RESOLUCIÓN OIV-OENO DETERMINACIÓN DE LA LISOZIMA EN EL VINO POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
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- Julio Alfredo Padilla Carmona
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1 RESOLUCIÓN OIV-OENO DETERMINACIÓN DE LA LISOZIMA EN EL VINO POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN LA ASAMBLEA GENERAL Visto el artículo 2, párrafo 2 iv, del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el que se crea la Organización Internacional de la Viña y el Vino A propuesta de la Subcomisión de Métodos de análisis, DECIDE completar el Anexo A del Compendio Internacional de métodos de análisis con el método tipo IV siguiente: Determinación de la Lisozima en el vino por cromatografía líquida de alta resolución Tipo de método: IV 1. Introducción Este método describe el procedimiento analítico para la determinación de lisozima en vinos blancos y tintos. Para vinos blancos la determinación se realiza directamente en la muestra, mientras que para vinos tintos es necesario llevar a cabo la disociación de la enzima de las macromoléculas polifenólicas, mediante una brusca alcalinización, utilizando como principio el carácter anfótero de la proteína. 2. Campo de aplicación Este método permite la cuantificación de la lisozima (mg de proteína L -1 ) presente en vinos blancos y tintos, independientemente de la actividad enzimática. Cabe aclarar que este método permite detectar una adición de lisozima en el vino pero el límite de detección del método no excluye ninguna alergenicidad asociado con la presencia de dosis bajas de lisozima. 3. Principio El análisis se realiza mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con un detector espectrofluorimétrico. El contenido desconocido en la muestra de vino se calcula en función del área del pico cromatográfico, utilizando el método del patrón externo. 1
2 4. Materiales y Reactivos 4.1 Solventes y soluciones de trabajo Acetonitrilo (CH 3 CN) calidad HPLC (CAS Nº ) Ácido trifluoroacético (TFA) (CAS Nº ) Agua desionizada calidad HPLC (CAS Nº ) Patrón de lisozima (CAS Nº ) Acido tartárico (CAS Nº ) Alcohol etílico (CAS Nº ) Tartrato neutro de potasio (CAS Nº ) Hidróxido de Amonio 28% p/p ( CAS Nº ) Filtros de acetato de celulosa de 0,65μm 4.2. Solución matriz: ácido tartárico 1g L -1 alcohol etílico 10% v/v ajustado a ph 3,2 con tartrato de potasio neutro Eluyentes A: CH 3 CN 1 %, TFA 0,2 %, H 2 O 98,8 % B: CH 3 CN 70 %, TFA 0,2 %, H 2 O 29,8 % 4.4. Solución de referencia Solución de 250 de lisozima patrón, disuelta en la solución matriz mediante agitación continua durante una hora. Se conserva en refrigeración como máximo 4 semanas Preparación de soluciones de trabajo Para las soluciones de trabajo, se diluye la solución de referencia hasta las concentraciones deseadas con solución matriz. Estas soluciones se preparan diariamente. 5. Equipo 5.1. Aparato HPLC con sistema de bombeo previsto para efectuar un gradiente de elución 5.2. Instalación para columna con termostato (horno) 5.3. Detector espectrofluorimétrico 5.4. Bucle de inyección, 20 μl 5.5. Columna polimérica de fase inversa con los grupos funcionales fenil (diámetro de los poros= Å, límite de exclusión = Da), Tosoh Bioscience TSK-gel Fenil 5PW RP 7,5 cm x 4,6 mm ID, a modo de ejemplo Pre-columna del mismo material que la columna, Tosoh Bioscience TSK-gel Fenil 5PW RP Guardgel 1,5 cm x 3,2mm ID, a modo de ejemplo. 6. Condiciones operativas (a modo de ejemplo) 6.1. Flujo del eluyente: 1 ml.min Temperatura de elución: 40 C 6.3. Detección espectrofluorimétrica: λ ex = 276 nm; λ em = 345 nm; Gain = Tiempo de retención promedio de la lisozima: 7,9 minutos. 2
3 Tiempo (min) Fase Móvil A (%) Fase Móvil B (%) , , ,00 Controller Stop 7. Preparación de la muestra 7.1 Vinos blancos Las muestras de vino blanco se filtran por filtros de acetato de celulosa de 0,65 μm y posteriormente se lleva a cabo el análisis cromatográfico. (En caso de utilizar filtros de nylon de 0,45 μm, la recuperación es menor). 7.2 Vinos tintos Las muestras de vino tinto (50 ml) se llevan a ph 11,5. La alcalinización se realiza con NH 4 OH (tener en cuenta el volumen de éste, para el cálculo final) inmediatamente (5 min) se filtra por filtros de acetato de celulosa de 0,65 μm y se inyecta en el cromatógrafo de líquidos. (En caso de utilizar filtros de nylon de 0,45 μm, la recuperación es menor). 8. Preparación de muestra control Se realiza una adición a la muestra con la solución patrón de referencia (4.4) y se prepara según el punto 7. Se determina el porcentaje de recuperación. 9. Expresión de Resultados El perfil cromatográfico del patrón de lisozima, mostró una adecuada resolución del analito en estudio, con las condiciones cromatográficas estipuladas (Fig.1 y Fig.4). El análisis de la muestra sin lisozima permitió observar el perfil del vino sin hallar interferencias en la zona de detección de la enzima (Fig.2 y Fig. 5). En vinos blancos la recuperación de la enzima supera el 95% (Fig.3) mientras que en vinos tintos el método desarrollado, mostró una recuperación que varía del 70% al 95% de la enzima, dependiendo este factor, de la concentración de polifenoles presente en la muestra de vino (Fig. 6). El resultado se expresa en miligramos por litro ( ). 3
4 Fig.1 Cromatograma del patrón de lisozima de 10. Fig.2 Cromatograma de un vino blanco sin lisozima. Fig.3 Cromatograma de un vino blanco con 10 lisozima. 4
5 Fig.4 Cromatograma del patrón de lisozima de 50. Fig.5 Cromatograma de un vino tinto sin lisozima. Fig.6 Cromatograma de un vino tinto con 50 lisozima. 5
6 Áreas 10. Procedimiento analítico en vinos blancos 10.1 Parámetros de Validación Interna Repetibilidad La repetibilidad del método se estudió en el intervalo de 2 a 25 en vino blanco. Se analizaron por duplicado 17 muestras de vino blanco adicionadas con distintas concentraciones de lisozima. Los resultados obtenidos para la repetibilidad a un nivel de probabilidad del 95% fueron los siguientes: El límite de repetibilidad medio (r) es de 1, Linealidad Concentración medida en Sr r (2,8xSr) 2 0,25 0,7 5 0,30 0, ,42 1,1 15 0,61 1,7 25 0,40 1,12 Para el cálculo de la linealidad se realizaron 30 medidas de las áreas de pico de 6 concentraciones distintas de lisozima en vino blanco, siendo éstas, blanco de vino sin lisozima, 2, 5, 10 mg L - 1, 15, 25, con las cuales se calculó la ordenada en el origen, la pendiente y el coeficiente de correlación y = x R² = 0, Concentración de lisozima en mg.l -1 Figura 7: Rango dinámico de lisozima en vinos blancos hasta 25 6
7 Límite de Detección y Límite de Cuantificación El límite de detección obtenido para este método fue calculado mediante el procedimiento gráfico derivado del ruido del fondo del registro. Los valores obtenidos fueron los siguientes: LD: 0,49 LQ: 1, Reproducibilidad intralaboratorio Se estudió la reproducibilidad intralaboratorio del método en el intervalo de 2 a 25 en una muestra de vino blanco durante un período de 30 días. Cabe aclarar que debido a la inestabilidad del analito, la muestra de vino es dosificada con solución de referencia de lisozima (4.4) en el mismo día de su análisis. Se realizaron 16 mediciones a intervalos regulares. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Concentración medida en SR R (2,8xSR) 2 0,19 0,53 5 0,36 1,0 10 0,48 1,3 15 0,64 1,8 25 0,93 2,6 El límite de Reproducibilidad medio (R) es de 1,45 7
8 11. Procedimiento analítico en vinos tintos 11.1 Parámetros de Validación Interna Repetibilidad La repetibilidad del método se estudió en el intervalo de 5 a 25 en vino tinto. Se analizaron por duplicado 21 muestras de vino tinto adicionadas con distintas concentraciones de lisozima. Los resultados obtenidos para la repetibilidad a un nivel de probabilidad del 95% fueron los siguientes: El límite de Repetibilidad medio (r) es de 1, Linealidad Concentración medida en Sr r (2,8xSr) 5 0,38 1, ,64 1, ,59 1, ,30 0,8 Para el cálculo de la linealidad se realizaron 25 medidas de las áreas de pico de 5 concentraciones distintas de lisozima en vino tinto, siendo éstas, blanco de vino sin lisozima, 5, 10, 15, 25, con las cuales se calculó la ordenada al origen, la pendiente y el coeficiente de correlación. Figura8: Rango dinámico de lisozima en vinos tintos hasta 25. 8
9 Límite de Detección y Límite de Cuantificación El límite de Detección fue calculado mediante el procedimiento gráfico derivado del ruido del fondo del registro. Los valores obtenidos fueron los siguientes: LD: 0,88 LQ: 2, Reproducibilidad intralaboratorio Se estudió la reproducibilidad intralaboratorio del método en el intervalo de 5 a 25 en una muestra de vino tinto durante un período de 30 días. Cabe aclarar que debido a la inestabilidad del analito, la muestra de vino fue dosificada con solución de referencia de lisozima (4.4) en el mismo día del análisis. Se realizaron 16 mediciones a intervalos regulares. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Concentración medida en SR R (2,8xSR) 5 0,4 1, ,91 2, ,54 1,5 25 0,53 1,5 El límite de Reproducibilidad medio (R) es de 1,7 mg L Bibliografía 1. Resolución OENO 8/2007 Determinación de la lisozima en el vino por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (2007). 2. Resolución OENO 10/2005 Guía práctica para la validación, el control de calidad y la estimación de la incertidumbre de un método de análisis enológico alternativo. 9
A. El punto 3 del método Reactivos queda de la siguiente manera:
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