UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA: LISTERIA MONOCYTOGENES EN ALIMENTOS

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1 UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA: LISTERIA MONOCYTOGENES EN ALIMENTOS MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADO EN TECNOLOGÍA MÉDICA ALUMNO: BRUNO GERMAN BIERE CONTRERAS. PROFESOR GUÍA: T.M. MSc. PEDRO BREVIS AZÓCAR. TALCA-CHILE 2010

2 INDICE I. Resumen. 1 Página II. Introducción. 2 III. Objetivos Objetivo General. 3.2 Objetivos Específicos. IV. Revisión Bibliográfica Género Listeria Taxonomía Listeria monocytogenes Serovariedades Epidemiología Fisiopatogenia de la Infección por Listeria Características Clínicas Listeriosis Materno-fetal y Neonatal Listeriosis en Adultos Diagnóstico Tratamiento Factores de Virulencia Etapas ciclo infectivo Incidencia y Sobrevivencia en Alimentos Leche, Quesos y otros derivados lácteos Carnes crudas y Carnes procesadas listas para comer Verduras y Hortalizas Pescados y Mariscos. 44

3 4.7 Situación en Chile Antecedentes de Listeria monocytogenes en Chile Brotes de Listeriosis en Chile Normativa Vigente Medidas Sanitarias Propuestas Métodos de Detección en Alimentos Método de enriquecimiento según FDA/BAM Método de enriquecimiento según norma ISO Procedimiento de siembra e aislamiento Procedimiento de Identificación Bioquímica Tipificación y Genotipificación Enumeración Sensibilidad a Antibióticos. 66 V. Conclusión. 71 VI. Bibliografía. 73

4 INDICE DE TABLAS Página TABLA 1. SEROLOGÍA DE LAS DISTINTAS ESPECIES 7 DEL GÉNERO LISTERIA. TABLA 2. PRODUCTOS GENÉTICOS DE LISTERIA 29 MONOCYTOGENES QUE SON DIRECTAMENTE REGULADOS POR PrfA. TABLA 3. INCIDENCIA DE LISTERIA MONOCYTOGENES 35 EN PRODUCTOS LÁCTEOS. TABLA 4. INCIDENCIA DE LISTERIA MONOCYTOGENES 40 EN PRODUCTOS CÁRNICOS. TABLA 5. INCIDENCIA DE LISTERIA MONOCYTOGENES 43 EN VEGETALES Y HORTALIZAS. TABLA 6. INCIDENCIA DE LISTERIA MONOCYTOGENES 46 EN PESCADOS Y MARISCOS. TABLA 7. CASOS NOTIFICADOS DE LISTERIA 50 MONOCYTOGENES ENERO-DICIEMBRE, CHILE TABLA 8. CASOS NOTIFICADOS Y FALLECIDOS POR 51 LISTERIA MONOCYTOGENES EN CHILE ENERO - DICIEMBRE DE TABLA 9. CASOS NOTIFICADOS 52 LISTERIA MONOCYTOGENES HASTA SEMANA EPIDEMIOLÓGICA 5, CHILE 2010.

5 TABLA 10. CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS PARA 53 LISTERIA MONOCYTOGENES. TABLA 11.TEST DE CAMP EN ESPECIES DE LISTERIA 61 TABLA 12. DIFERENCIACIÓN DE ESPECIES DE 62 LISTERIA. TABLA 13. MÉTODOS COMERCIALES UTILIZADOS 62 PARA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN ESPECÍFICA DE LISTERIA MONOCYTOGENES. TABLA 14.SEROTIPOS DE LAS ESPECIES DE LISTERIA 63

6 INDICE DE FIGURAS Página FIGURA 1. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE 15 LA PATOFISIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN POR LISTERIA. FIGURA 2. LISTERIA MONOCYTOGENES, DE SAPRÓFITO 30 A PATÓGENO INTRACELULAR. FIGURA 3. ETAPAS DEL PARASITISMO INTRACELULAR 32 DE LISTERIA. FIGURA 4. GRÁFICO CASOS DE LISTERIOSIS EN CHILE 52 AÑOS 2008, 2009, HASTA FEBRERO DE FIGURA 5. FLUJOGRAMA DE MÉTODOS DE 55 IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES. FIGURA 6.MÉTODO DE DETECCIÓN DE LISTERIA SEGÚN 58 NORMA ISO FIGURA 7: PRUEBAS DE IDENTIFICACION GENERO 61 LISTERIA.

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8 I. RESUMEN Aunque Listeria monocytogenes se ha considerado durante muchos años un patógeno de animales, su papel significativo como patógeno humano transmitido por alimentos sólo se hace evidente a partir de 1980, cuando comienzan a aparecer en la literatura informes documentados de brotes de listeriosis, detectados por consumo de alimentos contaminados. Hoy en día, L. monocytogenes se considera uno de los agentes más importantes de enfermedades de transmisión alimentaria. Las explicaciones posibles de la emergencia de la listeriosis humana transmitida por alimentos como un asunto del máximo interés de Salud Pública comprenden los cambios importantes en la producción, procesamiento y distribución de los alimentos, la utilización cada vez mayor de la refrigeración como medio de conservación primaria de los alimentos, los cambios en los hábitos de comida de la población, particularmente respecto a la comodidad de los alimentos ya preparados y un incremento del número de personas consideradas de alto riesgo de sufrir la enfermedad (ancianos, gestantes, recién nacidos, inmunodeprimidos). 1

9 II. INTRODUCCIÓN Las enfermedades causadas por Listeria monocytogenes son producidas por el consumo de alimentos contaminados con este microorganismo. Afecta principalmente a mujeres embarazadas, RN y hospederos inmunodeprimidos. Esta bacteria puede ser aislada del suelo, agua, vegetales y contenido fecal de una amplia gama de animales; es un contaminante común de alimentos frescos y procesados, de origen animal y vegetal. (Murray., et al ; Cordano., Rocourt. 2001) Es capaz de producir biofilm en alimentos, crece a temperaturas de refrigeración, resiste condiciones adversas de ph y altas concentraciones de NaCl. Dadas estas características y el hecho de ser ubicua, L. monocytogenes tiene muchas oportunidades de entrar a las líneas de producción de alimentos, ser de portación transitoria o enfermar a quienes los ingieren. (Murray., et al. 2002). Las pruebas convencionales para su identificación son: tinción de Gram, reacción de catalasa (+), oxidasa (-), hidrólisis de esculina (+), fermentación de glucosa y maltosa, motilidad (+) a 25 ºC que en medio semisólido se observa en forma de paraguas cercano a la superficie. La prueba de CAMP es (+). ( Hitchins.1998.BAM of the FDA). Es aislada en laboratorios clínicos, principalmente de muestras de LCR, liquido amniótico, y tejidos materno/fetales. Al Gram se observa como bacilo Gram positivo corto, regular, no esporulado, que crece con facilidad en medios enriquecidos con sangre de cordero. Las colonias son pequeñas, blanco grisáceas y presentan hemólisis. (Vasquez-Boland., et al ). 2

10 Listeria monocytogenes tiene un patrón de susceptibilidad estable, generalmente es sensible a penicilina, ampicilina, aminoglucósidos, eritromicina, rifampicina, tetraciclina, cotrimoxazol, vancomicina e imipenem. Las cefalosporinas son inefectivas in vivo, y hay resistencia mediada por plásmidos a macrólidos y tetraciclinas. (Balsalobre., et al. 2004). En Chile, Listeria. monocytogenes está incluida en el reglamento de enfermedades de notificación obligatoria a través de la vigilancia de laboratorio, para lo cual se deben derivar las cepas aisladas de enfermedad invasora al Instituto de Salud Pública. (MINSAL, Chile ; Cordano., Rocourt ) 3

11 III. OBJETIVOS 3.1. Objetivo General Realizar una revisión bibliográfica de Listeria monocytogenes en alimentos Objetivos Específicos 1. Realizar un estudio bibliográfico actualizado sobre la epidemiología de la infección por Listeria monocytogenes y su incidencia en los alimentos. 2. Estudiar y actualizar sobre los mecanismos de infección y factores de virulencia propios de Listeria monocytogenes. 3. Actualización completa de métodos de detección de Listeria monocytogenes. 4

12 IV. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4.1 Género Listeria El género Listeria comprende seis especies: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. innocua, L. welshimeri y L. grayi. Las dos especies potencialmente patógenas son L. monocytogenes y L. ivanovii. Son bacterias Gram positivas con bajo contenido G+C, estrechamente relacionado con los géneros Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus. (Collins et al., 1991). Listeria spp. han sido aisladas de diferentes sitios ambientales, como; suelo, agua, efluentes, de una gran variedad de alimentos y de heces humanas y animales. El hábitat natural de estos microorganismos es probablemente la materia orgánica vegetal en descomposición y los rumiantes domésticos contribuyen al mantenimiento de Listeria spp. en el ambiente rural a través de un ciclo continuo de enriquecimiento oral-fecal. (Fenlon. 1999) Taxonomía El análisis filogenético basados en la secuencia de los rdnas 16S y 23S, han revelado que el género comprende dos grupos evolutivos, uno relativamente distante, correspondiente a Listeria grayi y el otro formado por las especies restantes, dentro de las cuales existen especies patógenas y especies no patógenas como Listeria innocua, Listeria seeligeri y Listeria welshimeri. La serie de genes de virulencia relacionados con el ciclo de vida intracelular (LIPI-1) está presente en el genoma de las especies patogénicas, y en Listeria seeligeri en la cual existe una disrupción de la autoregulación positiva en el proceso de activación del LIPI-1; lo que hace que la cepa no sea patógena. (Ruiz-Bolivar., et al. 2008). 5

13 El genoma completo de Listeria monocytogenes fue secuenciado en el 2001 y se encontró un cromosoma circular de 2.944,528 pb con un porcentaje de G + C de 39%. Se han identificado 2853 genes, sin embargo al 35.3% de estos no se les conoce función. Por otro lado, Listeria inoccua posee un único cromosoma circular de pb con un contenido promedio de G + C de 37%. Dentro del género Listeria, estas dos especies presentan un alto grado de homología en la secuencia del RNA ribosomal 16S (RNAr 16S), siendo las de mayor cercanía taxonómica. (Ruiz-Bolivar., et al. 2008) Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes es un bacilo Gram-positivo, anaeróbico facultativo, no esporulante, catalasa positivo, oxidasa negativo que crece fácilmente en agar sangre y produce ß-hemolisis incompleta. Además, posee un flagelo polar y exhibe una característica movilidad a 25 C. Listeria monocytogenes, semeja morfológicamente a los difteroides y por lo tanto puede ser interpretado erróneamente como un contaminante, si los cultivos no son examinados cuidadosamente. (Mylonakis., et al. 2002). 4.2 Serovariedades Existen hasta el momento 13 serovariedades reconocidas de Listeria monocytogenes; 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e y 7 (tabla1), clasificados en base a los antígenos somáticos (O) y flagelares (H). Sin embargo, tres de ellas (1/2a, 1/2b y 4b), han sido aisladas en más del 90% de los casos humanos y animales (Low., et al. 1993). Otras serovariedades, como la 1/2c, han sido encontradas como contaminantes de alimentos (Espaze et al., 1991). Algunas de estas serovariedades son compartidas por L. innocua y L. seeligeri. Por su parte, L. innocua está representada sólo por tres serovariedades y es considerada una variante no patógena de L. monocytogenes. ( Menudier,. et al. 1991) 6

14 TABLA 1. SEROLOGÍA DE LAS DISTINTAS ESPECIES DEL GÉNERO LISTERIA (Modificado desde Torres, K. et al. 2005) 4.3 Epidemiología Listeria monocytogenes no fue considerado un patógeno animal hasta fines de la década del 70. A principios de los años 80 emerge como uno de los patógenos humanos de origen alimentario más importante. A partir de ese momento, la literatura sobre Listeria comenzó a incrementarse y a partir de 1983 una serie de brotes epidémicos humanos en Norteamérica y Europa establecieron claramente a la listeriosis como una grave infección alimentaria. Los alimentos más frecuentemente asociados con brotes y con alto nivel de riesgo son quesos y productos lácteos, patés y salchichas, pescados ahumados, ensaladas y en general productos industrializados, refrigerados, listos para el consumo, sin requerimientos de cocción o calentamiento previo. Los alimentos se pueden contaminar en cualquier eslabón de la cadena productiva, así como también en el almacenamiento en frío. (Farber., et al. 1991). La incidencia de listeriosis varía entre 0.1 y 11.3 / en diferentes países. La mayoría de los casos reportados presentan como enfermedad potencialmente peligrosa uno de los tres síndromes clínicos: listeriosis materno-fetal o listeriosis neonatal, infección del torrente sanguíneo, y la meningoencefalitis. Una mayor proporción de pacientes con infecciones del torrente sanguíneo tienen factores de riesgo subyacentes en comparación con los pacientes con meningoencefalitis. (Anonymous. 2004). 7

15 La listeriosis materno-fetal o neonatal que ocurre dentro de la primera semana de vida ("listeriosis neonatal de inicio temprano"), se cree, que el feto adquiere la infección en el útero a través de la migración transplacentaria del microorganismo desde el torrente sanguíneo de la madre. La madre suele experimentar síntomas de gripe no específica, mientras que el feto desarrolla una infección sistémica debido a que su sistema inmunológico no está lo suficientemente desarrollado. (Swaminathan., et al. 2007). La listeriosis humana es una enfermedad esporádica que se ve durante todo el año, aunque su pico de incidencia ocurre en los meses más cálidos. La tasa de mortalidad de las infecciones sintomáticas por listeria (20-30%) es más alta que la de casi todas las otras enfermedades transmitidas por los alimentos. (Murray., et al. 2002). La incidencia de la enfermedad es también desproporcionada en las poblaciones de alto riesgo, como los neonatos, los ancianos, las mujeres embarazadas y los pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), trasplante renal y tumores sólidos. (Murray., et al. 2002). Listeria monocytogenes puede vivir en el intestino de humanos, animales y aves por largos períodos de tiempo, sin causar infección. Se ha encontrado en más del 5% de las personas saludables, usualmente en el intestino. Por esta razón, la exposición a esta bacteria es inevitable. (Ramaswamy., et al. 2007). La listeriosis cutánea se caracteriza, por una piel eczematosa, producto de la infección causada por la exposición directa de la piel intacta a Listeria monocytogenes, por lo general ocurre en veterinarios expuestos a un animal enfermo, generalmente después de un aborto listerial. (Swaminathan., et al. 2007). 8

16 En 1979 se documentó el primer caso de listeriosis por brote alimentario ocurrido en 23 pacientes de un hospital de Boston. La evidencia epidemiológica sugirió fuertemente una asociación con el consumo de vegetales contaminados preparados dentro del hospital. (Gellin., et al. 1989). El seguimiento epidemiológico de este brote, mostró que la cepa de Listeria monocytogenes aislada, encontrada en coles contaminadas, era idéntica a la aislada de los pacientes infectados; proporcionando así, por primera vez la prueba definitiva de la transmisión por los alimentos. (Gellin., et al. 1989). Otros brotes de listeriosis han sido revisados, sin embargo, ciertas características de esas epidemias valen la pena destacar. Por ejemplo, los alimentos implicados en brotes de la enfermedad han variado de productos de origen vegetal en la década de 1980 a los productos lácteos a mediados de la década de 1980 y principios de (Farber., et al. 1991). Recientemente, la contaminación de alimentos listos para comer, carne y productos avícolas se han asociado con la transmisión de la enfermedad; incluido un brote en varios estados de Estados Unidos, debido al consumo de hot dogs contaminados, que afectó a 101 personas con una mortalidad del 21%. ( Donnelly. 2001). Además, si bien todos los brotes importantes de la enfermedad invasiva, han sido causados por un serotipo específico de Listeria monocytogenes (serotipo 4b), algunos estudios han indicado que este serotipo puede ser relativamente poco común en los alimentos crudos. ( Baek., et al ; Choi., et al ). Estudios recientes han determinado que el brote inicial de listeriosis fue causado por un grupo de cepas muy relacionadas designadas como Epidemic Clone I (ECI). Si bien el reciente brote en hot dogs fue causado por un clon divergente (ECII) que le falta la información genética encontrada en otras cepas serogrupo 4b. ( Wiedmann., et al ; Evans., et al ). En adición, en un análisis de 300 aislamientos clínicos de Listeria monocytogenes, el 96% expresó una longitud completa, presumiblemente una copia funcional de internalina A, una proteína requerida para la invasión de la célula huésped. En contraste, solo el 65% de los aislamientos a 9

17 partir de alimentos expresaron la forma longitudinal completa de la proteína internalina A. (Jacquet., et al. 2004). Otros estudios han demostrado que existen cepas de Listeria monocytogenes en tres linajes diferentes: Linaje I que contiene los clones epidémicos, serotipos 1/2b, 3b, 3c y 4b; el Linaje II contiene los clones asociados con la enfermedad esporádica humana, serotipos 1/2a, 1/2c y 3a, y por último el Linaje III que agrupa los serotipos 4a y 4c. (Wiedmann., et al. 1997). Un estudio reciente, llevado a cabo en Dinamarca, indicó que los factores que aumentaban el riesgo de contraer listeriosis también se relacionaron con la muerte por la enfermedad en pacientes menores de 70 años de edad. Por encima de esta edad, la presencia del factor predisponente no aumenta el riesgo de muerte. Posiblemente debido a la disminución de la función de células T con la edad; el paciente más joven que murió sin factores predisponentes, fue de 64 años de edad. Así, la tasa de letalidad fue dependiente de la presencia de factores predisponentes en los pacientes, sino que fue del 3% en el grupo de jóvenes sin factores predisponentes, el 24% en pacientes jóvenes con factores de riesgo, y el 20% en pacientes mayores de 70 años. Sólo la condición predisponente individual estuvo asociada estadísticamente con el incremento de la mortalidad, mediante un análisis multivariado en ese estudio, no fue la neoplasia hematológica. Sin embargo, el número de pacientes con cada condición predisponente fue baja, lo que hace que los resultados de este estudio no sean estadísticamente significativos. Este estudio no mostró diferencias en la tasa de letalidad entre los pacientes que sufren infecciones del torrente sanguíneo versus meningoencefalitis. (Gerner-Smidt., et al. 2005). El estudio danés también mostró una mayor tasa de mortalidad en pacientes infectados con Listeria monocytogenes serogrupo 4b, murieron en comparación con el 16% de los pacientes infectados con el serogrupo 1 / 2, lo que indica una vez más, que las cepas del serogrupo 4b pueden ser más virulentas. (Gerner-Smidt., et al. 2005). 10

18 A partir de los análisis genéticos a cepas de Listeria, surge una hipótesis que sugiere que distintos subgrupos de cepas se asocian con enfermedades humanas y que un grupo pequeño de clones son los responsables de las epidemias de listeriosis invasiva. Evidencia experimental sugiere que cepas de serotipo 4b pudieron haber incrementado la virulencia para los ratones, en comparación con otros serotipos. (Czuprynski., et al. 2002). Las diferencias en la virulencia entre las cepas también pueden influir en la infección y la evolución clínica. Los serotipos 1/2a, 1/2b y 1/2c son los tipos más frecuentemente aislados de los alimentos o del medio ambiente de producción de alimentos. Sin embargo, más del 95% de las infecciones en humanos son causadas por los serotipos 1/2a, 1/2b y 4b. La mayoría de los brotes de listeriosis son causados por cepas de serotipo 4b. (Swaminathan., et al. 2007). La tasa de aislamiento de serotipo 4b es mayor entre los pacientes con meningoencefalitis que en los pacientes que sufren de infección del torrente sanguíneo, lo que indica que las cepas de serotipo 4b pueden ser más virulentas que otros serotipos. (Swaminathan., et al. 2007). Otra característica interesante de la evolución de la listeriosis epidémica, es la reciente documentación de las epidemias de gastroenteritis febril en el cual, la enfermedad invasiva es el síntoma predominante de la infección. Estas epidemias se caracterizan por su aparición en personas sanas, que han sido infectadas por cepas del serotipo 1/2, así como por cepas serotipo 4b de corto periodo de incubación y por la presencia de niveles muy altos de Listeria monocytogenes en alimentos implicados. ( Ramaswamy., et al. 2007). Los alimentos listos para comer son otra fuente importante de brotes de listeriosis humana, brotes atribuibles a este grupo de alimentos incluyen un brote en los años en paté, en el Reino Unido. En los años 1992,1993 y brotes en 11

19 Francia, y en los años , 2000 y 2002 brotes en varios estados de Estados Unidos. (Swaminathan., et al. 2007). Los alimentos listos para consumir pueden estar contaminados a niveles bajos durante el proceso de fabricación, la Listeria monocytogenes tiene amplias posibilidades de multiplicarse a niveles peligrosos durante el almacenamiento refrigerado de los productos, durante su distribución y en el hogar del consumidor; ya que estos productos suelen ser completamente cocinados durante la fabricación y suelen ser consumidos sin calentar más o justo después del calentamiento. Presentan un alto riesgo para el consumidor, si se contaminan con Listeria monocytogenes en la planta de procesamiento. (Swaminathan., et al. 2007). Los alimentos listos para consumir, han sido objeto de varias evaluaciones de riesgo y han estado dirigidas específicamente para el control de Listeria por los organismos de regulación de alimentos y procesadores de alimentos. Las investigaciones epidemiológicas de los brotes de listeriosis invasiva son particularmente complejas por dos razones: (1) el tiempo de incubación largo (50-70 días) para la listeriosis invasiva, lo que hace muy difícil obtención del historial preciso de los alimentos y los pacientes, en particular de pacientes de edad avanzada, (2 ) debido a que la listeriosis afecta principalmente a las personas en situación inmunocomprometidos, la selección de controles apropiados para los estudios de casos y controles se vuelve problemático. (Olsen., et al. 2005). La incidencia de listeriosis ha ido disminuyendo en la mayoría de los países industrializados durante la última década. La incidencia de listeriosis esporádica ha disminuído en un 40% entre y 2004 a 2,7 casos por millón de personas en los Estados Unidos y un 68% entre 1987 y 1997 a 4,1 casos por millón de personas en Francia. Esto es más probable debido a la aplicación de medidas de control de Listeria en la industria alimentaria con la introducción de los principios HACCP para orientar la producción de alimentos, y la aplicación y el cumplimiento de criterios microbiológicos para Listeria monocytogenes en los alimentos con cero o baja tolerancia; en la mayoría 12

20 de los países para alimentos listos para consumir que favorecen el crecimiento del microorganismo, por ejemplo: embutidos, productos lácteos y pescados ahumados. (Swaminathan., et al. 2007). 3.4 Fisiopatogenia de la Infección por Listeria Después de la ingestión, Listeria monocytogenes atraviesa la barrera de la mucosa del intestino e ingresa a la circulación. La bacteria puede pasar de célula en célula mediante fagocitosis; porque puede ser fagocitada directamente de célula en célula. Listeria monocytogenes ingresa a la circulación si dañar la integridad del tracto gastrointestinal, el cual quizás no produce síntomas en algunos casos. Esta directa transferencia célula-célula también ocurre porque los anticuerpos, el complemento y los neutrófilos tienen un pobre rol en la lucha contra la listeriosis. (Posfay-Barbe., et al. 2004) Una vez en circulación Listeria monocytogenes es diseminada al hígado. Las células de Kupffer (macrófagos del hígado responsables de la respuesta inmune innata) eliminan el microorganismo del torrente sanguíneo. Sin embargo, algunas bacterias evaden las células de Kupffer e infectan los hepatocitos. Luego la bacteria se propaga de hepatocito en hepatocito creando un reservorio de infección en el hígado. (Ireton. 2007). El ingreso de la bacteria al hígado es promovido por proteínas de la superficie bacteriana, las cuales tienen afinidad por receptores de las células hepáticas. Una vez establecida en el hígado Listeria monocytogenes es diseminada al sistema nervioso central (SNC) y placenta. Listeria monocytogenes puede acceder al SNC por su habilidad de permanecer de forma intracelular. Similar al proceso de invasión del hígado, la bacteria ingresa a la placenta porque las proteínas de la superficie bacteriana tienen afinidad por los receptores celulares de la placenta. (Ireton. 2007). 13

21 La manifestación clínica de la enfermedad depende de la virulencia de la cepa, la cantidad ingerida y de la inmunidad del huésped. Los síntomas y signos comunes incluyen fiebre, dolores musculares, náuseas, vómitos y diarrea. Si Listeria monocytogenes ingresa al SNC puede causar dolores de cabeza, cuello rígido, confusión o ataques. (Ramaswamy., et al. 2007). El tiempo transcurrido desde la infección hasta la aparición de síntomas gastrointestinales es probablemente mayor que 12 horas. Sin embargo, la aparición de una enfermedad grave puede retrasarse varios días o hasta 3 semanas. El porcentaje de personas que están infectadas en comparación con los que se enferman gravemente se desconoce. (Ramaswamy., et al. 2007) Características Clínicas Los signos clínicos de la infección por Listeria monocytogenes son muy similares en todos los huéspedes susceptibles. Se pueden distinguir dos formas básicas de presentación: la listeriosis perinatal y listeriosis en el paciente adulto. En ambos casos, las formas clínicas predominantes corresponden a una infección diseminada o infección local en el sistema nervioso central (SNC) (figura 1). La listeriosis es generalmente una enfermedad muy grave que corresponde a una de las infecciones bacterianas más mortales que se conocen actualmente, con una tasa de mortalidad media en los seres humanos del 20-30% incluso más, a pesar del tratamiento temprano con antibióticos. (Vasquez-Boland., et al. 2001). 14

22 FIGURA 1. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA PATOFISIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN POR LISTERIA (Vasquez-Boland., et al. 2001) Listeriosis Materno-fetal y Neonatal Listeria monocytogenes es una de las tres causas principales de meningitis en los recién nacidos. Las manifestaciones clínicas pueden ser muy similares a las producidas por la infección por Streptococcus del grupo B, el cual presenta una alta tasa de mortalidad (30-50%). (Posfay-Barbe., et al. 2009; Vasquez-Boland., et al. 2001). Hay dos formas de listeriosis: 15

23 Inicio temprano En las embarazadas infectadas, a menudo los primeros síntomas de la enfermedad son similares a la gripe, que puede ser unos días antes del parto, el que a su vez puede ser prematuro. La bacteriemia por Listeria se presenta como una enfermedad febril aguda, que suele ir acompañada de mialgias, artralgias, dolor de espalda y dolor de cabeza. La enfermedad derivada de la maternidad se observa con mayor frecuencia en el tercer trimestre. La muerte neonatal ocurre en aproximadamente una quinta parte de las infecciones maternas. Dos tercios de los bebés que sobreviven al parto, en una mujer que padece de listeriosis durante el embarazo, desarrollarán la infección neonatal. (Posfay-Barbe., et al ; Vasquez-Boland., et al. 2001). Se cree que los bebés son infectados en el útero debido a la fase de bacteriemia en sus madres, pero las infecciones ascendentes también se han descrito. Las mayores concentraciones de Listeria monocytogenes se encuentran en el pulmón y el intestino, lo que sugiere que la infección también puede adquirirse en el útero a través de la inhalación y la ingestión de líquido amniótico infectado, así como por vía hematógena. (Posfay-Barbe., et al ; Vasquez-Boland., et al. 2001). Durante el parto, el líquido amniótico teñido de color marrón es indicio de infección y la fiebre materna puede estar presente. Los serotipos 1a y 1b son los más comunes. La aparición de los síntomas es de aproximadamente 1,5 días después del nacimiento. Un cuadro similar a sepsis es predominante, pero otras manifestaciones comunes son: dificultad respiratoria aguda, neumonía y rara vez, meningitis o miocarditis. Las estrategias implementadas para prevenir la sepsis del recién nacido por Streptococcus del grupo B disminuyen la tasa de infección listerial de inicio precoz. (Posfay-Barbe., et al ; Vasquez-Boland., et al. 2001). 16

24 La Granulomatosis infantiséptica de rápida difusión es una característica de la enfermedad listerial severa. Las lesiones son más frecuentes en el hígado, la piel y la placenta, pero también aparecen en el cerebro, las glándulas suprarrenales, bazo, riñón, pulmones y tracto gastrointestinal. La aspiración de líquido infectado puede contribuir a la insuficiencia respiratoria aguda y compromiso hemodinámico en el recién nacido. (Posfay-Barbe., et al ; Vasquez-Boland., et al. 2001). Inicio tardío Esta forma de listeriosis neonatal es menos común que la forma de inicio temprano, pero ocurre con más frecuencia en los recién nacidos a término que son producto de embarazos sin complicaciones. Los bebés son sanos al nacer, y la historia materna suele ser normal. Las primeras manifestaciones de la infección aparecen varios días o semanas después del nacimiento con una media de aparición de la enfermedad en 14,3 días después del nacimiento. La manifestación clínica más probable en este grupo es la meningitis más que la sepsis; pero puede ser sutil, con fiebre, irritabilidad, anorexia, diarrea y letargo. La transmisión postparto se supone que ocurre ya sea durante el parto o de forma nosocomial o intrahospitalaria. El serotipo 4b es el más frecuente en la enfermedad de inicio tardío (Posfay-Barbe., et al. 2009). La revisión de dos series de casos han examinado la presentación clínica de la listeriosis una serie contenía 11 casos confirmados por cultivo y 211 casos de Listeria monocytogenes en la literatura. La otra serie incluyó 722 casos de Listeria monocytogenes confirmadas por el cultivo, o cuando el médico sospecha de Listeria monocytogenes como la causa de la enfermedad. En las dos series de casos revisados, del 10% al 20% de las mujeres tuvieron abortos espontáneos o muertes fetales, y de los casos restantes, 68% desarrolló infección neonatal. La serie de 222 casos observó la infección neonatal por separado. Aquellos niños que presentaron infección neonatal, el 62,8% se recuperó por completo, el 12,7% tenía secuelas a largo plazo, y el 24,5% murió. (Delgado. 2008). 17

25 Actualmente, en la literatura se describe un caso, de una mujer embarazada con gestación múltiple que cursa con listeriosis. El caso es interesante ya que hay una diferencia en la sobrevida final de ambos fetos. Mientras que un feto muere en el útero durante la semana 13 de gestación; el otro feto logra terminar el periodo gestacional y nació sin daño evidente. El riesgo de listeriosis en mujeres embarazadas con gestaciones múltiples es mayor que en las mujeres con embarazos únicos. ( Al-Tawfiq. 2008) En un estudio de 301 mujeres embarazadas con listeriosis perinatal, 12 casos (4%) ocurrieron en mujeres embarazadas con gestación múltiple. La tasa de listeriosis en mujeres embarazadas por cada nacidos vivos y muertes fetales fueron de 19,8 en embarazos únicos y de 74,9 en gestaciones múltiples. (Razón de riesgo 3,8; intervalo de confianza del 95% IC 2.1 hasta 6.8) ( Al-Tawfiq. 2008) Listeriosis en Adultos La infección más frecuente en el adulto es la invasión del sistema nervioso central (SNC) (55 al 70% de los casos). Desarrolla generalmente como meningoencefalitis acompañada por cambios severos de la conciencia, desordenes del movimiento y en algunos casos parálisis de los nervios craneales. La mortalidad de la infección del SNC es del 20%, pero puede ser del 40 al 60% si está asociada a una enfermedad de base. En ciertos grupos de riesgo, como enfermos de cáncer, Listeria monocytogenes es la causa más frecuente de meningitis bacteriana (Lorber. 1996). Otra forma frecuente de listeriosis es la bacteriemia o septicemia que tiene una alta tasa de mortalidad (hasta el 70%), si está asociada a una enfermedad inmunosupresiva. Hay otras formas clínicas atípicas (5 al 10% de casos) tales como endocarditis, miocarditis, arteritis, neumonía, pleuritis, hepatitis, colecistitits, peritonitis, abscesos localizados, artritis. En vacas la forma más frecuente es la mastitis (Blenden., et al. 1987). Investigaciones de brotes alimentarios han dado la evidencia de que un síndrome gastrointestinal es la manifestación clínica de la infección por Listeria monocytogenes. (Aureli., et al. 2000). 18

26 Un estudio retrospectivo, realizado en el hospital de Cabueñes, en el Pricipado de Asturias, España; muestra 10 casos de listeriosis en adultos. El rango de edad fue de 28 a 81 años con una media de 54 y predominio masculino (80%). Entre los antecedentes destacaba un hábito etílico mayor de 80gr de etanol/día en 5 pacientes (50%), neoplasias sólidas en 3 pacientes (30%), hemopatía en tratamiento inmunosupresor en 2 pacientes (20%), cirrosis hepática en 2 pacientes (20%), infección por VIH en 20% (2 episodios en el mismo paciente) y enfermedad de Crohn con corticoterapia en 1 paciente (10%). La adquisición fue comunitaria en el 80%, siendo el 20% de origen nosocomial. La forma de presentación más frecuente fue como sepsis primaria en 4 pacientes (40%) seguido de meningitis en 3 pacientes (30%) y formas localizadas en 3 casos (30%), 2 como peritonitis bacteriana espontánea (PBE) y uno como absceso abdominal. (Arias Miranda., et al. 2004) Los síntomas clínicos más frecuentes fueron fiebre, que se observó en todos los casos, seguido de síndrome meníngeo en un 30% y dolor abdominal en otro 30%. No se hallaron signos de romboencefalitis, afectación cerebelosa o formación de abscesos cerebrales en las afecciones meníngeas. La mortalidad, fue de un 40%, todos ellos portadores de neoplasia avanzada o cirrosis en estadio final. No se hallaron secuelas en los pacientes que se recuperaron. En la mortalidad del 40 %, el factor crítico fue el deterioro severo inducido por la enfermedad subyacente. (Arias Miranda., et al. 2004). 19

27 4.4.4 Diagnóstico La listeriosis usualmente se presenta con leucocitosis y rara vez con monocitosis. El aislamiento de Listeria spp. desde un sitio normalmente estéril define la enfermedad. Por lo general treinta y seis horas de incubación son necesarias para un crecimiento apropiado para su identificación. El patógeno es a menudo observado en la tinción de Gram del meconio de los recién nacidos infectados. Su presencia en el tracto gastrointestinal de los niños mayores puede ser común, pero difícil de demostrar porque el organismo es exigente y la flora normal abundante. El screening a partir de un cultivo de muestras de origen rectal o vaginal no es clínicamente útil. ( Posfay-Barbe., et al. 2009). El enriquecimiento en frío no es tan bueno como los medios selectivos para aislar el organismo a partir de las muestras que contienen especies múltiples (por ejemplo, en los alimentos o en las heces). Las pruebas rápidas de detección se basan en el uso de cualquiera de los anticuerpos monoclonales o hibridaciones de ácidos nucleicos, pero sólo logran identificar el género Listeria. ( Posfay-Barbe., et al. 2009). Cuando el sistema nervioso central SNC está infectado, el líquido cefalorraquídeo (LCR) suele ser purulento, con un recuento de leucocitos de /ul (0.1-10x 10 9 / L). los leucocitos polimorfonucleares predominan en el 70% de los casos, pero la gravedad de la respuesta inflamatoria no se correlaciona con el pronóstico. La tinción Gram del LCR es positiva en menos del 40% de los pacientes. Los niveles de proteína son por lo general elevados y valores mayores se correlacionan con un mal pronóstico. En el 60% de los casos, los niveles de glucosa en el LCR son normales, a diferencia de otras causas de meningitis bacteriana. Cuando hay una infección del sistema nervioso central SNC, los hemocultivos son positivos en el 60-75% de los pacientes. El test serológico para anti-listeriolisina O puede ayudar en el diagnóstico de listeriosis invasoras y no invasoras. ( Posfay-Barbe., et al. 2009). 20

28 La PCR es la única prueba utilizada para la detección rápida de Listeria monocytogenes en las muestras clínicas. El ensayo de PCR es especialmente útil cuando la administración previa de los agentes antimicrobianos pueda poner en peligro el crecimiento en el cultivo. Diversos protocolos de prueba fueron evaluados para las muestras de LCR y muestras de tejidos. La tinción de Gram y examen microscópico del líquido cefalorraquídeo LCR o meconio permite sólo un diagnóstico presuntivo. Para las muestras clínicas, la importancia de aislar el patógeno es un prerrequisito para una investigación epidemiológica y para un apropiado control de la infección. ( Allerberger., et al. 2009) Debido a que la listeriosis durante el embarazo es grave y de difícil diagnóstico, los hemocultivos deben ser considerados para cualquier mujer embarazada con antecedentes de fiebre, especialmente si se acompaña por síntomas similares a la gripe o gastrointestinales. ( Allerberger., et al. 2009) Las pruebas serológicas disponibles en el mercado en base a antígenos (reacción de Gruber-Widal con Listeria monocytogenes con suspensiones de antígeno O y H) no son pruebas de diagnóstico debido a la reactividad antigénica cruzada entre Listeria monocytogenes y otras bacterias Gram positivo, tales como, Staphylococcus, Enterococcus, y especies de Bacillus. ( Allerberger., et al. 2009). Estudios indican que los pacientes con listeriosis confirmada por cultivos, presentan niveles indetectables de anticuerpos. Los resultados serológicos positivos deben ser tratados con precaución y, en casos distintos de romboencefalitis, el diagnóstico exacto se basa en la detección del agente patógeno. Las respuestas serológicas a listeriolisina O (LLO) suponen ser más fiables. Actualmente, existen pruebas de ELISA comercialmente disponibles, para la detección de anticuerpos anti-llo IgG en suero y plasma humano. ( Allerberger., et al. 2009). 21

29 4.4.5 Tratamiento El éxito de la terapia antimicrobiana está influenciado por el particular comportamiento de Listeria monocytogenes. El antimicrobiano deberá llegar al interior de la célula hospedera para actuar. La segunda dificultad es que, frecuentemente, compromete el SNC y/o al feto. El antimicrobiano, entonces, deberá sortear una segunda dificultad: atravesar las barreras hemato-encefálica y/o placentaria. Listeria monocytogenes es sensible in vitro a varios antimicrobianos. Sin embargo, presenta resistencia natural a cefalosporinas de tercera generación, fosfomicina y quinolonas. (Larrain de la C., et al. 2008). La experiencia clínica muestra que amoxicilina o ampicilina, en dosis altas, son los fármacos de elección, tanto en madres como recién nacidos (RN). Su asociación con gentamicina ejerce un efecto sinérgico, siendo esta la mejor opción. (Hof. 2003). El tratamiento de elección, basado en datos clínicos observacionales, es ampicilina, siendo la bencilpenicilina G muy activa y probablemente de resultados similares. Muchos expertos recomiendan su asociación con gentamicina para lograr un efecto sinérgico, dada la actividad bacteriostática de los B-lactámicos sobre Listeria monocytogenes. Cotrimoxazol o sulfametoxazol-trimetoprim es la mejor alternativa para pacientes alérgicos a la penicilina, con la limitación de su uso durante el primer trimestre del embarazo, en que la toxicidad, por alterar el metabolismo del ácido fólico, es importante. En este caso, el uso de vancomicina o meropenem ( si es una alergia no grave a la penicilina), son alternativas a considerar. (Noriega., et al ; Scholing., et al. 2007). 22

30 Un estudio retrospectivo en 22 pacientes con compromiso del SNC sugirió que la combinación de ampicilina y cotrimoxazol puede ser más efectiva que la combinación de ampicilina y gentamicina. La duración del tratamiento depende del cuadro: se recomienda 2 semanas para bacteriemia, 3 semanas para meningitis, 6 a 8 semanas para absceso cerebral o encefalitis, y 4 a 6 semanas para endocarditis. (Noriega., et al. 2008). Un 70% de los casos diagnosticados y tratados oportunamente se recuperan completamente, aunque las secuelas son frecuentes en casos de romboencefalitis o absceso cerebral. La mortalidad reportada en pacientes hospitalizados por listeriosis invasora y deterioro de inmunidad celular importante, varía entre 20 y 30%, a pesar de tratamiento antibacteriano adecuado. Así mismo, aproximadamente 20% de las infecciones por Listeria sp. en mujeres embarazadas tiene como resultado la muerte fetal. No se han reportado muertes en gastroenteritis por Listeria sp. (Noriega., et al. 2008). 23

31 3.5 Factores de Virulencia Listeria monocytogenes es un parásito intracelular facultativo que entra en el hospedador de forma primaria a través del intestino. En los últimos años se han identificado un gran número de factores de virulencia involucrados en los pasos clave de este ciclo de vida intracelular. (Dussurget., et al. 2004). El ciclo incluye la fagocitosis inducida por el propio patógeno, la lisis de la vacuola fagocítica, el movimiento en el citoplasma y la diseminación a las células vecinas (ver figura 1) (Vázquez-Boland., et al. 2001). El ciclo comienza con la adhesión a la superficie de la célula eucariota y la subsecuente penetración de la bacteria dentro de la célula hospedadora mediante fagocitosis. El único mecanismo conocido que permite la unión covalente de las proteínas de superficie de la pared celular de bacterias Gram positivas a la célula eucariota requiere proteínas con una secuencia conservada LPXTG (Leu-Pro-X-Thr- Gly, donde X es cualquier aminoácido). En el genoma de L. monocytogenes se han detectado 41 genes que codifican para proteínas LPXTG. (Braun., et al. 1997). Las primeras proteínas de este tipo identificadas fueron la internalina (o InIA) y la proteína InlB, codificadas ambas por el operon inlab; la primera interviene en la adhesión e invasión de células epiteliales polarizadas, como las intestinales, mientras que InlB lo hace en el caso de células epiteliales no polarizadas, como los hepatocitos. (Pizarro-Cerda., et al ; Lecuit., et al. 2001). 24

32 Posteriormente, se han descrito numerosos genes que codifican para proteínas del tipo de la internalina (inlc, inlc2, inld, etc). Existen muchas otras moléculas necesarias para la invasión y/o entrada de L. monocytogenes en la célula eucariota, entre las que se encuentran varias autolisinas (Ami, p60, Auto), una proteína fijadora de fibronectina (FbpA) y proteínas que también intervienen en fases posteriores del ciclo intracelular, como ActA y la hemolisina o listerolisina O (LLO). (Dussurget., et al ; Suarez., et al. 2001). Una vez fagocitada, la bacteria es capaz de escapar del ambiente hostil del fagosoma gracias a la secreción de LLO, una hemolisina activa a bajo ph codificada por el gen hly y activada por tiol. LLO reconoce el colesterol de la membrana, forma poros y favorece la lisis de la membrana del fagolisosoma, lo que provoca la emigración de L. monocytogenes al citosol de la célula hospedadora. (Kayal., et al ; Mengaud., et al. 1989). La hemolisina de L. ivannovii tiene características que la diferencian de LLO. (Gonzales-Zorn., et al. 2000). Además de esta toxina, L. monocytogenes secreta al medio extracelular dos fosfolipasas C asociadas con la virulencia, que pueden contribuir a dañar las membranas y a la correspondiente histolisis. Una de ellas, PI-PLC, tiene como sustrato específico al fosfatidilinositol (PI), está codificada por plca y es capaz de romper los anclajes glicosil-pi. La otra, PC-PLC es una lecitinasa codificada por plcb, que tiene un rango más amplio de sustrato, dado que hidroliza fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina (Vázquez-Boland., et al. 2001). La lecitinasa es activada y atraviesa la pared bacteriana gracias a una metaloproteasa específica (Mpl) codificada por el gen mpl. (Yeung., et al. 2005). 25

33 La glucosa actúa de represor de los genes de virulencia de L. monocytogenes (Ripio., et al. 1997). La glucosa-1-fosfato (G1P), que no produce este efecto, es el metabolito precursor y producto primario de degradación del glucógeno, por lo que es abundante en las células del mamífero. Se ha demostrado que la G1P es fundamental para el crecimiento intracelular de L. monocytogenes (Ripio., et al. 1997). La multiplicación intracelular precisa un transportador de hexosafosfato (Hpt), que es homólogo del transportador de glucosa-6-fosfato (G6P) de la célula eucariota responsable de la entrada de G6P en el retículo endoplásmico desde el citosol. (Chico-Calero., et al ; Goetz., et al. 2001). Esta proteína también es responsable de la entrada de fosfomicina en el interior de la célula bacteriana, lo que explica su sensibilidad in vivo asociada con resistencia in vitro.( Scortti., et al. 2006). Una vez alcanzado el citoplasma, la bacteria utiliza el citoesqueleto de la célula hospedadora para desplazarse en su interior. El movimiento intracelular tiene lugar como consecuencia de un ensamblaje direccional de monómeros de actina de la célula hospedadora en uno de los polos de la bacteria, fenómeno aparentemente dirigido por la proteína de superficie ActA (Suarez., et al. 2001). Finalmente, algunas bacterias alcanzan la periferia de la célula infectada, entran en contacto con la membrana celular y forman protuberancias hacia la célula colindante en forma de evaginaciones citoplasmáticas que contienen en su extremo una bacteria. Estas estructuras invasoras son fagocitadas y la bacteria queda encerrada en un fagosoma de doble membrana, en cuya rotura parece jugar un papel fundamental la lecitinasa. (Suarez., et al. 2001). Al ser un mecanismo que permite diseminación de la bacteria por los tejidos del hospedador, sin entrar en contacto con los efectores humorales del sistema inmune, este fenómeno de paso directo de célula a célula es crucial en la patogénesis de la infección que causa L. monocytogenes (Cossart., et al. 1989). Este mecanismo también es responsable de la formación de placas en los cultivos celulares, una característica que ha sido relacionada con la virulencia en ratones (Van Langendonck., et al. 1998). 26

34 La secuenciación en el año 2001 del genoma completo de la primera cepa de L. monocytogenes y su comparación con el genoma de L. innocua permitió determinar que un 10% de los genes son diferentes en la especie patógena respecto de la no patógena (Glaser, P., et al. 2001). La comparación de los genomas de las diferentes especies del género Listeria muestra que las especies no patógenas han evolucionado a partir de progenitores patógenos por reducción de sus genomas (Hain., et al. 2006). Posteriormente se compararon los genomas de otras cepas de L. monocytogenes ( de serotipo 1/2a y de serotipo 4b) (Nelson., et al. 2004). Ello permitió identificar genes específicos de serotipo, y establecer que un 8% de las secuencias eran específicas del serotipo 4b, que es una diferencia similar a la que existe entre L. monocytogenes y L. innocua ((Doumith., et al. 2004). De los 484 genes regulados durante el crecimiento intracelular de Listeria spp., 41 son específicos de L. monocytogenes, pero también existen 25 genes específicos del serotipo 1/2a que no están presentes en el genoma secuenciado de la cepa de serotipo 4b. (Hain., et al. 2006). Todos estos resultados podrían explicar el potencial específico para la virulencia del serotipo 4b. Se puede decir, por tanto, que la diversidad genética que existe entre algunos serotipos de L. monocytogenes es tan grande como la que existe entre algunas especies de Listeria (Dussurget., et al. 2004). El análisis mediante microarrays construidos a partir de estos resultados y empleando un número mayor de cepas ha permitido comprobar que la mayoría de los genes de virulencia están presentes en todas las cepas de L. monocytogenes, pero que existen numerosas secuencias específicas de los grandes grupos genéticos en que se divide esta especie (divisiones o linajes) y de los diferentes serotipos (Doumith., et al.2004). Incluso se ha detectado por primera vez que un gen implicado en la virulencia (aut) no está presente en el serotipo 4b, por lo que podrían existir más diferencias en la base genética de la virulencia de los distintos serotipos (Dussurget., et al. 2004). 27

35 Los genes de virulencia de L. monocytogenes se organizan dentro de unidades genéticas conocidas como islas de patogenicidad, que son adquiridas por la bacteria por mecanismos de transferencia genética horizontal, algunas veces como parte de un elemento genético móvil, por lo cual son importantes en la evolución bacteriana (Chakraborty, T., et al. 2000). Seis de los genes de los factores de virulencia responsables del parasitismo intracelular de L. monocytogenes (prfa, plca, hly, mpl, acta y plcb) están en una región del cromosoma de 9kb conocida como isla 1 de patogenicidad de Listeria (Listeria pathogenicity island 1, LPI-1) o (virulence gene cluster, vgc) (tabla 2). (Kreft., et al ; Vázquez-Boland., et al. 2001). La proteína reguladora PrfA es absolutamente indispensable para la expresión de la virulencia en las especies patógenas de Listeria ( figura 2) (Ripio., et al. 1997). La expresión del regulón de virulencia a través de PrfA depende de diversas señales ambientales (Gray., et al 2006). Estas señales de activación incluyen temperatura alta (37ºC), condiciones de estrés y secuestro de componentes del medio de crecimiento celular por carbón activado (Ripio., et al. 1996) ; por otro lado, y como ya se ha mencionado, la expresión de los genes de virulencia a través de PrfA también está sujeta a represión por catabolito. ( Ripio., et al ; Sokolovic., et al. 1993). A partir de la secuenciación del genoma de L. monocytogenes se han descubierto nuevos factores de virulencia, entre los que destacan nuevas proteínas de superficie del tipo de la internalina, las sortasas SrtA y SrtB (transpeptidasas que unen a la pared celular diferentes proteínas de superficie como la internalina), y una hidrolasa de sales biliares, BSH, que permite a la bacteria sobrevivir en el intestino y que no se encuentra en L.innocua (Dussurget., et al. 2004). Existe también una base de datos con los proteomas de Listeria, que facilita la asignación de funciones a los diferentes genes de los genomas secuenciados (Dieterich., et al. 2006). 28

36 TABLA 2. PRODUCTOS GENÉTICOS DE LISTERIA MONOCYTOGENES QUE SON DIRECTAMENTE REGULADOS POR PrfA. (Freitag, N.E., et al. 2009). GEN PRODUCTO PROTEICO FUNCIÓN hly Listeriolisina O (LLO). Citolisina formadora de poros que se requiere para la lisis del fagosoma. plca plcb Fosfolipasa C Fosfatidilinositol específica (PI-PLC). Fosfolipasa C Fosfatidilcolina (PC-PLC). Ayuda en la lisis del fagosoma. Un amplio sustrato fosfolipasa específico que ayuda en la lisis del fagosoma. mpl Mpl Una metaloproteasa dependiente de Zinc que transforma el precursor de PC-PLC a su forma madura. acta hpt Proteína inductora de ensamblaje de actina (ActA). Hexose phosphate transporter (Hpt). Estimula la actina intracelular para el movimiento de la bacteria. Requisito para un óptimo crecimiento intracelular. inla Internalina A (InlA) Contribuye a la invasión celular. inlb Internalina B (InlB) Contribuye a la invasión celular. InlC Internalina C (InlC) Contribuye a la virulencia bacteriana, se desconoce el rol exacto. prfa Positive regulatory factor A (PrfA). Requerido para la expresión de los factores de virulencia de L. monocytogenes. 29

37 FIGURA 2. LISTERIA MONOCYTOGENES, DE SAPRÓFITO A PATÓGENO INTRACELULAR. La activación de la PrfA (PrfA*) regula la expresión de los genes de virulencia de la bacteria, lo que ocurre una vez que la bacteria está dentro del hospedero. ( modificado de Freitag, N.E., et al. 2009) Etapas del Ciclo Infectivo (a) Adhesión e invasión: Las células de Listeria inicialmente se adhieren a los enterocitos intestinales y penetran la pared intestinal (Figura 3A y 3B). El proceso es mediado por la internalina (InlA) y (InlB) (otro miembro de la familia de internalinas, caracterizada por la presencia de unidades repetitivas de leucina) y/o otros factores de internalización. En respuesta, las bacterias quedan dentro del fagosoma en las células del huésped. La entrada de L. monocytogenes dentro de la célula humana es mediada por la interacción de la proteína de superficie, internalina, con su receptor humano E- caderina. La interacción internalina-e-caderina es especie específica y se basa en la presencia de un solo aminoácido de diferencia en el residuo 16 en la molécula de E- caderina, el cual es prolina en humanos y ácido glutámico en ratón. Evidencias epidemiológicas apoyan el rol de la internalina en la listeriosis humana, no 30

38 solo para atravesar la barrera intestinal, sino también para cruzar la barrera hematoencefálica y la placentaria. (Vasquez-Boland., et al ). (b) Vacuola primaria de lisis: La listeriolisina O (LLO) y la fosfolipasa C fosfatidil inositol específica (PI PLC) lisan el fagosoma para permitir el escape de las bacterias de la vacuola fagocítica (Figura 3C y 3D). (Vasquez-Boland., et al ). (c) Desarrollo intracelular: La propagación bacteriana dentro del citosol es mediada por un transportador de fosfato hexosa bacteriano (Hpt) y una ligasa protein lipoato (LpLA1) que permiten que L. monocytogenes capte de la célula huésped fuentes de carbono (Figura 3E y 3F). (Vasquez-Boland., et al ). (d) Diseminación de una célula a otra: Una vez que las bacterias se multiplicaron en el citosol de la célula huésped, se desplazan utilizando la nucleación de filamentos de una proteína, actina (ActA) (Figura 3G). Esto produce un movimiento dirigido de las bacterias hacia la membrana celular de la célula huésped y promueve estructuras semejantes a pseudopodos que se extienden dentro de las células vecinas. Este mecanismo hace que se infecte la célula y la bacteria quede dentro de una vacuola de doble membrana (Cossart., et al. 2003). (e) Lisis de la vacuola de doble membrana: La fosfolipasa C fosfatidilcolina específica (PC-PLC) de Listeria junto con la LLO lisan la vacuola de doble membrana y liberan las bacterias que infectan la célula vecina (Figura 3H). (Vasquez-Boland., et al ). 31

39 FIGURA 3. ETAPAS DEL PARASITISMO INTRACELULAR DE LISTERIA. (A) Esquema del ciclo de vida intracelular patogénico de Listeria spp. En orden contrario a las agujas de reloj: entrada en la célula huésped inducido por fagocitosis, residencia transitoria en una vacuola fagocítica, escape del fagosoma al citoplasma, replicación en el citosol y reclutamiento de la actina de la célula huésped en la superficie bacteriana, basado en la motilidad de la actina, formación de pseudópodos, fagocitosis de los pseudópodos por células vecinas, formación de un fagosoma de doble membrana, escape de este fagosoma secundario, y reiniciación de el ciclo. (B a H) Microscopía electrónica de barrido y de transmisión, en células de monocapa infectadas con L. monocytogenes. (B) Numerosas bacterias adheridas a las microvellosidades de células Caco-2 (30 min. después de la infección). (C) Dos bacterias en el proceso de invasión (células Caco-2, 30 min. post-infección). (D) Dos bacterias intracelulares poco después de la fagocitosis, aún rodeadas por las membranas de la vacuola fagocítica (células Caco-2, 1 hora post-infección). (E) bacterias de Listeria intracelulares libres en el citoplasma de la célula huésped, después del escape del fagosoma (células Caco-2, 2 horas post-infección). (F) Protrusión del pseudópodo inducidas por el movimiento de las células de Listeria, (4 horas post-infección). (G) Sección de un seudópodo, en la que una extensión fina de citoplasma de una célula infectada sobresale en a una célula vecina no infectada ( protrusión de doble membrana) (células Caco-2, 4 horas post-infección). (H) Bacteria en una doble membrana vacuolar formada durante la diseminación entre células (células Caco-2, 4 horas post-infección). Modificado de Vasquez-Boland, J.A., et al

40 4.6 Incidencia y Sobrevivencia en Alimentos Leche, quesos y otros productos lácteos La primera prueba seria de que los productos lácteos podían transmitir el patógeno e infectar al ser humano la proporcionaron un grupo de investigadores quienes estudiaron un brote que afectó a 49 personas, 7 casos ocurrieron en fetos o infantes y 42 en adultos inmunosuprimidos. Se implicó como fuente de infección el consumo de leche entera o parcialmente descremada, pasteurizada. Aunque no se logró aislar el agente causal en los cultivos de leche, se supo que en el ganado de donde se obtuvo la leche, se habían identificado casos de listeriosis veterinaria. (Fleming., et al ; Rebagliati., et al. 2009). Otro brote ocurrido a partir de leche pasteurizada en el cual 45 personas que comieron en un picnic en Illinois, el 9 de julio de 1994, desarrollaron fiebre y gastroenteritis la semana posterior al evento. La enfermedad fue asociada al consumo de leche chocolatada. De las 60 personas que consumieron la leche chocolatada, 45 (75%) presentaron la enfermedad. El promedio de edad de quienes desarrollaron la enfermedad fue de 31 (en un rango de 3-79) y para aquellos que no la desarrollaron fue de 24 ( 4-69). De todos, 19 (41%) fueron mujeres y 26 (59%) hombres. Cuatro personas de 1, 7, 49 y 77 años fueron hospitalizados por un total de ocho días, pero ninguno falleció. (Dalton., et al ; Rebagliati., et al. 2009). En Europa en el período comprendido entre 1994 y el año 2000 se notificó una incidencia ( tabla 3) anual de listeriosis humana de 0,2 y 0,8 casos/ En Europa, esto se traduce en a casos por año, con 320 a muertes. Este amplio rango en las incidencias puede deberse a las diferencias en los sistemas de notificación o a los brotes, que pueden aumentar marcadamente el número de casos. Entre 1991 y 2001, los casos reportados relacionados a brotes en Europa ascendieron a En los brotes y casos esporádicos de listeriosis, las fuentes de contaminación fueron productos lácteos: desde leche cruda hasta manteca elaborada con leche pasteurizada, incluyendo 33

41 varios tipos de quesos elaborados con leche sin pasteurizar (queso suave, queso fresco, queso azul de molde y queso tipo Brie). (Lundén., et al ; Rebagliati., et al. 2009). Se ha descrito un brote de listeriosis por consumo de queso estilo mexicano en el sur de California, el que afectó a 93 mujeres embarazadas y a 49 pacientes no embarazadas. La evaluación de este brote indicó que la causa más frecuente de la contaminación del queso era la utilización de leche cruda en su producción. Se hace notar que los quesos blandos estilo mexicano son quesos de pasta blanda que no requieren cocción, incluyéndose dentro de esta clasificación a los conocidos con el nombre de queso blanco, queso cremoso, queso fresco, queso "de hoja", queso crema y el queso "asadero". ( Linnan., et al ; Rossi., et al ; Rebagliati., et al. 2009). Un estudio en Chile, Listeria monocytogenes fue encontrada en varios tipos de alimentos; de las 603 muestras de helado analizadas 68 fueron obtenidas directamente del cono de cada comprador (5 contaminadas, correspondientes al 7.4%) y 535 fueron recolectadas a partir de una sola fábrica (16 contaminadas, correspondientes al 3%). Listeria monocytogenes fue aislada de 3 diferentes sabores de helado (vainilla, chocolate y pistacho) cuyas cepas aisladas fueron serotipo 4b, 1/2a, y 1/2b. ( Cordano., Rocourt. 2001). De todos los alimentos, es evidente que los quesos son contaminados con mayor frecuencia, en especial aquellos que tienen moho blanco. Estos tienen un ph mayor que la mayoría de los quesos en los estadios tardíos de maduración y, en consecuencia, son más propicios a la contaminación por esta bacteria. Hay estudios que indican que hasta 10% están contaminados con Listeria monocytogenes y que la prevalencia de este patógeno varía entre los diferentes tipos de quesos. En quesos blandos y semiblandos, la actividad de agua es mayor que en los duros, permitiendo el crecimiento de la bacteria. En quesos de molde, el ph se acerca a niveles neutros durante la maduración, lo que también estimula el crecimiento de Listeria monocytogenes. 34

42 Durante la producción de lácteos fermentados, la baja actividad de agua y bajo ph previenen la supervivencia y crecimiento de Listeria monocytogenes. (Rossi., et al ; Rebagliati., et al. 2009). TABLA 3. INCIDENCIA DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN PRODUCTOS LÁCTEOS. (FUENTE: Farber, J.M y Peterkin, P.I ; Torres, M.R ; Cordano, A.M. ; Rocourt, J ; Mena, C., et al ; Vitas, A.I., et al ; Chavez, C y Arias, M.L ) Alimento Incidencia País Leche cruda (Vaca) 1.0% de 1004 Alemania 45.3% de 95 España 4.4% de 137 Holanda 5.4% de 315 Ontario, Canadá 12.0% de 121 Estados Unidos 4.0% de 200 Nebraska, USA 55% de 294 México 4.2% de % de 6 6.8% de 340 Estados Unidos Portugal España. Leche en polvo 2.5% de 210 México Leche entera 0.57% de 350 Estados Unidos Leche baja en grasa 0.0% de 282 Estados Unidos Leche descremada 0.0% de 98 Estados Unidos Leche con chocolate Leche de cabra 1.2% de 415 3% de 202 Estados Unidos España Mantequilla 0.0% de 30 Estados Unidos 0.0% de 20 España Crema 0.0% de 52 Estados Unidos Mezcla de leche y crema 0.0% de 42 Estados Unidos Helado 3.79% de 659 Estados Unidos 3.5% de 603 Chile 2.0% de 150 Inglaterra Quesos Blandos 10% de 222 Gran Bretaña 0.8% de % de 110 1% de 99 Chile Costa Rica España Quesos blandos importados 14.5% de 69 Francia Queso fresco 23.0% de 100 4% de 50 México Portugal 7.0% de 115 México Queso duro 7.1% de 42 Alemania 0.0% de 155 Chile 35

43 4.6.2 Carnes crudas y carnes procesadas listas para comer Aunque Listeria monocytogenes se encontraba en los alimentos de manera ocasional en el pasado, sólo fue cuestión de tiempo para que llegara a establecerse como bacteria patógena transmitida por alimentos. Es bien conocido que algunos alimentos frescos de origen animal o vegetal pueden albergar números de Listeria monocytogenes. En general, el organismo ha sido aislado en leche cruda, quesos blandos, carne fresca y congelada, aves de corral, productos marinos y frutas y verduras. (Jay. 1995). Una amplia variedad de carnes están contaminadas con Listeria monocytogenes, la incidencia de la contaminación varía grandemente (tabla 4). Esta variación es debida en parte a las diferencias en los métodos de detección, los cuales comprenden factores como, el método empleado, tamaño de muestra, número de colonias seleccionadas y la fuente a partir de la cual son obtenidas las muestras. La mayoría de la contaminación es de tipo superficial. Sin embargo, en un estudio, se encontró Listeria monocytogenes en el interior del músculo en 110 muestras de carne de res, cerdo y cordero asado. Es probable que estos organismos estuvieran presentes en el músculo al momento del eviscerado. (Farber., Peterkin. 1991). En Estados Unidos, durante un período de 39 meses, fueron analizadas muestras de carne cruda de res en todo el país, las cuales mostraron una positividad a Listeria monocytogenes del 7.1%, mientras que durante un período de 21 meses, 3700 muestras de cuellos y espinazos de pollo fueron positivos a este patógeno en un 19.3%. Así mismo, se analizaron muestras de diversas carnes listas para consumo provenientes de plantas empacadoras distribuidas por todo Estados Unidos, encontrándose un 2.8% de incidencia a Listeria monocytogenes. (Jay. 1995). 36

44 La carne cruda de pollo también parece presentar niveles altos de contaminación por Listeria monocytogenes, como lo muestran los estudios, los índices oscilan entre el 12 y 70%. Estudios realizados en el Reino Unido, revelaron que la bacteria estaba presente en un 57% de 35 muestras de carne cruda de pollo y en el 60% de 100 muestras de pollo congelado. En Francia se han reportado un 45% de positividad en pollo crudo y de bajo cocimento, y un 26% para carne de res picada congelada (Jay. 1995). Algunas investigaciones han reportado la influencia del ph de las carnes en el desarrollo de Listeria. Estudios demuestran la influencia del ph como un factor determinante en la multiplicación del microorganismo en los tejidos crudos de res; para lo cual modificaron el ph natural de la carne cruda de res de 5.7 a 7.6. Se observó un crecimiento superior a 1 log UFC/100 ml en las muestras con ph 7.6 respecto al ph 5.7 (Jay. 1995). En general, el microorganismo es capaz de sobrevivir en la carne sin importar el tratamiento, por ejemplo la congelación, deshidratación, etc. La bacteria ha mostrado capacidad para crecer en carne de res empacada en aerobiosis y al vacío, crece mas lentamente en pechuga de pollo empacada al vacío que en muestras con películas plásticas. (Farber., Peterkin. 1991). La carne cruda y carnes procesadas de cerdo han sido la fuente de brotes de listeriosis en Francia y en otros países europeos durante la última década. La prevalencia de Listeria monocytogenes aumenta generalmente de la granja a las plantas de fabricación y esto debido principalmente a la contaminación cruzada. En muchos casos, este patógeno está presente en la carne de cerdo cruda en niveles bajos o moderados, pero los alimentos implicados en brotes de listeriosis son aquellos en los que el organismo se ha multiplicado hasta alcanzar niveles significativamente superiores a 1000 UFC/gr. En tales casos, Listeria monocytogenes ha sido capaz de sobrevivir y crecer a pesar de los obstáculos encontrados durante el proceso de fabricación y conservación (Thévenot., et al. 2006). 37

45 En un estudio Español, de un total de 295 muestras de carne fresca y 158 muestras de carne fresca de pollo, se tomaron muestras de 20 unidades pequeñas de procesamiento de carne. Las muestras fueron compradas periódicamente durante un período de 2 años. De cada unidad, diferentes tipos de carnes frescas fueron adquiridas (la totalidad de la carne de la vaca, ternera, cerdo, aves de corral y carne molida, como hamburguesas y salchichas) para estudiar la contaminación cruzada durante el procesamiento. Con respecto al grupo de productos crudos, la incidencia de contaminación por Listeria monocytogenes fue muy alta en los productos cárnicos (62,3% en carne de cerdo molida y 76,3% en carne de aves de corral). Del mismo modo, la mayor incidencia de Listeria monocytogenes se detectó en estos productos (34,9% y 36,1%, respectivamente). (Vitas., et al. 2004). Por otro lado, la incidencia de Listeria monocytogenes en productos cárnicos procesados se observó en las carnes cocidas, con una incidencia del 18,2% de Listeria spp. Vale la pena señalar que Listeria monocytogenes se aisló en 18 de las 55 tiendas de prueba, y 5 de los establecimientos positivos presentaron contaminación repetida (17 de los 35 aislamientos fueron de estos cinco establecimientos). El serotipo 1/2a fue predominante en productos de carne cocida. Por otra parte, serotipo 1/2c fue el serotipo más frecuentemente aislado en los productos cárnicos crudos (35,9%); el serotipo 1/2b se encontró en muestras de aves de corral (36,8%). (Vitas., et al. 2004). En otros Países Europeos y en Estados Unidos, se aplica la tolerancia cero a la presencia de Listeria monocytogenes en 25 gramos de estos productos cuando la vida media útil es más larga que una semana, pero en períodos más cortos, por el tipo de alimento, el nivel de tolerancia puede ser <100 UFC/g. (Vitas., et al. 2004). En un estudio Iraní, la incidencia de Listeria spp. en diversos tipos de carnes rojas, aves de corral y los productos del mar. De un total de 332 muestras examinadas, 21 (6,33%) fueron positivas para Listeria spp. ; las muestras de carne congelada de aves de corral y las muestras de pescado congelado estaban libres de Listeria spp. 38

46 Por otro lado 47 muestras (14,2%) de carne congelada de vacuno estaban contaminadas con Listeria monocytogenes. Dentro de las especies de Listeria spp. Además de Listeria monocytogenes, Listeria innocua se detectó en el 2,6% de carne fresca de vacuno, un 7,6% de la carne de ovino molida, 4,5% en carne fresca de aves de corral, un 1,6% en pescado fresco, un 8,3% de los camarones y en el 18% de las hamburguesas. Por su parte Listeria monocytogenes fue aislada de un 14,2% de carne de vacuno congelada, el 2,6% de la carne fresca y el 6% de carne de ovino. Listeria seeligari también se detectó en el 7,8% de la carne fresca y en el 6% de las muestras de carne de ovino. Además 27 muestras de carne de camello se analizaron por primera vez en Irán, todas las muestras libres de Listeria spp. (Jalali., et al. 2008). Un estudio en Chile, de 634 productos cárnicos procesados analizados entre los años 1900 y 1997, 521 eran productos, listos para comer (11 contaminados, 2.1%) y 113 fueron salchichas crudas, de las cuales 12 estaban contaminadas (10.6%). Cepas de Listeria monocytogenes serotipo 1/2c fueron encontradas en carnes; y cepas del serotipo 1/2a fueron aisladas de salchichas. ( Cordano., Rocourt. 2001). 39

47 TABLA 4. INCIDENCIA DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN PRODUCTOS CÁRNICOS. (FUENTE: Farber, J.M y Peterkin, P.I ; Jay. J ; Torres, M.R ; Cordano, A.M. ; Rocourt, J. 2001) Producto Núm. de muestras Núm. (%) de muestras Núm. de serotipos positivas para L.monocytogenes 4b 1/2a 1/2b 1/2c otros Carne de Cerdo Picada (80.0) 7 b (11.8) 90 15(16.7) (4d) Croquetas de carne de res congelada (26.2) 6 25 Salchichas frescas y desecadas (12.7) 12(10.6) Carne de res picada 67 19(28.0) Carne de res cruda (6.2) (6.9) (6.5) Salami y cerdo prensado 243 4(0.2) Res salami 99 4(4.0) Mezcla de salchicha sazonada (12.8) Carne de res picada y mezclada 85 19(22.4) 18 e (4ab, 4d) Carne de res 18 3(16.7) 25 23(92.0) Carne de Cerdo 31 4(12.9) 25 17(68.0) Salami 63 4(6.3) Salchicha ahumada 55 3(5.5) Carne de res sin hueso 25 5(20.0) Paté 73 37(50.7) d Carne de cerdo molida 15 6(40.0) e 58 23(40.0) Carne de res molida 21 11(52.4) 59 27(46.0) Carne molida (36.0) Carne de res cocida (2.7) Jamón en rebanadas enlatado 205 3(1.5) Embutidos fermentados 96 5(5.2) Salchichón % % Embutido de carne de cerdo % Canales de pollo % Pollos broiler % Piel de cuello de ave % Pollo crudo % % Pollo y pato crudo % Patas de pollo % Pollo fresco Congelado % Porciones de pavo % % 40

48 4.6.3 Verduras y Hortalizas. El creciente interés por una alimentación sana, supone un mayor consumo de verduras, además del aumento del consumo, los cambios en el estilo de vida han ocasionado una escasez de tiempo para cocinar en casa, lo que ha llevado a muchas personas a comprar alimentos listos para comer. Algunos estudios han reportado una alta incidencia de Listeria monocytogenes en productos vegetales congelados. Los primeros brotes de listeriosis se asocian epidemiológicamente con el consumo de verduras crudas. Si los niveles del patógeno en la materia prima inicial son elevados, la supervivencia después de los tratamientos de higiene y los procedimientos de congelación es posible, por lo que la Listeria puede permanecer en el producto por largos períodos de tiempo. (Farber., Peterkin. 1991). En Canadá se dio un brote asociado al consumo de ensalada de col, afectando a 7 adultos y 34 niños recién nacidos y mujeres embarazadas en Durante el estudio se pudo acceder a una muestra de la ensalada de col que uno de los pacientes infectados conservaba en su heladera. Los resultados de los análisis mostraron la presencia de la misma cepa de Listeria monocytogenes en la ensalada y en la muestra de sangre extraída del paciente. El resto de los alimentos conservados en su heladera dieron negativo para la presencia de Listeria monocytogenes. (Rossi., et al. 2008). Un estudio realizado en Navarra, España, muestra que de todos los alimentos listos para comer analizados, el extenso grupo de las verduras congeladas fue el menos contaminado: sólo 31 de 1750 muestras fueron positivas para Listeria monocytogenes, y la incidencia de especies de Listeria fue mayor. De hecho, el 10,4% de los vegetales congelados analizados estaban contaminados con una o más especies de Listeria. El serotipo 1/2a fue el predominante (74%) en las muestras positivas para Listeria monocytogenes. (Vitas., et al. 2004). 41

49 Entre 2000 y 2005, 717 muestras de tres tipos de ensaladas se analizaron para Listeria monocytogenes en Santiago de Chile (tabla 5). Listeria monocytogenes fue aislada en 88 de las 347 (25,4%) muestras de ensaladas de vegetales congelados y en 22 (10,2%) de las 216 muestras de ensaladas frescas crudas o cocidas recién preparadas listas para comer de supermercados. Por otro lado, Listeria monocytogenes no fue aislada en 154 muestras de ensaladas crudas mínimamente procesadas de fabricación industrial. (Cordano., Jacquet. 2009). De 38 aislamientos realizados entre 2000 y 2001 se determinó: 5 aislamientos fueron serotipo 1/2a, 18 fueron serotipo 1/2b y 15 fueron serotipo 4b. Entre el 2002 y 2005, los resultados mediante PCR para 72 aislamientos fueron los siguientes: PCR grupo IIa, 12 aislamientos, PCR grupo IIb, 32 aislamientos, PCR grupo IIC, dos cepas, y PCR grupo IVb, 26 aislamientos. (Cordano., Jacquet. 2009). El método por PCR clasifica los resultados por grupos. En el grupo IIa serotipos 1/2 a y 3a, en el grupo IIb serotipos 1/2 b y 3 b, en el grupo IIc 1/2 c y 3c, y en el grupo IVb los serotipos 4b, 4d y 4e. (Doumith., et al. 2005). En Estados Unidos, un estudio llevado a cabo en las localidades de California y Meryland, se analizaron muestras de alimentos listos para comer. Se aisló Listeria monocytogenes en 544 muestras, 294 de ellas en Meryland y 250 en California, durante los años En Meryland, se aislaron 7 cepas de Listeria monocytogenes, a partir de ensaladas envasadas (4 de ellas serotipo 1/2 a, 1 serotipo 4b y 2 serotipo 4c) y 87 cepas a partir de ensaladas frescas preparadas (60 de ellas serotipo 1/2 a, 20 serotipo 1/2 b y 7 serotipo 4b). Por su parte, en California se aislaron 14 cepas de Listeria monocytogenes, a partir de ensaladas envasadas (10 de ellas serotipo 1/2 a y 4 serotipo 4b) y 85 cepas a partir de ensaladas frescas preparadas ( 37 de ellas serotipo 1/2 a, 37 serotipo 1/2 b, 9 serotipo 4b, 1 serotipo 1/2 c y 1 serotipo 4d). (Evans., et al. 2005). En España durante el periodo , de un total de 300 muestras, incluyendo 21 muestras de frutos listos para el consumo, 28 muestras de verduras frescas, 15 muestras de semillas germinadas y 237 muestras de ensaladas listas para comer fueron adquiridas a partir de 4 supermercados. De todas las muestra analizadas 2 (0,7%) fueron positivas para Listeria monocytogenes. (Abadias., et al. 2008). 42

50 TABLA 5. INCIDENCIA DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN VEGETALES Y HORTALIZAS. (FUENTE: Torres, M.R ; Curtis, M.L., et al 2002 ; Gianfranceschi M., et al 2003 ; Mena, C., et al ; Vitas I.A. et al ; Evans, S., et al ; Abadias, M., et al ; Cordano, A.M; Jacquet, C. 2009). Alimento Incidencia País Ensaladas congeladas: Ensaladas mixtas Choclo Porotos verdes Habas Arvejas Brócoli Habas frescas Coliflor Zanahoria Champiñones Espinacas Cebollas Espárragos Alcachofa Bruselas Papas Ensaladas frescas de supermercado listas para comer: Ensaladas mixtas Habas Choclo Apio Betarraga Tomate (crudo) Zanahoria (cruda) Champiñones Algas marinas Arvejas Habas (cocidas) Coliflor Brócoli (cocido) Brotes de soya Repollo (crudo) Porotos verdes Lechuga (cruda) Ensaladas industriales mínimamente procesadas listas para comer: Ensaladas mixtas Zanahorias Lechugas 62/ % 31/ % 27/ % 10/ % 18/ % 7/ % 4/ % 12/ % 6/ % 2/21 9.5% 6/20 30% 4/ % - 0 1/14 7.1% 1/13 7.7% - 0 1/12 8.3% / % 28/ % 22/ % 4/ % 3/ % 9/ % 1/20 5% 1/15 6.6% 2/ % 1/10 10% 2/10 20% /6 50% - 0 1/6 16.7% - 0 1/5 20% /3 33.3% 1/29 3.4% 0/154 0% 2/ % 33/ % 9/ % 3/15 20% Chile España Chile Chile Chile Chile Portugal Chile Portugal Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Estados Unidos Estados Unidos Chile Reino Unido Irlanda del Norte Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile Chile España Chile España Italia Venezuela Canadá 43

51 4.6.4 Pescados y Mariscos La contaminación de los productos del mar con Listeria monocytogenes ha sido ampliamente estudiada. Las diferencias se producen en la prevalencia de Listeria monocytogenes en diferentes tipos de productos, así como por los productores. En el caso del pescado ahumado en frío la contaminación de Listeria monocytogenes varía de 0 a 100% ; el mayor número de células de Listeria monocytogenes encontrados en el pescado ahumado en frío es de 2.5x10 4 UFC/g. La contaminación de los productos de pescado ahumado en caliente, varía de 0 a 33%. La mayor cantidad de células de Listeria monocytogenes en productos pesqueros ahumados en caliente es 1.3x10 5 UFC / g. (Miettinen. 2006). En ensaladas de mariscos, la contaminación por Listeria monocytogenes presenta una tasa de entre 4,7 a 27% y el mayor número de células que se encuentran es entre UFC / g (Gombas., et al. 2003). La contaminación de pescados frío salado varía entre 21 a 50% y el mayor número de células de Listeria monocytogenes que se encontró fue de 3.4x10 3 UFC / g (Miettinen. 2006). En Japón, la tasa general de contaminación por Listeria monocytogenes en los productos del mar es de 7,8%. (Handa. et al. 2005). En un estudio japonés, un total 250 muestras de sushi fueron analizadas por su estado microbiológico y la prevalencia de bacterias patógenas. Se hizo una comparación entre los sushi congelados de los supermercados y sushi fresco de bares. Las bacterias aeróbicas mesófilas se encuentran en cantidad diferente, con medias de 2,7 log UFC / g para el sushi congelado y 6,3 log UFC / g para el sushi fresco. La prevalencia de Escherichia coli y Staphylococcus aureus fue mayor en las muestras frescas. Salmonella se encontró en cuatro (1,6%) de las muestras de sushi, y Listeria monocytogenes se halló en tres (1,2%) de las muestras. (Atanassova., et al. 2008). 44

52 Estos resultados indican que la calidad microbiológica de sushi procesado industrialmente es más alto que el de sushi recién preparado. La calidad de sushi recién preparado depende fuertemente de las habilidades y hábitos de los cocineros de preparación, los cuales pueden variar. (Atanassova., et al. 2008). En un estudio realizado en Chile, de un total de 268 muestras de mariscos analizados, 209 fueron mariscos cocidos (14 contaminados, 6.7%) y 59 fueron camarones crudos (17 contaminados, 28.8%) (tabla 6). Listeria monocytogenes serotipo 1/2c fue encontrado en mariscos, mientras que el serotipo 3b fue encontrado exclusivamente en camarones. ( Cordano., Rocourt. 2001). La política sobre la presencia y las cantidades aceptables de Listeria monocytogenes en productos del mar varía en diferentes países, de cero tolerancia (por ejemplo en EE.UU.) a una cantidad aceptable de menos de 100 UFC / g que se ha estimado en un nivel cuando el riesgo de la listeriosis es muy bajo, incluso para grupos de alto riesgo. (Miettinen. 2006). Las instalaciones de producción como las plantas de procesamiento, según estudios han presentando un riesgo menor de contaminación por Listeria monocytogenes (Rørvik. 2000). Además, las instalaciones deben ser acondicionadas para restringir o eliminar la transmisión entre personas, equipamiento, procesamiento, embalaje y transporte. La contaminación cruzada entre las áreas de productos crudos y terminados es una importante fuente de contaminación. (Miettinen. 2006). El proceso de corte y encurtido fueron los pasos más críticos de la línea de producción de peces, principalmente debido a las dificultades con la limpieza a fondo del equipamiento. Además, Listeria monocytogenes es extremadamente difícil de eliminar utilizando procedimientos de rutina de desinfección en un separador de carne hueso, que es un equipo complejo. (Rørvik. 2000). 45

53 TABLA 6. INCIDENCIA DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN PESCADOS Y MARISCOS. (FUENTE: Cordano, A.M. ; Rocourt, J ; Hoffman, A., et al ; Vitas I.A. et al ; Miettinen, H ) País Alimento Lugar de muestreo Noruega Salmón plantas de procesamiento Especificación Nº muestras cuello, cola y vientre 25gr 81 % positivo para Listeria spp. / monocytogenes 21 UK Salmón comercio carne y piel 25gr 5 0 USA Salmón plantas de procesamiento cuello, cola y vientre 25gr Chile Salmón plantas de procesamiento carne, 25gr 50 8 Noruega Trucha productores 25gr Finlandia Trucha arco iris plantas de procesamiento cabezas, 25gr España Trucha arco iris granjas acuículas branquias, intestino, piel 30 0 Francia Pescadilla comercio carne y piel 25gr 26 0 USA Bacalao negro plantas de procesamiento cuello, cola y vientre 56 4 India Diferentes especies vivos 25gr Argentina Merluza Caballa comercio menor 25gr 25gr USA Salmón ahumado frío productores 25gr Chile Pescado ahumado frío comercio 25gr Francia Ostras, mejillones vivos 25gr España Salmón ahumado productores 25gr Chile Mariscos productores, supermercados restaurantes 25gr

54 4.7 Situación en Chile Antecedentes de Listeria monocytogenes en Chile En 1990 se iniciaron los estudios en relación a la incidencia de Listeria monocytogenes en alimentos en venta en Santiago. En una primera etapa se estudiaron muestras de productos lácteos y cárnicos. Los resultados obtenidos fueron ublicados en el International Journal of Food Microbiology 70 (2001). Del total de muestras, se encontraron 77 contaminadas que provenían de helados (3.6%), queso crema (0.8%), productos cárnicos procesados (3.6%) y mariscos (11.6%). Los serovares encontrados fueron 1/2a (25 aislados), 4b (20 aislados) 1/2b (19 aislados) 3b (7 aislados), 1/2c (2 aislados) y 4 no tipificables. Cabe señalar, que los serovares 4b, 1/2a y 1/2b que son frecuentemente aislados de listeriosis humana, fueron aislados desde productos lácteos y cárnicos. (Cordano., Rocourt. 2001) El año 2000, se realizó la segunda etapa del estudio en ensaladas en venta en supermercados de Santiago. Ello, debido a que son la base de una alimentación sana, pero que por otra parte, de acuerdo a la información científica internacional, son el origen de grandes brotes de listeriosis en humanos. Se analizaron 709 muestras. Los resultados de este segundo estudio fueron positivos para un 26% de ensaladas congeladas y 10.5% ensaladas frescas de supermercados. No se aisló el patógeno desde ensaladas de preparación industrial listas para el consumo. (Cordano., et al. 2009). Estos estudios demuestran la presencia de numerosas variedades de Listeria monocytogenes en los alimentos consumidos en Chile especialmente en alimentos considerados listos para el consumo que no requieren tratamiento térmico como las ensaladas y los que se mantienen refrigerados por largos periodos. (MINSAL 2010). 47

55 4.7.2 Brotes actuales de Listeriosis en Chile Hasta el 30 de diciembre de 2008, en la Región Metropolitana se notificaron 115 casos positivos a Listeria monocytogenes desde los diferentes establecimientos públicos y privados de la región. De acuerdo a los antecedentes de la vigilancia de laboratorio a este patógeno, el número de aislamientos anuales en los años 2006 y 2007 en la RM, fueron 26 y 20 respectivamente. La cifra es cinco veces superior a la de años anteriores. Hasta la fecha, han fallecido 5 personas, lo que corresponde al 3,5% del total de casos. (MINSAL 2010). Del total de casos, 42% corresponde a embarazadas, 18% a adultos mayores con o sin patología de base, 15% a recién nacidos, 12% a pacientes inmunosuprimidos, 5% adulto mayor inmunosuprimidos, 3% sin condición conocida y 5% (6 casos) a personas sin factor de riesgo detectado, que han presentado un cuadro de meningitis severa. No se han detectado casos en niños sanos ni en menores inmunosuprimidos. (MINSAL 2010). El 77 % de los casos que pertenecen a la cepa epidémica, tienen su residencia en área de jurisdicción del Servicio Salud Metropolitano Oriente, concentrándose el mayor número en la comuna de Las Condes (16), Vitacura (12), Lo Barnechea (4), Ñuñoa (3), Providencia (3), La Reina (2) y Peñalolen (1). A partir del mes de septiembre del año 2008 y como resultado de la investigación epidemiológica de los casos reportados, se inició la toma de muestras de alimentos que las personas recordaban haber consumido. Se analizaron 124 muestras de diversos alimentos en el Instituto de Salud Pública (ISP) resultando positivas 7 muestras, pero ninguna de las cepas aisladas en estos alimentos presentó el mismo patrón genético de las cepas clínicas. Sin embargo, al estudiar la muestra de los alimentos sospechosos obtenidos de los refrigeradores de 2 pacientes, resultó positivo para listeria, con la cepa epidémica, el queso Brie Lescure. (MINSAL 2010). 48

56 El 1 º de Diciembre de 2008, el ISP informó el resultado de los análisis de muestras de quesos obtenidas en la planta de producción de la empresa Chevrita (quesos Brie y Camembert), correspondiendo 24 de las muestras al clon epidémico. Se notificó la prohibición de distribución y venta de los productos lácteos marca Chevrita, Las Pircas y Lescure en todas sus variedades. Continúa la investigación de muestras de alimentos. (MINSAL 2010). Al 29 de diciembre del año 2008, el ISP ha realizado 144 aislamientos a Listeria monocytogenes en el país. Corresponden a la Región Metropolitana 101 de estos aislamientos (70%) y 43 del resto de las regiones. Se encontraron 65 cepas genéticamente relacionadas (cepa epidémica), de las cuales 55 pertenecen a la Región Metropolitana, 6 a la Región de Valparaíso; las otras cinco pertenecen a las regiones de la Araucanía, Maule, Bío- Bío, Atacama y O'Higgins. (MINSAL 2010). El Laboratorio de Referencia del Instituto de Salud Pública de Chile (ISP), ha realizado la tipificación genética de Listeria monocytogenes proveniente de muestras clínicas, mediante la técnica de Electroforesis de Campo Pulsado (PFGE) utilizando la enzima de restricción según estándar PulseNet International (CDC, Atlanta, USA). El análisis genético permitió la identificación de 28 subtipos diferentes que fueron codificados correlativamente (CLSPAPA001 a CLSPAPA028). El subtipo CLSPAPA009 fue el más frecuentemente identificado, determinándose en 38 aislamientos, correspondiendo al 50% de los casos estudiados. El subtipo CLSPAPA009 se encuentra genéticamente cercano a los subtipos CLSPAPA010, CLSPAPA004, CLSPAPA005, CLSPAPA006, CLSPAPA007, CLSPAPA011, CLSPAPA012, CLSPAPA013 y CLSPAPA014. Este conjunto constituye un grupo clonalmente relacionado, en el cual se incluyen el 77% de los casos de Listeria monocytogenes confirmados provenientes del área oriente de la Región Metropolitana. (MINSAL 2010). 49

57 Durante el año 2009, se notificaron 69 casos de Listeria monocytogenes en el país. El 52% se presentó en la Región Metropolitana (36 casos). El resto de las regiones que reportaron casos fueron: Valparaíso (12), Bío Bío (7), Los Lagos (5), O Higgins (3), Maule (3), Araucanía (2), Coquimbo (1) y Antofagasta (1). De los 69 casos notificados, 10 presentaron cepas genéticamente relacionadas (clon 001), cepa epidémica responsable del brote ocurrido a principios de año; nueve de los casos correspondieron a la región Metropolitana y uno a la región de O Higgins. El último caso correspondiente a este clon, se notificó la semana 15 (12-18 abril). Se aisló el clon 91 en 2 casos notificados por las regiones de O Higgins y Metropolitana. Lo mismo ocurrió con 2 casos del clon 99 en la Región de Valparaíso y un caso en la Región del Bío Bío. Los clones mencionados, están relacionados con vienesas/longanizas y cecinas/arrollado/paté de jamón respectivamente ( tabla 7). El resto de los casos notificados presentaron clones distintos; no relacionados con los clones de los alimentos estudiados. (MINSAL 2010). TABLA 7. CASOS NOTIFICADOS DE LISTERIA MONOCYTOGENES ENERO-DICIEMBRE, CHILE (FUENTE: Gobierno de Chile, MINSAL 2010) 50

58 Se registraron 17 fallecidos (letalidad 25%), correspondientes a adultos mayores y/o con patologías crónicas asociadas; sólo se reporta un recién nacido fallecido. Ocho de los fallecidos son de la RM, tres de Valparaíso, dos del Bío Bío y uno en las regiones de O Higgins, Maule, Coquimbo y Los Lagos (tabla 8). La mayoría de los casos presentaron el diagnóstico de sepsis o meningitis por Listeria y la mayoría han sido notificados por el sistema público de salud. (MINSAL 2010). TABLA 8. CASOS NOTIFICADOS Y FALLECIDOS POR LISTERIA MONOCYTOGENES EN CHILE, ENERO-DICIEMBRE DE (FUENTE: Gobierno de Chile, MINSAL 2010) Según el último informe emitido el 8 de febrero de 2010, hasta la semana epidemiológica 5 del presente año se han notificado 5 casos de Listeria monocytogenes, incluyendo en la semana epidemiológica 1, un caso con fecha de inicio de síntomas el 2 de enero 2010 que por calendario epidemiológico corresponde a la semana 52 del año Esta cifra es menor a la registrada el año anterior, donde se notificaron 9 casos hasta la semana epidemiológica 5. (figura 4). (MINSAL 2010). 51

59 FIGURA 4. GRÁFICO CASOS DE LISTERIOSIS EN CHILE AÑOS 2008, 2009, HASTA FEBRERO DE (FUENTE: Gobierno de Chile, MINSAL 2010). De los cinco casos notificados durante el año 2010, dos corresponden a otros clones y tres están con tipificación molecular en curso por el ISP. No se registran fallecidos (tabla 9). (MINSAL 2010). TABLA 9. CASOS NOTIFICADOS DE LISTERIA MONOCYTOGENES HASTA SEMANA EPIDEMIOLÓGICA 5, CHILE (FUENTE: Gobierno de Chile, MINSAL 2010) 52

60 4.7.3 Normativa Vigente Según el artículo 174, del párrafo IV De otros criterios microbiológicos del Reglamento Sanitario de los alimentos DTO. N 977/96 de la República de Chile, estipula que en los alimentos Listos Para el Consumo (LPC) (tabla 10) se considera que no favorecen el desarrollo de Listeria monocytogenes cuando cumplen alguno de los siguientes parámetros: 1. ph menor o igual a 4,4 2. Actividad de agua (aw) menor o igual a 0,92 3. Combinación de ph y aw, con ph menor o igual de 5,0 y con aw, menor o igual a 0, Congelación, siempre que esta condición se mantenga durante todo el período, hasta antes de ser consumido. 5. Vida útil en refrigeración por un lapso de menos de 5 días. Los alimentos LPC que no cumplan los parámetros anteriores se considera que favorecen el desarrollo de Listeria monocytogenes. TABLA 10. CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS PARA LISTERIA MONOCYTOGENES. (FUENTE: Reglamento Sanitario de los Alimentos DTO. Nº 977/96, MINSAL, CHILE 2010) 53

61 Excepcionalmente, para alimentos que favorecen el desarrollo de Listeria monocytogenes, se aplicará el criterio de aquellos alimentos que no favorecen su desarrollo, cuando el fabricante o el productor, sea capaz de garantizar y demostrar, a través de la aplicación de tecnologías, que el producto no superará el límite de 100ufc/g durante su vida útil. Esta situación deberá ser demostrada, en su caso, ante la autoridad sanitaria. (Reglamento Sanitario de los Alimentos DTO. Nº 977/96, MINSAL, CHILE 2010) Medidas Sanitarias Propuestas Ante el incumplimiento de los criterios microbiológicos, se debe aplicar un sumario sanitario con el objeto de: a).- Impedir que el lote afectado sea liberado para el consumo humano. b).- Retirar el producto del mercado si este ya ha sido liberado para el consumo. c).- Obligar al elaborador a Identificar y corregir la causa original que provocó el incumplimiento. Eventualmente, a través de la presentación de un programa de control específico para listeria, que incluya, entre otros aspectos, las especificaciones de las características físico químicas de los productos, tales como, ph, actividad de agua, concentración de sal, concentración de preservantes, tipo y sistema de empaque, las condiciones de elaboración, las probabilidades de contaminación y las condiciones de vida. (Reglamento Sanitario de los Alimentos DTO. Nº 977/96, MINSAL, CHILE 2010). 54

62 4.8 Métodos de Detección en Alimentos En la industria alimentaria, los procedimientos estándar de cultivo se utilizan como métodos de referencia para fines de regulación y para la validación de nuevas tecnologías (figura 5). Estos métodos son sensibles, pero a menudo pueden tomar 5-6 días antes de que el resultado esté disponible. Dos de los métodos de cultivo de referencia más ampliamente utilizados para la detección de Listeria en todos los alimentos, son los métodos bacteriológicos de la FDA recopilados en el método de análisis de la Bacteriological Analytical Manual (BAM) y el método de la Organización Internacional de Normas (ISO) Estos dos métodos requieren el enriquecimiento de una muestra de 25 g de alimentos en un caldo selectivo, diseñado para disminuir el crecimiento de la flora acompañante, antes de la siembra en agar selectivo e identificación bioquímica de las colonias típicas. (Gasanov., et al. 2005). FIGURA 5. FLUJOGRAMA DE MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES. (FUENTE: Gasanov, U., et al. 2005) 55

63 4.8.1 Método de enriquecimiento según FDA/BAM 1. Una vez obtenida la muestra, se debe manipular lo menos posible, y almacenarla a 4ºC hasta el momento de analizarla. Si la muestra está congelada, no descongelar hasta su análisis. ( Hitchins.1998.BAM of the FDA) 2. Muestras compuestas. Generalmente las muestras se preparan en 10 sub-muestras (sólidos líquidos o cremoso). 50gr o ml de cada sub-muestra, se utilizan para hacer 2 compuestos (250gr c/u). Las sub-muestras deben ser representativas del alimento, tanto de su superficie como del interior. Para el primer compuesto, 5 submuestras de 50gr c/u se mezclan mediante el uso de un Stomacher o juguera, con 250ml de caldo de enriquecimiento para Listeria (BLEB), que contiene Piruvato de Sodio, sin agentes selectivos (Cicloheximida). ( Hitchins.1998.BAM of the FDA). El segundo compuesto se hace con las 5 submuestras remanentes, de la misma forma que el anterior. Ambos compuestos contienen 250gr de las porciones del alimento y 250 ml del medio BLEB. Normalmente, 50gr de cada compuesto (equivalente a 25gr del alimento más 25ml de BLEB) se mezclan con una cantidad de 200ml de BLEB; ya que hay dos compuestos, el resultado final son dos porciones analíticas de 25gr cada una contenida en 225ml de BLEB. Así, por cada sub-muestra un total de 50gr del alimento, es analizado. ( Hitchins.1998.BAM of the FDA). 3. Muestras no compuestas. Si las muestras de compuestos no son necesarias, solo las porciones analíticas de 25 g de alimento son simplemente mezclados en el stomached en 225 ml de caldo BLEB para enriquecimiento. Una muestra de 25 g debe mantenerse para el posible recuento de patógenos. Almacenar a 5 C si no se congela, si se congela, que no sea en un congelador de descongelación automática. ( Hitchins.1998.BAM of the FDA). 56

64 4. Pre-enriquecimiento y el enriquecimiento. Incubar durante 4 horas a 30 C, añadir los agentes selectivos y continuar la incubación durante un tiempo total de 48 horas a 30 C. Si Cicloheximida no está disponible, el sustituto preferido es Pimaricina (Natamicina) a 25 mg/l. La Natamicina es mucho más seguro de usar que Cicloheximida. Otra posibilidad, si el alimento de interés (por ejemplo, leche pasteurizada y crema, el yogurt y mariscos congelados pre-cocidos) son bajos en la levadura y el moho, es posible prescindir de un agente anti-hongos. Esto no es aconsejable para los quesos madurados moho, ahumado o mariscos secos o productos frescos. ( Hitchins.1998.BAM of the FDA). 5. Enriquecimiento para enumeración. La vigilancia de los niveles de Listeria monocytogenes en alimentos contaminados es actualmente requerido. La detección se puede hacer primero y si se detecta contaminación, una porción de muestra de reserva puede ser utilizada para la enumeración. Este es probablemente el método preferible, en general, sólo un pequeño porcentaje de las muestras se puede esperar que sea positivo y, a continuación lo más a menudo a un nivel de sólo 1 UFC/25g. ( Hitchins.1998.BAM of the FDA) Método de enriquecimiento según norma ISO La norma ISO tiene un método de enriquecimiento en dos etapas: la muestra de alimento de 25gr primero es enriquecida en el medio caldo Fraser media concentración durante 24 hrs a 30 C; a continuación, una alícuota (0.1ml) se transfiere a 10ml de Caldo Fraser para un mayor enriquecimiento; incubar durante 48hrs a 35 ó 37 C (figura 6). El Caldo Fraser también contiene Acriflavina agentes selectivos y ácido nalidíxico así como también esculina, lo que permite la detección de actividad beta-d-glucosidasa por Listeria, causando un ennegrecimiento del medio. (Gasanov., et al 2005 ; Jantzen., et al. 2006) 57

65 FIGURA 6. MÉTODO DE DETECCIÓN DE LISTERIA SEGÚN NORMA ISO Procedimiento de siembra e aislamiento Independiente de la metodología seguida para el enriquecimiento, a las 24 y 48 horas de incubación, se procede a sembrar en dos se los siguientes agares o medios de cultivo selectivos que contienen esculina para el aislamiento de Listeria: agar Oxford (OXA), PALCAM, MOX, LPM que son fortificados con esculina y Fe 3+. Estos medios selectivos ricos en esculina se mencionan en orden de preferencia de uso, y sujeto a su disponibilidad. Incubar placas de agar OXA, PALCAM o MOX a 35 C durante horas y las placas LPM a 30 C durante h. Se recomienda encarecidamente que uno de los medios seleccionados sea L. monocytogenes - L. ivanovii selectivos diferenciales, como BCM, ALOA, RapidL'mono (M131a), o CHROMagar Listeria. ( Hitchins.1998.BAM of the FDA ; Gasanov., et al. 2005). 58