN tumoral en plasma y la clase de aberraciones del número de copias 218 Clinical Chemistry 59:1 (2013)

9 Genoma del cáncer detectado en plasma Fig. 3. Ilustración que muestra las ubicaciones de los tumores en una paciente con cáncer sincrónico de mama y ovarios. Se obtuvieron muestras de cuatro regiones (A, B, CyD) de los tumores ováricos. Se muestran las concentraciones fraccionales del ADN en plasma de origen tumoral estimado con SNV asociadas con cada una de las regiones de los tumores ováricos. La concentración fraccional calculada del ADN tumoral en plasma se incrementa cuando el cálculo está basado en SNV asociadas con múltiples regiones del tumor. influyeron ampliamente en la detectabilidad de tales alteraciones en plasma. La Fig. 1 y Fig. 2A demuestran que las proporciones de las aberraciones genéticas relacionadas con el tumor que podrían observarse en los resultados de secuenciación de ADN en plasma se correlacionaron con las concentraciones fraccionales del ADN tumoral en plasma. Por ejemplo, el caso HCC1, que tenía el tumor más grande y la concentración fraccional más alta de ADN tumoral en plasma, también tenía la mayor proporción de aberraciones del número de copias detectadas en plasma (Fig. 1A). El caso HCC1 presentaba una concentración fraccional de ADN de origen tumoral del 52%. Antes del tratamiento, la mayoría de las aberraciones del número de copias de tumor también podían observarse en el plasma. En la mayoría de las regiones cromosómicas con una ganancia de copia única en el tumor (p. ej., cromosomas 1p, 3 y 6), las puntuaciones z fueron 20, lo que indica que la representación de plasma fue de 20 SD sobre la representación media de los individuos control sanos para estas regiones. Por otro lado, el caso HCC3 presentó una concentración de ADN tumoral fraccional en plasma del 4.3%, y podría observarse una proporción más reducida de aberraciones relacionadas con el cáncer en el plasma. Ninguna de las regiones con una ganancia de copia única (7q, 8q, 13q y 14p) tenía una puntuaciónz de 10 en el plasma. Las clases de aberraciones del número de copias que se estudiaron incluyeron pérdidas de 1 copia, ganancias de 1 copia y ganancias de 2 copias. Los porcentajes de dichos cambios que se detectaron en el plasma de cada uno de los cuatro casos de HCC están representados en la Fig. 2A y enumerados en la Tabla 3 del Suplemento de datos en línea. Para cada caso, podrían detectarse ganancias de 2 copias con mayor sensibilidad en plasma que en los cambios de 1 copia. En los 4 Tabla 3. Análisis de SNV de múltiples regiones del cáncer de ovario en la paciente con cáncer sincrónico. Plasma anterior a la cirugía Plasma posterior a la cirugía Grupo de SNV N. de SNV en tumor N. de lecturas de secuencia que muestran las SNV en plasma (p) N. de lecturas de secuencia que muestran la secuencia natural en plasma (q) Concentración fraccional deducida de ADN de origen tumoral N. de lecturas de secuencia que muestran las SNV en plasma (p) N. de lecturas de secuencia que muestran la secuencia natural en plasma (q) Concentración fraccional deducida de ADN de origen tumoral A % % B % % C % % D % % AB % % CD % % ABCD % % Clinical Chemistry 59:1 (2013) 219

10 pacientes con HCC, la mayoría de estas aberraciones cromosómicas relacionadas con el tumor desaparecieron después de la resección quirúrgica del tumor (Fig. 1; ver Tabla 3 en el Suplemento de datos en línea). Un trabajo anterior sobre el diagnóstico prenatal no invasivo ha demostrado que una mayor profundidad en la secuenciación posibilitaría la detección en plasma de un feto aneuploide a una menor concentración de ADN fetal fraccional (31 ). Mediante la simulación por computadora, exploramos la relación entre las profundidades de la secuenciación que sería necesaria para detectar diferentes clases de aberraciones del número de copias en plasma relacionadas con el tumor a concentraciones fraccionales diferentes del ADN tumoral en plasma (Fig. 2B). Con fines ilustrativos, hemos fijado la tasa de detección al 95% y exploramos 3 clases de aberraciones genéticas: pérdida de 1 copia, ganancia de 1 copia y ganancia de 2 copias. Cuando la concentración fraccional de ADN de origen tumoral fuera del 40%, la detección de aberraciones con ganancias de 2 copias y de 1 copia requeriría el análisis de aproximadamente 180 y 800 moléculas, respectivamente, por ventana de 1-Mb. Cuando la concentración fraccional del ADN de origen tumoral cae al 10%, es necesario el análisis de aproximadamente 2500 y moléculas por ventana de 1-Mb para detectar estos cambios respectivos. El requisito de un incremento exponencial en el número de moléculas con una concentración fraccional decreciente del ADN de origen tumoral fue consistente con el requisito para el diagnóstico prenatal no invasivo de aneuploides cromosómicos fetales mediante el análisis de ADN en plasma materno (32 ). SNV EN PLASMA DE ORIGEN TUMORAL A continuación, exploramos la detección genómica de las SNV en plasma de origen tumoral de 4 pacientes con HCC. Secuenciamos el ADN tumoral y ADN de capa leucocitaria a profundidades medias de 29.5 veces (rango, 27 veces a 33 veces) y 43 veces (rango, 39 veces a 46 veces) de la cobertura del genoma haploide, respectivamente. Se compararon los datos de MPS del ADN tumoral y el ADN de la capa leucocitaria de cada uno de los 4 pacientes con HCC, y se extrajeron las SNV presentes en el ADN tumoral pero no en la capa leucocitaria con un riguroso algoritmo de bioinformática. Este algoritmo requirió la presencia de una posible SNV por lo menos en un número máximo de fragmentos de ADN tumoral secuenciado antes de que pudiera clasificarse como una SNV verdadera. El número máximo se determinó teniendo en cuenta la profundidad de secuenciación de un nucleótido particular y la proporción de errores de secuenciación. El número de SNV relacionadas con el tumor osciló de 1334 a 3171 en los 4 casos de HCC. Las proporciones de tales SNV detectables en plasma se enumeran en la Tabla 2. En forma previa al tratamiento, se detectaron en el plasma del 15 al 94% de las SNV relacionadas con el tumor. Las concentraciones fraccionales de ADN de origen tumoral en plasma se determinaron mediante recuentos fraccionales del mutante en relación con las secuencias totales (es decir, tipo mutante más natural) (Tabla 2). Estas concentraciones fraccionales se correlacionaron adecuadamente con aquellas determinadas mediante análisis GAAL y se redujeron después de la cirugía (Tabla 2). ANÁLISIS DE ADN DE PLASMA EN UNA PACIENTE CON CÁNCER SINCRÓNICO MÚLTIPLE Para ilustrar el uso de MPS shotgun de ADN en plasma para controlar un escenario oncogénico complejo, estudiamos una paciente de 58 años de edad con mutación de BRCA1 (cáncer de mama 1, inicio temprano) (p.cys1697*) que presentaba cáncer sincrónico de mama y ovarios (Fig. 3). El cáncer de mama fue un carcinoma ductal infiltrante de 3 cm localizado en la mama izquierda. La paciente presentaba adenocarcinomas serosos en ambos ovarios. El tumor en el ovario izquierdo medía 6 cm en la dimensión más larga y el tumor ubicado en el lado derecho medía 12 cm. También se observaron múltiples depósitos tumorales intraabdominales que comprometían al epiplón y al colon. Se realizaron resecciones quirúrgicas del tumor de mama y de los tumores de ovarios, junto con el epiplón y el colon sigmoide en el mismo día. Se obtuvieron los tejidos del tumor de mama y de los tumores de ovarios del lado izquierdo y derecho para este estudio. También se obtuvieron muestras de plasma en el momento del diagnóstico y 1 día después de la operación.se realizó el análisis del ADN del tumor de mama y 4 regiones de los tumores de ovarios (2 del ovario izquierdo y 2 del ovario derecho) mediante MPS. Las regiones de las que se obtuvieron muestras del tumor de ovario en el mismo lado tuvieron una separación de 4 cm. Las aberraciones del número de copias para el cáncer de mama y ovarios se representan en la Fig. 4A. Las 4 regiones tumorales ováricas mostraron patrones altamente similares de aberraciones del número de copias. Por el otro lado, el cáncer de mama exhibió un patrón diferente de las aberraciones del número de copias. El patrón de aberraciones en la muestra de plasma anterior a la cirugía fue un compuesto de los patrones de aberraciones en el cáncer de mama y ovarios (Fig. 4B). Los ejemplos de aberraciones genéticas específicos del cáncer de mama incluyeron un segmento eliminado en el cromosoma 6p y amplificaciones en cromosomas 1q, 7p y 15q (Fig. 4A). Por otro lado, los ejemplos de aberraciones genéticas específicos de los tumores de ovarios incluyeron supresiones en los cromosomas 2, 4p, 11p, 12q, 18q y 22q y las amplificaciones en los 220 Clinical Chemistry 59:1 (2013)

11 Genoma del cáncer detectado en plasma Fig. 4. (A), Aberraciones del número de copias detectadas en el cáncer de mama (anillo más interno) y los tumores ováricos (segundo anillo más interno hacia afuera: regiones A, B, CyD). (B), Aberraciones del número de copias en el tumor de mama, tumor ovárico (región A), plasma anterior a la cirugía y plasma posterior a la cirugía (de adentro hacia afuera). Dos regiones genómicas que presentan aberraciones del número de copias específicas para el cáncer de mama están marcadas con un cuadro (cromosoma 1q) y una flecha (cromosoma 6p). (C), Vista ampliada de las regiones del cromosoma 1q y 6p en las muestras del tumor y el plasma. cromosomas 3q, 5p y 21q (Fig. 4B). Estas aberraciones genéticas específicas del cáncer de mama o del cáncer de ovario se observaron en la muestra de plasma anterior a la cirugía pero se aclararon en la muestra de plasma posterior a la cirugía (Fig. 4A). Una vista ampliada de 2 regiones genómicas que exhibieron aberraciones del número de copias presentes en el cáncer de mama pero ausentes en los tumores de ovarios se muestra en la Fig. 4C. Para examinar las contribuciones relativas realizadas por el cáncer de mama y de ovarios al ADN en plasma del paciente, se llevaron a cabo análisis GAAL Clinical Chemistry 59:1 (2013) 221

12 de las regiones genómicas que exhibieron deleciones específicas en el tumor de mama o los tumores de ovarios. Estos resultados indicaron que el cáncer de mamayelcáncer de ovario contribuyeron en un 2.1 y 46%, respectivamente, del ADN en plasma anterior a la cirugía (ver Tabla 5 en el Suplemento de datos en línea). Las concentraciones fraccionales del ADN aportadas por cada uno de estos tumores cayeron a 1.3 y 0.66%, respectivamente, después de la cirugía (ver Tabla 5 en el Suplemento de datos en línea). INVESTIGACIÓN DE HETEROGENEIDAD TUMORAL A continuación, exploramos el fenómeno de heterogeneidad tumoral (33 ) mediante el estudio de las 4 regiones de las que se obtuvieron muestras de los tumores de ovarios. No hubo diferencias observables entre estas 4 regiones en términos de aberraciones del número de copias (Fig. 4A). Comparamos el perfil de SNV de cada una de estas regiones con el ADN de la capa leucocitaria del paciente. Clasificamos las SNV en 7 grupos: 4 grupos que contienen mutaciones que fueron únicas para cada región (es decir, grupos A, B, C y D), 2 grupos que incluían mutaciones compartidas por las 2 regiones de cada lado del cuerpo (es decir, grupos AB y CD) y un grupo final que incluía las mutaciones compartidas por las 4 regiones (es decir, grupo ABCD) (Tabla 3 y Fig. 3). Seleccionamos aleatoriamente aproximadamente 10 SNV para cada uno de los 7 grupos de SNV para la validación con un método de extensión de nucleótido único basado en espectrometría (análisis iplex; Sequenom) (ver Tabla 6 en el Suplemento de datos en línea). Un total de 67 mutaciones estuvieron sujetas a validación.más del 95% de los resultados de SNV fueron determinados mediante análisis iplex. Las SNV de cada uno de estos grupos se buscaron luego en los datos de MPS shotgun en plasma. Se determinaron las concentraciones fraccionales del ADN tumoral circulante con cada grupo de SNV (Tabla 3). Las concentraciones fraccionales del ADN tumoral en plasma anterior y posterior a la cirugía, como se determinó mediante las SNV compartidas por las 4 regiones (es decir, el grupo ABCD), fueron del 46 y 0.18%, respectivamente. Estos últimos porcentajes se correlacionaron adecuadamente con aquellos obtenidos en los análisis GAAL (ver Tabla 5 en el Suplemento de datos en línea). Las concentraciones fraccionales de ADN de origen tumoral en el plasma anterior a la cirugía determinadas con las SNV de los grupos AB y CD fueron del 9.5% y 1.1%, respectivamente (Tabla 3). Estas concentraciones fueron consistentes con los tamaños relativos de los tumores de ovario derecho e izquierdo (Fig. 3). Las concentraciones fraccionales del ADN de origen tumoral determinadas con las SNV únicas de la región, es decir, aquellas de los grupos A, B, C y D, fueron generalmente bajas. La tendencia de una reducción en el ADN de origen tumoral fraccional observada en plasma como se midió con las SNV de mayor especificidad regional se estudiará en el Análisis. ANÁLISIS Nuestros datos indican que la secuenciación shotgun de muestras de plasma de pacientes con cáncer podría permitir el análisis de mutaciones y aberraciones del número de copias relacionadas con el cáncer de forma genómica no invasiva (Figs. 1 y 4). Este hallazgo es un importante avance del trabajo previo, que por lo general se ha enfocado en la detección de un reducido número de cambios genéticos relacionados con el tumor en plasma (1 ). Este enfoque permitiría la exploración de las aberraciones genómicas almacenadas por las células tumorales en un paciente a diferentes niveles de resolución, que van de una vista global de las aberraciones del número de copias relacionadas con el cáncer hasta mutaciones puntuales trasmitidas por diferentes clones de células tumorales. Este enfoque permitirá el seguimiento serial de los aspectos cualitativos y cuantitativos de tales aberraciones, como lo demostraron los cambios observados en las muestras de plasmas anteriores y posteriores a la cirugía.elmétodo también permitiría la valuación de la carga del tumor, como se indicó mediante la correlación entre la concentración de ADN fraccional del tumor medida y el tamaño del tumor. En este estudio, estas características generales se observaron en los perfiles de ADN en plasma derivados del HCC, cáncer de mama y cáncer de ovario. Tanto el análisis GAAL como SNV permiten la medición de las concentraciones fraccionales del ADN de origen tumoral en plasma para cualquier cáncer. Estos enfoques permitirían comparar el ADN liberado en el plasma de distintos tipos de tumores. A través de la acumulación de los recuentos de secuencia de SNP involucradas en la LOH y en las mutaciones puntuales a través del genoma, se espera que las mediciones hechas por estos análisis sean mucho más precisas que aquellas realizadas sobre la base de los cambios genéticos individuales relacionados con el tumor. El grupo de control para el establecimiento del valor de referencia del análisis del número de copias basado en plasma incluyó individuos sanos sin cáncer. La especificidad de este tipo de análisis para individuos sin cáncer puede observarse a partir del análisis de remuestreo de este grupo de control, al igual que en los portadores de hepatitis B crónica sin HCC. Para estos 2 grupos, solo una fracción reducida de regiones presentó una representación aberrante de ADN en plasma con una puntuación z 3 o 3. Estos resultados indicaron que este enfoque es específico para la diferenciación entre pacientes con cáncer e individuos sin 222 Clinical Chemistry 59:1 (2013)

13 Genoma del cáncer detectado en plasma cáncer. Sin embargo, cuando se usó este enfoque para analizar el plasma de pacientes con HCC, la especificidad pareció ser menor que aquella para el estudio de participantes sin cáncer. La explicación de esta observación no está completamente clara actualmente; sin embargo, podemos considerar al menos 2 explicaciones posibles. Primero, la presencia del ADN tumoral con regiones que presentan aberraciones del número de copias en plasma de pacientes con cáncer podría afectar a la contribución relativa observada de ADN de regiones que no presentan aberraciones del número de copias. Por ejemplo, en un tumor que presenta diversas pérdidas del número de copias en el genoma, se podría observar una contribución relativamente mayor del ADN en plasma con origen en las regiones genómicas con un número de copias normal. Este efecto podría ser mayor en muestras de plasma con concentraciones altas de ADN tumoral. En efecto, los porcentajes de clasificación errónea de las regiones normales son las mayores para el caso de HCC1 (ver Tabla 1 en el Suplemento de datos en línea), el cual tiene la mayor concentración de ADN tumoral fraccional en plasma (52%). Segundo, el fenómeno de heterogeneidad tumoral podría explicar una proporción de tales resultados falsos positivos aparentes. En otras palabras, la región tumoral única de la que se obtuvieron muestras para cada tumor de HCC podría no contener una aberración del número de copias particular que se liberó en el plasma de otro clon de tumor no incluido en la región de la muestra Si bien el fenómeno mencionado en este párrafo requiere más estudio, actualmente no parece afectar de forma adversa la capacidad para distinguirse entre individuos con cáncer y aquellos sin cáncer. La paciente con cáncer sincrónico de mama y ovarios es particularmente digna de mencionar, dado que el caso ilustra un número de conceptos importantes. Primero, demuestra que el análisis cuidadoso de los datos de secuenciación permiten diseccionar la presencia del ADN en el plasma con origen en poblaciones de células tumorales individuales. Las regiones genómicas dirigidas que presentan aberraciones del número de copias específicas del cáncer de mama y ovarios permitieron la explicación de las contribuciones relativas de estos tumores al grupo de ADN circulante (Fig. 4B; ver Tabla 5 en el Suplemento de datos en línea). Para estudiar el efecto de heterogeneidad tumoral en el perfil de ADN en plasma, analizamos el perfil mutacional de las 4 regiones del cáncer de ovario bilateral mediante comparaciones con el ADN general de la paciente. Pudimos agrupar estas mutaciones en 7 categorías de acuerdo con el grado de uso compartido de estas mutaciones entre las 4 regiones. Resulta interesante que las mutaciones compartidas por las 4 regiones (es decir, grupo ABCD) aportaron la mayor contribución fraccional del ADN de origen tumoral al plasma. Por otro lado, las mutaciones más específicas según la región aportaron una contribución reducida al plasma. Por lo tanto, no resultó sorprendente que el análisis GAAL, el cual se basa en la adición de la cantidad de pérdida alélica a través del genoma, produjera una concentración de ADN tumoral fraccional similar a la del análisis basado en SNV de la categoría ABCD. Estos datos sugieren que para una medición precisa de la carga tumoral total en un paciente con cáncer, el uso de un enfoque shotgun de genotipo amplio podría brindar una imagen más representativa, en comparación con el enfoque más tradicional de orientación hacia las mutaciones específicas relacionadas con el tumor. Para el último enfoque, si solo un subgrupo de las células tumorales posee las mutaciones dirigidas, se podría omitir información importante en relación con la recaída inminente o la progresión de la enfermedad causada por las células tumorales que no poseen las mutaciones dirigidas, o se podría perder la emergencia de un clon resistente al tratamiento. De hecho, el fenómeno de heterogeneidad tumoral (33 ) ha creado desafíos para el desarrollo de marcadores tumorales verdaderamente representativos para propósitos de supervisión. Debido a que el plasma recibe el ADN de los distintos clones heterogéneos del tumor en el cuerpo, la secuenciación shotgun del ADN en plasma podría ser un método fácilmente disponible y no invasivo para estudiar y controlar la heterogeneidad tumoral y la carga total del tumor en el cuerpo. En este trabajo, utilizamos las SNV relacionadas con el tumor como marcadores tumorales y no nos enfocamos en aclarar la biología del panorama mutacional de los tipos de cáncer estudiados. De este modo, el trabajo actual no ha llevado a cabo una caracterización detallada de las secuencias mutadas. Sin embargo, esperábamos que la mayoría de las SNV relacionadas con el tumor que detectamos fueran mutaciones pasajeras en lugar de conductoras. El objetivo de este estudio fue el de desarrollar un enfoque no invasivo para evaluar la carga tumoral en el cuerpo. Por lo tanto, creemos que la detección de mutaciones, pasajeras y conductoras, de forma genómica amplia, proporciona una ventaja numérica que tiene el potencial para alcanzar una detección del ADN tumoral en plasma más sensible, precisa y representativa. Por otro lado, los análisis selectivos de mutaciones conductoras pueden permitir una identificación más rápida de objetivos que requieren acciones médicas (8 ). Por consiguiente, el enfoque de genoma completo no selectivo puede combinarse de manera sinérgica con las estrategias más convencionales de detección de objetivos selectivos para lograr un mejor tratamiento del cáncer. Clinical Chemistry 59:1 (2013) 223

14 Dado que el ADN en plasma de pacientes con cáncer consiste en una mezcla de ADN tumoral y no tumoral, y que el primero se presenta como una población minoritaria en muchos pacientes, se necesita realizar una secuenciación relativamente profunda para obtener el poder analítico necesario. Por lo tanto, como se implementó actualmente, el enfoque de secuenciación shotgun que hemos descrito es relativamente costoso en comparación con diversos enfoques dirigidos (8 ). Con la reducción continua y, hasta el momento, rápida en los costos de secuenciación, no se espera que el costo sea un gran obstáculo en el futuro cercano. También puede preverse la posibilidad de usar la secuenciación shotgun de una muestra de plasma tras la presentación de un paciente con cáncer y extraer los datos de secuenciación shotgun del ADN en plasma para aberraciones del número de copias y SNV, y luego dirigir específicamente dichas secuencias con propósitos de supervisión en serie. En este sentido, los enfoques de captura basados en hibridación en fase de solución ya se han usado satisfactoriamente a fin de enriquecer el ADN en plasma para el diagnóstico prenatal no invasivo (34, 35 ). Por lo tanto, vemos que los enfoques dirigidos y de shotgun pueden usarse en forma combinada para la detección y supervisión del cáncer. En resumen, hemos demostrado el funcionamiento de la exploración genómica del cáncer mediante secuenciación shotgun de ADN en plasma. Este desarrollo tiene numerosas aplicaciones clínicas y para la investigación. Por consiguiente, podría ser una prioridad de la investigación evaluar este enfoque en cohortes de gran tamaño de diferentes tipos de cáncer. Contribuciones de los autores: Todos los autores confirmaron que han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cumplido con los siguientes 3 requerimientos: (a) contribuciones significativas a la concepción y el diseño, la adquisición de datos o el análisis e Referencias interpretación de estos; (b) redacción o revisión del artículo en relación con su contenido intelectual; y (c) aprobación final del artículo publicado. Declaraciones de los autores o posibles conflictos de interés:tras la presentación del manuscrito, todos los autores completaron el formulario de declaración del autor. Declaraciones o posibles conflictos de interés: Empleo o liderazgo: Y.M.D. Lo, Clinical Chemistry, AACC. Papel del consultor o asesor: R.W.K. Chiu, Sequenom; Y.M.D. Lo, Sequenom. Propiedad de acciones: R.W.K. Chiu, Sequenom; Y.M.D. Lo, Sequenom. Honorarios: R.W.K. Chiu, Life Technologies (subsidios de viajes) e Illumina (subsidios de viajes); Y.M.D. Lo, Illumina y Life Technologies. Financiamiento de la investigación: K.C.A. Chan, Hong Kong Research Grants Council Theme-based Research Scheme (T12- CUHK05/10); H. Sun, Hong Kong Research Grants Council Themebased Research Scheme (T12-CUHK05/10); A.T.C. Chan, Hong Kong Research Grants Council Theme-based Research Scheme (T12-CUHK05/10) e Innovation and Technology Fund bajo el programa State Key Laboratory Programme; R.W.K. Chiu, Hong Kong Research Grants Council Theme-based Research Scheme (T12- CUHK05/10) y S.K. Yee Foundation; Y.M.D. Lo, Hong Kong Research Grants Council Theme-based Research Scheme (T12- CUHK05/10), S.K. Yee Foundation, Innovation and Technology Fund bajo el programa State Key Laboratory Programme y cátedra subvencionada de Li Ka Shing Foundation. Testimonio de expertos: No se declara. Patentes: K.C.A. Chan, P. Jiang, R.W.K. Chiu e Y.M.D. Lo han declarado el mismo equipo de 5 campos de aplicación de patentes en los EE. UU. en este trabajo: 13/308473, 61/662878, 61/682725, 61/ y 61/ Disponibilidad de materiales y datos: Los datos de secuenciacióny los datos de genotipo se depositaron en el archivo European Genome-Phenome Archive (EGA que cuenta con el patrocinio de European Bioinformatics Institute (EBI), bajo el número de acceso EGAS Papel del patrocinador: Las organizaciones de financiamiento no tuvieron ninguna participación en el diseño de estudio, la elecciónde los pacientes involucrados, la revisión e interpretación de datos ni en la preparación o aprobación del manuscrito. Agradecemos a L. Chan, Y. Jin, C. Lee, K. Chow, S.-W. Yeung, X. Su, y C. Chan por la asistencia técnica. 1. Schwarzenbach H, Hoon DS, Pantel K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients (Ácidos nucleicos de células libres como biomarcadores en pacientes con cáncer). Nat Rev Cancer 2011;11: McDermott U, Downing JR, Stratton MR. Genomics and the continuum of cancer care (La genómica y la continuidad del cuidado del cáncer). N Engl J Med 2011;364: Nawroz H, Koch W, Anker P, Stroun M, Sidransky D. Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients (Alteraciones de microsatélite en ADN en suero de pacientes con cáncer de cuello y cabeza). Nat Med 1996;2: Chen XQ, Stroun M, Magnenat JL, Nicod LP, Kurt AM, Lyautey J, et al. Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients (Alteraciones de microsatélite en ADN en plasma de pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas). Nat Med 1996;2: Yung TK, Chan KCA, Mok TS, Tong J, To KF, Lo YMD. Single-molecule detection of epidermal growth factor receptor mutations in plasma by microfluidics digital PCR in non-small cell lung cancer patients. (Detección de moléculas únicas de mutaciones del receptor del factor de crecimiento epidérmico en plasma mediante PCR digital de microfluidos en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas). Clin Cancer Res 15: , Diehl F, Li M, Dressman D, He Y, Shen D, Szabo S, et al. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors (Detección y cuantificación de mutaciones en el plasma de pacientes con tumores colorrectales). Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102: Diehl F, Schmidt K, Choti MA, Romans K, Goodman S, Li M, et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics (ADN mutante circulante para evaluar la dinámica tumoral). Nat Med 2008;14: Forshew T, Murtaza M, Parkinson C, Gale D, Tsui DW, Kaper F, et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA (Identificación no invasiva y control de mutaciones de cáncer mediante secuenciación profunda dirigida de ADN en plasma). Sci Transl Med 2012;4: Diaz LA Jr., Williams RT, Wu J, Kinde I, Hecht JR, Berlin J, et al. The molecular evolution of ac- 224 Clinical Chemistry 59:1 (2013)

15 Genoma del cáncer detectado en plasma quired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers (La evolución molecular de resistencia adquirida al bloqueo del EGFR dirigido en cáncer colorrectal). Nature 2012;486: Wong IH, Lo YMD, Zhang J, Liew CT, Ng MH, Wong N, et al. Detection of aberrant p16 methylation in the plasma and serum of liver cancer patients (Detección de metilación aberrante del gen p16 en el plasma y suero de pacientes con cáncer de hígado). Cancer Res 1999;59: Begum S, Brait M, Dasgupta S, Ostrow KL, Zahurak M, Carvalho AL, et al. An epigenetic marker panel for detection of lung cancer using cell-free serum DNA (Un panel marcador epigenético para la detección de cáncer de pulmón mediante el uso de ADN en suero de célula libre). Clin Cancer Res 2011;17: Lo YMD, Chan LYS, Lo KW, Leung SF, Zhang J, Chan AT, et al. Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma (Análisis cuantitativo de ADN del virus Epstein-Barr de células libres en plasma de pacientes con carcinoma nasofaríngeo). Cancer Res 1999;59: Leary RJ, Kinde I, Diehl F, Schmidt K, Clouser C, Duncan C, et al. Development of personalized tumor biomarker using massively parallel sequencing (Desarrollo de biomarcador de tumor personalizado mediante secuenciación masiva en paralelo). Sci Transl Med 2010;2: McBride DJ, Orpana AK, Sotiriou C, Joensuu H, Stephens PJ, Mudie LJ, et al. Use of cancerspecific genomic rearrangements to quantify disease burden in plasma from patients with solid tumors (Uso de reestructuraciones genómicas específicas del cáncer para cuantificar la carga de la enfermedad en plasma de pacientes con tumores sólidos). Genes Chromosomes Cancer 2010;49: Lo YMD, Chiu RWK. Genomic analysis of fetal nucleic acids in maternal blood (Análisis genómico de ácidos nucleicos fetales en sangre materna). Annu Rev Genomics Hum Genet 2012; 13: Chiu RWK, Chan KCA, Gao Y, Lau VYM, Zheng W, Leung TY, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma (Diagnóstico prenatal no invasivo de aneuploidía cromosómica fetal mediante secuenciación genómica masiva en paralelo de ADN en plasma materno). Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105: Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, Haddow JE, Neveux LM, Ehrich M, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study (Secuenciación de ADN de plasma materno para detectar el síndrome de Down: un estudio de validación clínica internacional). Genet Med 2011;13: Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD, Abuhamad AZ, Sehnert AJ, Rava RP. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing (Detección de aneuploidía fetal de genoma completo mediante secuenciación de ADN en plasma materno). Obstet Gynecol 2012; 119: Lo YMD, Chan KCA, Sun H, Chen EZ, Jiang P, Lun FMF, et al. Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus (Secuenciación de ADN en plasma materno que muestra el perfil mutacional y genético de genoma completo del feto). Sci Transl Med 2010;2: Kitzman JO, Snyder MW, Ventura M, Lewis AP, Qiu R, Simmons LE, et al. Noninvasive wholegenome sequencing of a human fetus (Secuenciación no invasiva de genoma completo de un feto humano). Sci Transl Med 2012;4: Chan KCA, Zhang J, Hui AB, Wong N, Lau TK, Leung TN, et al. Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma (Distribuciones de tamaño de ADN fetal y materno en plasma materno). Clin Chem 2004;50: Li R, Yu C, Li Y, Lam TW, Yiu SM, Kristiansen K, Wang J. SOAP2: an improved ultrafast tool for short read alignment (SOAP2: una herramienta ultra-rápida mejorada para alineamiento de lectura corta). Bioinformatics 2009;25: Kathiresan S, Voight BF, Purcell S, Musunuru K, Ardissino D, Mannucci PM, et al. Genome-wide association of early-onset myocardial infarction with single nucleotide polymorphisms and copy number variants (Asociación de genoma completo de infarto de miocardio de inicio temprano con polimorfismos de nucleótido único y variantes del número de copias). Nat Genet 2009; 41: Korn JM, Kuruvilla FG, McCarroll SA, Wysoker A, Nemesh J, Cawley S, et al. Integrated genotype calling and association analysis of SNPs, common copy number polymorphisms and rare CNVs (Análisis de asociación e invocación del genotipo integrado de SNP, polimorfismos comunes de número de copias y CNV poco comunes). Nat Genet 2008;40: De Keersmaecker K, Real PJ, Gatta GD, Palomero T, Sulis ML, Tosello V, et al. The TLX1 oncogene drives aneuploidy in T cell transformation (El oncogén TLXI conduce a la aneuploidía en transformación de la célula T). Nat Med 2010;16: Dohm JC, Lottaz C, Borodina T, Himmelbauer H. Substantial biases in ultra-short read data sets from high-throughput DNA sequencing (Sesgos considerables en grupos de datos de lectura muy corta de secuenciación de ADN de alto rendimiento). Nucleic Acids Res 2008;36:e Alkan C, Kidd JM, Marques-Bonet T, Aksay G, Antonacci F, Hormozdiari F, et al. Personalized copy number and segmental duplication maps using next-generation sequencing (Número de copias personalizadas y mapeos de duplicación segmentada mediante secuenciación de nueva generación). Nat Genet 2009;41: Chen EZ, Chiu RW, Sun H, Akolekar R, Chan KC, Leung TY, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 18 and trisomy 13 by maternal plasma DNA sequencing (Diagnóstico prenatal no invasivo de trisomía fetal 18 y trisomía 13 mediante secuenciación de ADN en plasma materno). PLoS One 2011;6:e Minoche AE, Dohm JC, Himmelbauer H. Evaluation of genomic high-throughput sequencing data generated on Illumina HiSeq and genome analyzer systems (Evaluación de datos de secuenciación genómica de alto rendimiento generados por Illumina HiSeq y sistemas analizadores del genoma). Genome Biol 2011;12:R Krzywinski M, Schein J, Birol I, Connors J, Gascoyne R, Horsman D, et al. Circos: an information aesthetic for comparative genomics (Circos: estética de la información para genómica comparativa). Genome Res 2009;19: Chiu RW, Akolekar R, Zheng YW, Leung TY, Sun H, Chan KC, et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study (Evaluación prenatal no invasiva de trisomía 21 por secuenciación de ADN en plasma materno multiplexado). BMJ 2011;342:c Lo YMD, Lun FMF, Chan KCA, Tsui NBY, Chong KC, Lau TK, et al. Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy (PCR digital para la detección molecular de aneuploidía fetal cromosómica). Proc Natl Acad SciUSA2007;104: Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S, Larkin J, Endesfelder D, Gronroos E, et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing (Heterogeneidad intratumoral y evolución ramificada demostrada mediante secuenciación de varias regiones). N Engl J Med 2012;366: Liao GJ, Lun FM, Zheng YW, Chan KC, Leung TY, Lau TK, et al. Targeted massively parallel sequencing of maternal plasma DNA permits efficient and unbiased detection of fetal alleles (Secuenciación dirigida masiva en paralelo de ADN en plasma materno permite la detección eficiente e imparcial de alelos fetales). Clin Chem 2011;57: Lam KW, Jiang P, Liao GJ, Chan KCA, Leung TY, Chiu RW, Lo YMD. Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by targeted massively parallel sequencing of maternal plasma: application to -thalassemia (Diagnóstico prenatal no invasivo de enfermedades monogénicas mediante secuenciación masiva en paralelo de plasma materno: aplicación de la -talasemia). Clin Chem 2012;58: Clinical Chemistry 59:1 (2013) 225