Técnicas de Biología Molecular

Transcripción

1 Técnicas de Biología Molecular PCR Marcación de Sondas ChIP Micro Arrays

2 PCR: Polymerase chain reaction Reacción en cadena de la polimerasa

3 PCR: Polymerase chain reaction Reacción en cadena de la polimerasa Es una técnica que permite hacer millones de copias a partir de una muestra ínfima de DNA. Inventada en 1985 por Kary B. Mullis Premio Nobel de Química, 1993 Amplificación en ciclos de temperatura

4 Qué necesitamos para hacer una PCR? *DNA molde o templado: contiene la región que queremos amplificar. forward reverse * Primers: Secuencias cortas de DNA (oligonucleótidos) que delimitan la zona que queremos amplificar. Deben ser complementarios a cada uno de los extremos de la región a amplificar. Se sintetizan in vitro de un modo preciso para que a partir de su región 3, la polimerasa inicie la síntesis en dirección correcta *dntps: datp, dctp, dgtp y dttp. Mezcla de los 4 deoxirribonucleótidos trifosfato que componen el DNA. *DNA Polimerasa: polimerasa capaz de resistir elevadas temperaturas (TaqPol) * Termocicladora: Una máquina que haga ciclos controlados de temperatura (Máquina de PCR, PCRra)

5 Qué sucede en cada ciclo de PCR? 94 C x 1 min 54 C x 45 seg 72 C x 2 min 25 ciclos forward reverse Tº annealing depende del contenido de CG y AT de los primers DNA pol Tiempo de extensión depende de la longitud del producto y de la DNA polimerasa

6

7 Pasos de amplificación en la PCR La reacción de PCR necesita repetidos cambios de temperatura que permitan pasos de: 1) desnaturalización, 2) apareamiento y 3) síntesis del DNA que se está copiando Desnaturalización del DNA templado 94 C x 3 min 1 vez (antes del 1er ciclo) Desnaturalización del DNA templado y copias Apareamiento/Annealing de los primers al templado Síntesis/Extensión de las copias de DNA 94 C x 1 min 54 C x 45 seg 72 C x 2 min 25 ciclos Síntesis/Extensión para completar las copias que eventualmente hubieran quedado incompletas 72 C x 10 min 1 vez (después del último ciclo)

8 Con la repetición de los ciclos de PCR logramos una amplificación exponencial de la muestra original

9 Cómo hacemos una PCR? Conc. Final Volumen DNA templado (genómico) 200 ng 2 ul Buffer 10X 1 X 2.5 ul MgCl 2 50 Mm 4 mm 2 ul dntps (mix 10 mm c/u) 0.28 mm c/u 0.7 ul Primer Forward (5 mm) 0.5 um 2.5 ul Primer Reverse (5 mm) 0.5 um 2.5ul Taq DNA Pol U 0.25 ul H 2 O c.s.p. a 25 ul PROGRAMA PCR: Desnaturalización* Desnaturalización Annealing Elongación Elongación* 95 C 3 min 95 C 1 min 55 C 30 seg 72 C 1 min 72 C 10 min X 35

10 Visualización de los productos de PCR Geles de agarosa - Bromuro de etidio

11 DNA polimerasas termoestables Aguas termales, géiseres submarinos, volcanes oceánicos DNA Polymerase Taq Amplitaq Hot Tub Pyrostase Vent Deep Vent Tth Pfu ULTma Source Thermus aquaticus Thermus aquaticus Thermus flavis Thermus flavis Thermococcus litoralis Pyrococcus GB-D Thermus thermophilus Pyrococcus furiosus Thermotoga maritima

12 1) Actividad 3'->5' exonucleasa. Diferencias entre Taq y Pfu Polimerasas con actividad 3'->5' exonucleasa tienen menor error: corrigen el último nucleótido mal incorporado (proofreading). Taq: no tiene actividad 3'->5' exonucleasa: mayor cantidad de errores (1.1 x 10-4 sustituciones/base) Pfu: tiene actividad 3'->5' exonucleasa: menor cantidad de errores (1.6 x 10-6 errores/base)

13 2) Actividad transferasa terminal Es agregar una base al extremo 3 Diferencias entre Taq y Pfu Taq: tiene actividad transferasa terminal. Agrega una A sobresaliente (overhang) a cada extremo 3 del producto de PCR. Es posible clonar el fragmento de PCR en vectores con 3'-T overhangs (pgemteasy: permite amplificar en E. coli). Pfu: no tiene actividad transferasa terminal: productos de PCR con extremos romos (blunt ends). Para clonar: agregar 3'-A y ligar en vectores con 3'-T overhangs o clonar en vectores blunt.

14 Diferencias entre Taq y Pfu 3) Velocidad de síntesis. Taq: más rápida (2000 nucleótidos/min) Pfu: más lenta (500 nt/min) Importante para determinar el tiempo de elongación 4) Termoestabilidad. Taq: menos de 1 h a 95ºC (tener en cuenta la duración de la PCR) Pfu: vida media h a 95ºC Pfu: temperaturas de desnaturalización más altas (98ºC). Importante para productos de PCR ricos en GC (3 ptes H)

15 DNA Polimerasa termoestable: Phusion Es una fusión entre una DNA pol termoestable y un dominio de pegado a DNA doble cadena Confiere mayor procesividad, fidelidad, velocidad y capacidad de amplificar fragmentos largos dsdna Binding Domain DNA Pol Taq Pfu Phus Taq Phus Phus

16 Selección de condiciones óptimas 1. [Enzima] Leer las especificaciones del fabricante * Conc. muy alta: productos no específicos * Conc. muy baja: bajo rendimiento 2. [Mg 2+] :complejos con dntps, primers y DNA molde (afecta annealing; epecificidad; fidelidad y actividad de la DNApol). No incluída en el buffer de PCR. * Conc muy baja: bajo rendimiento. * Conc muy alta: productos no específicos y errores de incorporación.

17 Selección de condiciones óptimas 3. Cantidad de DNA molde DNA genómico: ng (vf rx: 50uL) Vector: ng (vf rx: 50uL) *Mucho DNA: productos inespecíficos *Poco DNA: bajo rendimiento 4. Temperatura y tiempo de annealing seg; Tº: 5ºC por debajo del Tm más bajo del par de primers. * Tºann alta: más específico (menos rendimiento) * Tºann baja: productos no específicos (los primers se aparean inespecíficamente) 5. Número de ciclos ciclos: OK

18 Aplicaciones de la PCR en diferentes estudios Amplificación de un fragmento de DNA para caracterización por pattern de bandas o secuenciación Detección y/o cuantificación de la expresión de un mensajero (RT-PCR) Cuantificación de alta sensibilidad de RNA o DNA (Real time PCR, PCR cuantitativa, qpcr) Clonado de cdnas o DNA genómico: Amplificación y modificación de extremos de DNA para introducir sitios para enzimas de restricción Introducción de mutaciones específicas sobre templados wilde type Marcado de sondas de DNA

19 Templados para PCR Nombre de la técnica DNA genómico DNA plasmídico cdna PCR RT RNA RT-PCR (Reverse Transcription - PCR)

20 RT-PCR Síntesis de la 1º hebra de DNA: RT RNA: -total -mrna Síntesis de la 2º hebra de DNA y amplificación: PCR Primer PCR Primers: -oligo-dt -random hexamers -primers esp. (Rv) Transcriptasa Reversa: -Avian Myeloblastosis Virus (AMV) -Moloney murine leukemia virus (MMLV) DNApol (Taq) cdna dsdna RNAsa H

21 RT-PCR: Estrategia de la RT Las estrategias para la ampilificación mediante RT-PCR varían según los primers que se usan para la síntesis de la primera cadena de cdna (RetroTranscripción) Oligo dt: Para retrotranscrir todos los mrnas presentes en la muestra. Los extremos 5 de genes muy largos se pueden perder Específico: Se retrotranscribe el gen de interés y otros que tengan la misma secuencia (splicing alternativos, familia conservada) Random: Se retrotranscribe todo el RNA de mi muestra (también sin poly-a). Se obtienen fragmentos de mrnas, independientemente de la longitud de los genes. Una vez obtenido el cdna por alguno de estos protocolos, se utiliza como templado para una reacción de PCR estándar

22 RT-PCR Aplicaciones: Análisis de expresión si/no o semicuantitativo, sobre RNA purificado y/o in situ Si luego de la RT se realiza una real-time PCR, el método es cuantitativo. Clonar el cdna de un gen Buscar extremos no conocidos del gen (5 o 3 RACE)

23 RT-PCR Semi-cuantitativa Control interno para normalizar: gen constitutivo (eliminar errores por diferencias en la cantidad inicial de muestra) Rx RT-PCR: primers del gen de interés y primers del control interno. Opción: cuantificar las bandas: relación gen/control interno RT-PCR semi-cuantitativa para los mrna de MIP-2, TNF-α e IL-1β. C: células no tratadas. LPS: células expuestas a 100 μg/ml LPS (E. coli o P. aeruginosa). ARP (acidic ribosomal phosphoprotein): control interno para normalizar la cantidad de mrna inicial.

24 Real Time-PCR (RT-PCR, Q-PCR o qpcr) Se necesita un termociclador (con lector de fluorescencia) asociado a una PC. Se utiliza para cuantificar una reacción de PCR Mide el aumento del DNA a medida que se amplifica (en tiempo real). Detección y cuantificación del producto de PCR mediante una sonda fluorescente que se une al DNA o un agente intercalante. Esta señal fuorescente aumenta en proporción directa al aumento del producto de PCR y se registra a lo largo del tiempo.

25 Real Time-PCR Sistemas de detección: *agentes fluorescentes intercalantes *sondas específicas marcadas con fluorocromos Agentes fluorescentes intercalantes: Fluorocromos que aumentan la emisión de fluorescencia cuando se unen a DNA de doble hélice. El más empleado es el SYBR Green I

26 Real Time-PCR Sondas específicas marcadas con fluorocromos: se mandan a sintetizar, seq específica *Taqman: oligonucleótido que se une a la región a amplificar. Fluorocromo + Quencher (absorbe la energía del fluorocromo cuando está cerca fluorocromo no fluoresce) Durante la PCR: Taq (actividad 5 3 exonucleasa) hidroliza la sonda se separa el fluorocromo del quencher flourescencia

27 Real Time-PCR: curva de calibración Amplificación de un producto X a partir de distintas cantidades de DNA inicial conocidas (plásmido). En este caso: 6 réplicas por c/cantidad de DNA CT. log

28 Rapid Amplification of cdna Ends (RACE-PCR) Es una RT-PCR que se utiliza para amplificar, clonar y secuenciar extremos 5 o 3 desconocidos de un cdna. Se utiliza cuando obtenemos de una library un cdna incompleto y queremos obtenerlo en forma completa (full length) Actualmente existen nuevas tecnologías para realizar libraries con cdna completos y varios consorcios dedicados a coleccionar cdnas completos y secuenciarlos, de donde se pueden obtener los clones o las secuencias full length. Además varios organismos utilizados en investigación han sido secuenciados casi o completamente

29 3 RACE Transcripción reversa del mrna: primer adaptador (oligo- T+adaptador) Amplificación por PCR: primer adaptador y un primer específico del exón conocido (sense)

30 5 RACE Transcripción reversa del mrna: primer específico del exón conocido (antisense) Agregado de poli-a a la primer hebra de cdna (transferasa terminal) Amplificación por PCR: primer adaptador y el primer específico (antisense) 3 o 5 RACE clonado del producto en vector secuenciación Primer adaptador (sitios de restricción)

31 Características de los primers 1. Longitud del primer nt Muy largos: errores en la síntesis, fallas en el annealing: bajo rendimiento nt: Tm óptima 2. Tm (Tº melting) Tm: Tº a la cual la mitad de las bases del primer están apareadas con el DNA molde. Tm = 2(A+T) + 4(G+C) -Tm aumenta con la longitud del primer y el contenido (G+C) Tm: 55º-70ºC - 2 primers: Tm similares Tº annealing depende de la Tm de los primers 5ºC por debajo del Tm más bajo del par de primers Tº annealing: al menos 50ºC).

32 3. Especificidad Reconocer una secuencia única dentro del DNA templado Especificidad de un primer depende de la longitud (más largo menos probabilidad de encontrar 2 seq en el DNA templado). Primers cortos: inespecíficos (a tº de ann baja: priming inespecífico si hay una homología corta en el extremo 3 ; taq funciona esas tº) Long: nt Características de los primers Un primer de 15 nt puede funcionar bien para amplificar un fragmento de un plásmido, pero puede ser inespecífico para amplificarlo de DNA gen.

33 Características de los primers 4. Complementariedad de secuencias Sin complementariedad intra- o inter- primers. * Complementariedad intra-primer (+ de 3 b): se pliega (estructuras de doble cadena) interfiere con el annealing al DNA templado. * Complementariedad inter-primer: dímeros formación de producto por competencia

34 5. Contenido G/C; poli(t/a-g/c) % GC (para tener buen Tm) Sin poli(t/a-g/c) Características de los primers PoliT, PoliA o Poli T/A unión más débil: se puede separar el complejo primertemplado en esa zona (brecha). PoliG, PoliC o Poli G/C unión más fuerte: annealing no específico. 6. Extremo 3 G o C en el extremo 3' Asegura la unión del primer al molde en el extremo 3 donde se une la polimerasa (unión más fuerte que A/T) la eficiencia de la reacción.

35 Características de los primers Primers * nt de longitud * Tm 55º-70ºC - 2 primers: Tm similares * Específicos * Sin complementariedad intra- o inter-primers * 45-55% GC * Sin poli(t/a-c/g) * G or C en el extremo 3 Existen programas (DNAstar) para diseñar primers. A partir de la secuencia eligen el mejor par de primers.

36 Diseño de primers Fw gen Rev 5 -AGTCTCGAGATGCGTAGAGCTC--810bp--CCGATCGATCGCTAACGTCGTCG-3 Cadena Taq 3 5 La Taq Pol tiene dirección 5 ->3 e inicia la síntesis desde el 3 -OH del primer Fw Rev 5 -AGTCTCGAGATGCGTAGAGCTC--810bp-- -CCGATCGATCGCTAACGTCGTCG-3 5 -GAGATGCGTAGAGCT-3 --> <--3 -CTAGCTAGCGATTG-5 3 -TCAGAGCTCTACGCATCTCGAG---810bp-- -GGCTAGCTAGCGATTGCAGCAGC-5 Cadena + Cadena - Los primers se escriben siempre 5 3 El forward queda igual a la cadena + 5 -GAGATGCGTAGAGCT-3 5 -GTTAGCGATCGATC-3 El Reverse se escribe inverso y complementario a la cadena +

37 Diseño de primers Fw gen Rev 5 -AGTCTCGAGATGCGTAGAGCTC--810bp--CCGATCGATCGCTAACGTCGTCG-3 5 -GAGATGCGTAGAGCT-3 Igual a la cadena + 5 -GTTAGCGATCGATC-3 Inverso y complemetario a la cadena + La elección de la secuencia de los primers Es importante que los primers estén bien balanceados, es decir, que la Tm y número de bases sean similares. También es necesario seguir las otras reglas mencionadas anteriormente (especificidad, self-annealing, etc). Hay casos en que se presenta la obligación de hacer un primer en una región fija. En este caso, si los primers no son óptimos en todas sus reglas, habrá que trabajar sobre la puesta a punto de la PCR. Otras veces se pueden mover de algunas bases hasta encontrar una secuencia adecuada que permita que los primers cumplan con las reglas más importantes.

38 Incorporación de sitios de restricción a primers Buscar dos enzimas que nos den la orientación que necesitamos para clonar (depende del vector) que no corten el producto de PCR que sean lo más compatible posible (digestión en mismo buffer y misma Tº) Si no es posible encontrar dos enzimas útiles, se puede trabajar con una pero se pierde la direccionalidad blunt Bloquea por metilación Tº raras

39 Para mejorar la eficiencia de digestión del producto de PCR con ERs se agregan bases en el extremo 5 del primer

40 Diseño de primers con sitios para ER Fw 5 -AGTCTCGAGATGCGTAGAGCTC--1170bp--CCGATCGATCGCTAACGTCGTCG-3 3 -TCAGAGCTCTACGCATCTCGAG--1170bp--GGCTAGCTAGCGATTGCAGCAGC-5 Rev Fw Rev 5 -AGTCTCGAGATGCGTAGAGCTC--1170bp--CCGATCGATCGCTAACGTCGTCG-3 3 -TCAGAGCTCTACGCATCTCGAG--1170bp--GGCTAGCTAGCGATTGCAGCAGC-5 Los sitios para ER se agregan al 5 de los primers EcoRI 5 -GAATTCGAGATGCGTAGAGCT-3 HindIII 5 -AAGCTTGTTAGCGATCGATC-3 Igual a la cadena + Inv/Comp a la cadena + Se agregan bases al 5 de los primers para mejorar la eficiencia de las ER EcoRI 5 -ATGAATTCGAGATGCGTAGAGCT-3 HindIII 5 -CGAAGCTTGTTAGCGATCGATC-3

41 Diseño de primers con sitios para ER: Proteinas de fusión GST MCS (polylinker) EcoRI 5 -ATGAATTCGAGATGCGTAGAGCT-3 Glu Met Arg Arg EcoRI HindIII GST p53 Met1 STOP Se debe respetar el marco de lectura que trae la proteína al NT, para eso hay que observar el marco de lectura que queda en el polylinker

42 Diseño de primers con sitios para ER: Proteinas de fusión MCS (polylinker) GST HindIII CCGATCGATCGCTAACAAGCTT-3 GGCTAGCTAGCGATTGTTCGAACG-5 Asp Ala STOP 5 -CCGATCGATCGCTTACAAGCTT-3 3 -GGCTAGCTAGCGAATGTTCGAACG-5 Asp Ala Leu EcoRI HindIII p53 GST Met1 STOP

43 Diseño de primers para introducir mutaciones por PCR Ej: CG TA 1 EcoRI Fw1 Rev1 mut TA 3 5 -AGTCTCGAGATGCGTAGAG...TAGTAGCTCCCGATCGAT...CGCTATCGTCGTCG-3 PCR1 (templado WT, un primer mut) 5 -GAATTCTCGAGATGCGTAGAG...TAGTAGCTCCTAATCGAT-3 Fw2 mut Rev2 HindIII TA 5 -AGTCTCGAGATGCGTAGAG...TAGTAGCTCCCGATCGAT...CGCTATCGTCGTCG-3 PCR2 (templado WT, un primer mut) 5 -GCTCCTAATCGAT...CGCTATCGAAGCTT-3 2 EcoRI Fw1 Rev2 HindIII 5 -GAATTCTCGAGATGCGTAGAG...TAGTAGCTCCTAATCGAT-3 5 -GCTCCTAATCGAT...CGCTATCGTAAGCTT-3 PCR3 (el templado son las PCR1 y PCR 2, primers WT) 5 -GAATTCCTCGAGATGCGTAGAG...TAGTAGCTCCTAATCGAT...CGCTATCGTAAGCTT-3

44 PCR con Primers Degenerados Los primers degenerados difieren entre ellos en la secuencia de los codones que codifican para el mismo amino ácido Se utilizan para intentar amplificar genes que se presume tengan zonas conservadas a nivel proteína, pero se desconoce la secuencia del cdna. Ej: buscar proteínas homólogas en otras especies alineamiento de seq de varias prot conocidas en otras especies determinar motivos prot conservados diseñar primers degenerados

45 PCR con Primers Degenerados Se parte de la seq de la proteína conocida proteína -->seq DNA: Trp Asp Thr Ala Gly Gln 5' TGG GAY ACN GCN GGN CAR 3' Y = C o T R = G o A N = G, A, T o C (Mix de 256 oligos distintos: 2*4*4*4*2) Se puede usar inosina (I) en lugar de N para reducir la degeneración I = C / G / A / T

46 Marcación de sondas

47 Hibridización Apareamiento de dos hebras de DNA simples cadena por complemetariedad de bases 5 AGTCGTCGAATCGCTAGTCAGTTCAGTCATCATCAGCGCTCAGCATAAATCTCTCGC 3 ATCAGTCAAGTCAGTAGTACTCGC Las SONDAS son secuencias cortas de DNA simple cadena que se unen a su secuencia complementaria y son detectables: Screening de libraries Southern blots Northern blots Hibridización in situ Microarrays molec radioactiva molec fluorescente molec reconocible en forma espec (haptenos)

48 Southern Blot: Análisis de DNA. Presencia y número de copias de un gen. Northern Blot: Análisis de RNA. Niveles de expresión de un mrna. DNA digerido con ER (SB) o RNA (NB): inmobilizados sobre una membrana (nylon) SB NB RNA total de distintos tejidos gel gel Visualización (autorradiografía) Marcación radioactiva autorradiografía

49 Hibridización in situ: hibridización sobre tejidos o células fijadas Detección de RNA de HIV-1 en timo de ratón infectado. Sonda: RNA antisense (tb podría ser cdna) (Marcación: digoxigenina) Fluorescence in situ hybridization (FISH) de cromosomas en metafase (ratón) con sonda específica para cromosoma 21. (Marcación: fluoróforo)

50 Detección de la sonda Incorporar a la sonda un nucleótido marcado con algún elemento que se pueda visualizar: Marcación radioactiva Marcación con haptenos (DIG, biotina) Marcación fluorescente

51 Detección de la sonda Marcación radiactiva: se usa uno de los dntps marcado con 32 P (u otros). Detección: autorradiografía. Usos: NB, SB, screening library g b a 32 P-a-dCTP 32 P-g-ATP

52 Detección de la sonda Marcación no radioactiva: Digoxigenina: se usa uno de los dntps marcado con digoxigenina (hapteno). Detección: Anticuerpo conjugado con enzima (ALP) o fluorocromo Usos: NB, SB, hibridación in situ Biotina: se usa uno de los dntps biotinilado. Detección: Streptavidina conjugada con enzima (ALP) o anti-biotina

53 Detección de la sonda Marcación flourescente: Se usa uno de los dntps marcado con un fluorocromo: Cyanin 5, Cyanin 3, fluoresceína, otros. Usos: FISH, microarrays Cy5-dCTP

54 Métodos de marcación Sondas de DNA: - Random primers - Nick translation - Marcación por PCR Sondas de RNA: - Marcación transcripcional Sondas de Oligonucleótidos - Marcación de extremos 3 Marcación para microarrays - Marcación de cdna

55 Sondas de DNA Marcación con Random Primers Se basa en la hibridación de una mezcla de primers compuesta por todos los posibles hexanucleótidos al DNA a marcar. Unión de los primers al azar : marcación a lo largo del DNA molde. La DNA Pol (Klenow frag) sintetiza la hebra complementaria a partir del 3' OH de cada primer incorporando uno de los nucleótidos marcados. Klenow fragm de DNA pol I (E Coli). 5 3 pol y exonucleasa, no 3 5 exonucleasa. 32 P-a-dCTP

56 Sondas de DNA Marcación por nick translation Basado en la capacidad de la DNasa I de generar nicks al azar a bajas [E] en presencia de Mg2+. DNA pol I sintetiza el DNA complementario a la hebra intacta en dirección 5' 3' usando el 3'-OH del nick como primer. La actividad 5' 3 exonucleasa de la DNA pol I remueve nucleótidos y la actividad polymerasa sintetiza DNA incorporando uno de los dntps marcados. 32 P-a-dCTP

57 Sondas de DNA Marcación por PCR La PCR permite la amplificación y marcación de cantidades ínfimas de DNA. Se necesita diseñar los primers. Se hace una rx de PCR utilizando uno de los nucleótidos marcados. 32 P-a-dCTP

58 Sondas de RNA Marcación transcripcional RNA pol del bacteriofago T7 (o SP6): para transcribir RNA a partir de DNA. cdna molde se clona en un vector que tiene secuencia para T7 (o SP6) RNA pol. Se incluye uno de los ribonucleótidos marcados a la rx de transcripción in vitro y se obtiene una sonda de RNA marcada. La Sonda de RNA debe ser antisense con respecto a lo que se quiere detectar! Para ello, el sitio para T7 o SP6 debe estar al 3 del cdna, así la transcripción hacia el 5 del cdna produce un RNA antisense dntps NTPs

59 Sondas de oligonucleótidos Marcación de extremos 5 o 3 Los oligonucleótidos se marcan enzimáticamente en el extremo 3 por el agregado de dntps marcados o por fosforilación del extremo 5 32 P-a-dCTP TdT TdT (Transferasa terminal) cataliza la incorporación de dntps al 3 OH en ausencia de templado. PNK (polinucleotido kinasa) Fosforila el extremo 5 a partir de g-atp 32 P-g-dATP 32 P-g-dATP 5 OH PNK g b a

60 MICROARRAYS

61 Pasos para la costrucción de un MICROARRAY Biblioteca cdna Secuenciación e identificación de cada cdna Se depositan los productos De PCR respetando el orden De la library Prueba de funcionamiento

62 Análisis y tratamiento de las secuencias Generación de secuencias del extremo 5 de los cdna clonados utilizando un secuenciador automático ABI Prism Input seqs secuencias 5 Phred Control de Calidad de las Secuencias Secuencias de buena calidad (legibles y largas) CrossMatch Programa que remueve las secuencias perteneciente a vectores usados para clonar la library Secuencias de cdnas

63 StackPACK CLUSTERING Identificación de secuencias únicas de cdna PHRAP Selección del clon que más se extiende al 5 Re-ordenamiento BLAST analysis Anotación: análisis de bancos de datos de cdna para identificar los clones Colección de cdnas full length Estos clones o sus productos de PCR serán depositados sobre pequeños vidrios respetando el orden para generar un micro-ordenamiento o microarray de cdna A B C D E A F B G C H D E F G H A B C D E A F B G C H D E F G H A B C D E A F B G C H D E F G H

64 Amplificación de los clones de la colección de cdnas Typical PCR Amplification Result of 384 cdna Clones: We are amplifying our cdna clones collection in 384-well format

65 Construcción de DNA microarrays PCRs de la Colección cdnas Las PCRs se depositan sobre vidrio Printing Microarray o chip de cdna

66 Un microarray es un conjunto de DNA ordenado y organizado por un criterio topogràfico riguroso clone I.D. POSITION NAME 12312AS 1_1 CyclinG SA7872 1_2 beta-actin 12SDI22 1_2 p53 Los microarray se utilizan para estudiar el perfil de expresión de miles de transcriptos a la vez DNA-chips: oligonucleotidos directamente sintetizados in situ (AFFYMETRIX) DNA microarrays: DNA o cdna depositado sobre soporte sòlido (vidrio tratado)

67 Tipos principales de microarrays DNA microarrays: DNA o cdna proveniente de una libray y depositado sobre soporte sòlido (vidrio tratado) Microarray Oligonucleótidos (AFFYMETRIX) : oligonucleotidos directamente sintetizados in situ sobre el soporte sólido Generalmente se sintetizan en el mismo punto hasta 20 oligos pertenecientes al mismo cdna. Este es un método muy versátil que permite reconocer pequeños cambios en un gen como mutaciones, variantes de splicing, etc

68 Medición de la expresión génica con cdna microarrays mrna aisaldo mm de células tratadas con X mrna referencia = test = reference RT y Marcación con dos moléculas fluorescentes distintas: Cy3 y Cy5 Gene 1 Gene 2

69 Medición de la expresión génica con Affymetrix En este caso la muestra es crna marcado DNA Affy RNA RNA cdna cdna crna

70 PERFIL DE EXPRESIÓN CON VARIAS MUESTRAS

71 Anàlisis de la expresiòn gènica n Identificaciòn de Clusters (conjunto de Genes) con expresiòn para evidenciar la firma molecular de las muestras similar, CLASIFICADORES GENICOS Y ANALISIS FUNCIONAL

72 FGF2-ECM cluster Carcinoma de ovario IL16 D13S106E ERP70 LU MAP4K2 KHK ADH1B FKBP2 LSS GMPR MHC2TA FN1 CDH11 AKAP 12 TRAM1 CXC L2 SPA RCL1 NMT1 Est GLR X Est FAM16AX GABPA FMO 5 LO C GABPB2 RAR RES2 DO LTBP2 GAT A1 AEBP1 FGFR4 COL5A 1 FBLN2 COL9A 3 THBS2 LO XL1 FAP BGN COL3A 1 BGN FGF2 COL6A 3 LCK NBL1 LUM FMOD EDNR A FCGRT RHAG GST M3 DAP GJB2 PRG1 FY BCL2 GEM TNFR SF6 NAB2 GM2A

73 Carcinoma de ovario

74 Inmunoprecipitación de la cromatina Chromatin ImmunoPrecipitation (ChIP)

75 Matriz Proteina-A Sepharosa ChIP: inmunoprecipitación de la cromatina Chromatin ImmunoPrecipitation Es una técnica que se utiliza para estudiar interacciones DNA/proteína Se basa en purificar una proteína conocida asociada a la cromatina, para luego 1) cuantificar el DNA conocido asociado a ella, o 2) identificar el fragmento de DNA desconocido asociado a ella. Proteina asoc al DNA

76 ChIP: inmunoprecipitación de la cromatina Chromatin immunoprecipitation 1) Fijar las células con 1% Formaldehído para causar el crosslink entre el DNA y proteínas 2) Recoger y sonicar las células para crear fragmentos de DNA genómico de 0,5 1 Kb 3) Incubar con un anticuerpo específico contra la proteína de interés y purificar el complejo DNA/proteína mediante inmunoprecipitación 4) Revertir el crosslink entre el DNA y la proteína y purificar el DNA Si se conoce el fragmento de DNA, se analiza por qpcr, RealTime-PCR Si no se conoce el fragmento se puede identificar sobre microarray: chip Técnica ChIP on chip

77 Si se conoce el fragmento y se quiere cuantificar se amplifica con primers diseñados a los lados del sitio de interacción Células sin tratar Células tratadas ChIP ChIP PCR

78 Si no se conoce el fragmento se puede identificar sobre microarray: chip ChIP on chip Sobre el chip están depositadas secuencias de DNA genómico conocidas en posiciones determinadas. Esto hace que se puedan identificar los fragmentos de DNA que fueron purificadas junto con la proteína