Nuevos ensayos sobre contaminación seminal

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1 Nuevos ensayos sobre contaminación seminal IV JORNADA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL: ESTÁNDARES DE CALIDAD EN INSEMINACIÓN 18 OCTUBRE 2017

2 La pesadilla de la contaminación bacteriana -Disminución del periodo de conservación de las dosis espermáticas (<48 h) -Presencia de aglutinaciones espermáticas Motilidad -Acrosomas dañados -Aumento de la incidencia de cerdas con retorno regular a celo. -Presencia de descargas vaginales a partir de los 5-17 días de la inseminación.

3 Herramientas de diagnóstico Método Detección Identificación Antibiograma Cultivo en placa 24-48h - 72 horas Laminocultivos h - - PCR 4 h*** 4h*** - Citometría 10 min - 1 hora Kits rápidos 24 h 24h 18 h

4 Citometría Ventajas: -Rapidez: contaminación en 20 minutos, antibiograma en 90 minutos -Fácil de utilizar -Preparación rápida -Precio por muestra bajo -Permite otros muchos análisis en el semen Desventajas: -Inversión inicial alta Inversión: Citómetro: Coste pocillo Coste mano de obra Coste total análisis

5 Preparación de la muestra Mezcla de fluorocromos en cada pocillo Incubación 10 minutos a 37ºC Lectura : recuento del número de bacterias por ml.

6 Lectura

7 Citometría: antibiograma

8 Preparación de la muestra Tomamos 24 microlitros de semen y lo diluimos en 2,4 ml de tampón. Repartimos 200 microlitros en cada pocillo (200 x12=2400 microlitros) Cargamos cada fila con un eyaculado diferente Cada columna contiene un antibiótico diferente La primera columna es el control (sin antibiótico) Control Sin ATB ATB1 ATB2 ATB3 ATB4 ATB5 ATB6 ATB7 ATB8 ATB9 ATB10 ATB11 Dosis o eyaculado 1 Dosis o eyaculado 2 Dosis o eyaculado 3 Dosis o eyaculado 4 Dosis o eyaculado 5 Dosis o eyaculado 6 Dosis o eyaculado 7 Dosis o eyaculado 8

9 Menor concentración de bacterias en pocillos con ATB no eficaz Pocillos control (sin ATB) Pocillos con ATB no eficaz la población de bacterias activas se mantiene intacta (Bacteria antibio-resistente) Pocillos con ATB eficaz (Bacteria sensible)

10 Menor concentración de bacterias en pocillos con ATB no eficaz 6 muestras seminales sembradas con diferentes cepas antibióticas (10 8 UFC/ml) Control sin ATB y 5 ATBs diferentes (Apramicina 90 µg/ml, Neomicina 50 µg/ml, Cefalexina 150 µg/ml, Estreptomicina 50 µg/ml, Ceftiofur 150 µg/ml) Incubaciones de 20 min, 50 min y 150 min Comparativa con antibiograma tradicional y kit rápido Pocillo Control sin ATB (n=6) ATB no eficaz (n=15) Concentración bacteriana 20 min (x10 8 UFC/ml) Incremento Concentración bacteriana 50 min Incremento Concentración bacteriana 150 min 0,27a +0,5% +21,8% 0,25a +10,5% +2,2% ATB eficaz (n=6) 0,34a -35,7% -55,3% Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas (p<0,05)

11 Interacciones antibiótico-bacteria Activas Inactivas Muertas Las bacterias vivas se pueden dividir en bacterias activas e inactivas Pocillos control (sin ATB) Pocillos con ATB no eficaz la población de bacterias activas se mantiene intacta (Bacteria antibio-resistente) Pocillos con ATB eficaz (Bacteria sensible)

12 Interacciones antibiótico-bacteria Pocillo Control sin ATB (n=15) Ïndice de actividad bacteriana 20 min Ïndice de actividad bacteriana 50 min Ïndice de actividad bacteriana 150 min 7,4% a 7,5%a 8,0%a ATB no eficaz (n=15) 5,7%a 3,5%a 3,0%b ATB eficaz (n=6) 3,1%b 2,9%a 2,8%b Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas (p<0,05) 6 muestras seminales sembradas con diferentes cepas antibióticas (10 8 UFC/ml) Control sin ATB y 5 ATBs diferentes (Apramicina 90 µg/ml, Neomicina 50 µg/ml, Cefalexina 150 µg/ml, Estreptomicina 50 µg/ml, Ceftiofur 150 µg/ml) Incubaciones de 20 min, 50 min y 150 min Comparativa con antibiograma tradicional

13 Kits rápidos de pruebas bioquímicas Ventajas: -Rapidez: identificación horas, antibiograma 14 horas -Fáciles de utilizar -Bacterias responsables de contaminación seminal -Preparación rápida -Inversión baja Desventajas: -Límite mínimo de detección alto (10 3 a 10 5 UFC/ml) -Antibióticos utilizados en otros ámbitos clínicos -Coste fungible puede ser elevado -Inexactitud Inversión: Estufa: Autoclave: Coste Kit Coste mano de obra Coste total

14 Preparación de muestra V) 37ºC H) 37ºC

15 Identificación bacteriana H) V) >10 5 UFC/ml E Coli Grupo PPM (Proteus, Providencia) Grupo KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia) Pseudomona Enterococos Estafilococos Candida >5 x10 3 UFC/ml E Coli Enterobacterias Pseudomona Estreptococos Estafilococos Enterococos Micoplasma

16 Antibiograma H) V) Antibiograma Amikacina - 32 μg / ml Gentamicina - 8 μg / ml Tobramicina - 8 μg / ml Piperacilina-Tazobactam - 128/4 μg / ml Fosfomicina μg / ml Cefoperazona - 64 μg / ml Cefotaxima - 64 μg / ml Ceftazidima - 32 μg / ml Ampicilina / Sulbactam - 32/16 μg / ml Ácido nalidíxico - 32 μg / ml Ciprofloxacina - 4 μg / ml Levofloxacina - 8 μg / ml Amoxicilina / Ácido clavulánico - 32/16 μg / ml Co-trimoxazol - 8 μg / ml Antibiograma Cloxacilina, Amoxicilina + ac. Clavulánico, Ampicilina + Colistina, Cefalexina, Cefoperazona, Ceftiofur, Cefquinoma, Gentamicina, Espiromicina, Tilosina, Marbofloxacino, Penicilina + Estreptomicina, Sulfonamidas + Trimetroprim, Tetraciclina + Neomicina + Bacitracina

17 Identificación bacteriana verraco UFC/ml E Coli H ProteusPseudoGrupo KES H Enterococos EstafilococosE Coli V PseudomonaEnterobacterEstreptococoEstafilococosEnterococos 86 6,00 0 PP Ps 0 Enterococo ,00 0 PP 0 KES Enterococo , Ps 0 Enterococo Enterobact 0 Estafilococo , Ps 0 Enterococo Enterobact 0 Estafilococo ,00 0 PP 0 KES Enterococo ,00 Coli PP 0 KES Enterobact ,00 Coli , Enterobact , ,00 0 PP Ps 0 Enterococo ,00 0 PP Ps Ps ,00 Coli 0 Ps KES 0 Estafilococo 0 Ps 0 Estreptoc Estafilococo ,00 0 PP Ps 0 Enterococo ,00 0 PP Ps Ps ,00 Coli 0 Ps KES 0 Estafilococo 0 Ps 0 Estreptoc Estafilococo ,00 0 PP Ps 0 Enterococo ,00 Coli PP 0 KES Enterococo Estafilococo ,00 Coli PP Ps 0 Enterococo 0 0 Ps , Enterococo Estafilococo ,00 Coli PP Ps 0 Enterococo 0 0 Ps ,00 0 PP 0 KES Enterococo 0 0 Ps 0 0 Estafilococo Enterococo ,00 0 PP 0 KES Enterococo 0 0 Ps 0 0 Estafilococo Enterococo ,00 Coli PP Ps 0 0 Estafilococo Estafilococo Enterococo , Estafilococo , Enterococo Estafilococo , Enterococo Estafilococo , Estafilococo Estafilococo Enterococo ,00 0 PP Ps 0 Enterococo Estreptoc Estafilococo Enterococo ,00 0 PP 0 KES 0 Estafilococo 0 0 Enterobact 0 0 Enterococo ,00 0 PP Ps 0 Enterococo Estafilococo ,00 0 PP Ps ,00 0 PP 0 KES 0 Estafilococo 0 0 Enterobact 0 0 Enterococo ,00 0 PP 0 KES Enterococo Estafilococo ,00 Coli PP 0 KES Enterococo Estafilococo 0 0 Enterobact , Estafilococo , Enterococo Estafilococo 0 0 Enterobact ,00 Coli 0 0 KES Enterococo Estafilococo Coli 0 Enterobact Estreptoc Estafilococo ,00 0 PP Ps 0 Enterococo Estreptoc Estafilococo Enterococo ,00 Coli 0 0 KES Enterococo Estafilococo Coli 0 Enterobact Estreptoc Estafilococo 0 H) V)

18 Antibiograma (AMC, AMP, CFP, CN) Sensibilidad Kit H Sensibilidad Kit V Sensibilidad Kirbi-Bauer verraco UFC/ml 86 6,00 NINGUNO AMP AMC CFP CN NINGUNO ,00 NINGUNO AMP AMC CFP CN NINGUNO ,00 NINGUNO AMP CFP CN NINGUNO ,00 NINGUNO AMP+ COL, CFP, CN NINGUNO ,00 NINGUNO CFP NINGUNO ,00 AMP CFP CN CN NINGUNO ,00 AMP CN AMP AMC CFP CN NINGUNO ,00 CN AMC AMP+COL NINGUNO ,00 AMP AMC CFP CN AMP AMC CFP CN CN ,00 NINGUNO AMC AMP NINGUNO ,00 NINGUNO AMP, CFP, CN CN ,00 NINGUNO CFP CFP ,00 AMP AMC CN AMP AMC CFP NINGUNO ,00 CN CFP CN NINGUNO ,00 AMP CFP CN AMP AMC CFP CN CN ,00 AMP CFP CN AMP AMC CFP CN CN ,00 AMP AMC CFP CN AMP AMC CFP CN NINGUNO ,00 NINGUNO AMP AMC CFP CN NINGUNO ,00 AMP CFP AMP AMC CFP CN NINGUNO ,00 AMP AMC CFP CN AMP AMC CFP CN NINGUNO

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20 Nuevo kit rápido para antibiograma Basado en detectar la actividad metabólica de las bacterias Cuadro de antibióticos que ofrecen no es específico del ámbito de la inseminación porcina Control Sin ATB ATB1 ATB2 ATB3 ATB4 ATB5 ATB6 ATB7 ATB8 ATB9 ATB10 ATB11 Dosis o eyaculado 1 Dosis o eyaculado 2 Dosis o eyaculado 3 Dosis o eyaculado 4 Dosis o eyaculado 5 Dosis o eyaculado 6 Dosis o eyaculado 7 Dosis o eyaculado 8

21 Preparación de la muestra Tomamos 1 ml de semen y lo diluimos en 1 ml de tampón. Filtramos para eliminar espermatozoides Repartimos 100 microlitros en cada pocillo Cargamos cada fila con un eyaculado diferente Cada columna contiene un antibiótico diferente Añadimos 200 microlitros de medio de crecimiento y dos gotas de aceite de paradina en cada pocillo Incubamos a 37ºC Lectura: ROSA: actividad metabólica o RESISTENCIA AZUL: ausencia de actividad metabólica o SENSIBILIDAD

22 Resultados Cambio de color hasta en un mínimo de 30 minutos con concentraciones bacterianas superiores a 10 7 UFC/ml Para contaminaciones inferiores a 10 5 UFC/ml los cambios de color son más lentos y difíciles de valorar a ojo (colorímetro) N=22 muestras x 5 ATB muestra Control Sin ATB ATB1 ATB2 ATB3 ATB4 ATB5 ATB6 ATB7 ATB8 ATB9 ATB10 ATB11 Log10 UFC/ml Dosis o eyaculado 1 Dosis o eyaculado 2 Dosis o eyaculado 3 Dosis o eyaculado 4 Dosis o eyaculado 5 Dosis o eyaculado 6 Dosis o eyaculado 7 Dosis o eyaculado Tt(Horas)

23 Relación con otros métodos? La presencia de coloración rosa se relaciona con la actividad metabólica medida por citometría. Pocillo Ïndice de actividad bacteriana 20 min Ïndice de actividad bacteriana 50 min Ïndice de actividad bacteriana 150 min Control sin ATB 7,4% a 7,5%a 8,0%a (n=6) ATB no eficaz 5,9%ab 4,8%ab 4,5%b (n=14) ATB eficaz (n=16) 2,2%b 1,9%b 1,6%b Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas (p<0,05) En este contexto, su coincidencia con el antibiograma (Kirbi-Bauer) dependerá de la bacteria, el antibiótico y el tiempo de incubación.

24 Conclusiones A la espera de la generalización de otras técnicas (MALDI-TOF, PCR, secuenciación de ARN ribosomal) la identificación bacteriiana que proporcionan los kits comerciales es insatisfactoria. Los antibiogramas de kits comerciales se basan en la detección de reacciones metabólicas y la inhibición del metabolismo bacteriano no es lo mismo que la actividad bactericida que mide el método estándar (Kirbi-Bauer ) El citómetro permite determinar en 20 minutos la cantidad de bacterias del eyaculado o dosis y en los antibióticos efectivos frente a esas bacterias La citometría puede ser una herramienta fundamental de trabajo para los CIAs en la era post-antibiótica

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