FISH. Hibridación in situ Fluorescente
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- Lorenzo Flores Páez
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1 FISH Hibridación in situ Fluorescente
2 Es una técnica que combina citogenética clásica con biología molecular. Es una herramienta de utilidad en investigación y diagnóstico en humanos.
3 Se usa para detectar o confirmar anomalías genéticas que generalmente están más allá de la capacidad de resolución de la citogenética de rutina.
4 Pasos Obtener muestra Cultivo celular Inhibidores mitosis Soluciones hipotónicas Fijación Extendidos Coloración: Giemsa o Bandeo
5 Pasos Obtener muestra Cultivo celular Inhibidores mitosis Soluciones hipotónicas Fijación Extendidos Coloración: Giemsa o Bandeo CITO- GENETICA
6 CITOGENÉTICA NÚMERO ESTRUCTURA MORFOLOGÍA COMPORTAMIENTO CROMOSOMA PATOLOGiA GENETICA
7 Técnica standard Coloración con colorante Giemsa NUMERO
8 MORFOLOGÍA Tamaño Posición del centrómero GRUPO MORFOLOGÍA PARES CROMOSÓMICOS A Metacéntricos Grandes B Submetacéntricos Grandes 4 5 C D Submetacéntricos Medianos Acrocéntricos Medianos X E Submetacéntricos Pequeños PARES AUTOSÓMICOS 1 PAR SEXUAL XX ó XY F G Metacéntricos Pequeños Acrocéntricos Pequeños Y
9 Técnica de Bandeo G Tratamiento con tripsina 0.1% Coloración con colorante Giemsa ESTRUCTURA
10 Pasos Obtener muestra Cultivo celular Inhibidores mitosis Soluciones hipotónicas Fijación Extendidos Coloración: Giemsa o Bandeo CITO- GENETICA FISH
11 Protocolo F I S H
12 Tipos de sondas Sec ADN repetitivo: sondas centroméricas. Sec ADN específicas de una región: genes o loci de interés. Sondas de cromosomas enteros: secuencia específica de un determinado cromosoma.
13 Marcación de la sonda: Directa FITC-12-dUTP Rhodamine-6-dUTP Cy3-dCTP Indirecta Biotin-11-dUTP Digoxigenin-11- dutp
14 Sindrome de Williams Se trata de un desorden genético (prevalencia: 1/7500 a 1/20000 RNV), causado por una deleción en el brazo largo del cromosoma 7, específicamente en 7q11.23.
15 El Síndrome de Williams es un trastorno de origen genético, que cursa con trastornos relacionados al desarrollo. Esporádico. Se presenta desde el nacimiento y afecta igualmente a varones y mujeres. No tiene preferencia étnica. Suele manifestarse recién a los 2 ó 3 años.
16 Los síntomas más destacados del síndrome consisten en: expresión fenotípica característica de la cara retraso mental dificultad en el habla defecto coronario de nacimiento, conocido como estenosis supravalvular aórtica (ESA), que se debe a un estrechamiento de la aorta en las proximidades del corazón.
17 La zona de la deleción varía entre mega pares de bases (Mb), e involucra aproximadamente 30 genes. El gen más estudiado dentro de esta zona es el gen de la elastina, una proteína que brinda elasticidad a los vasos sanguíneos y otros tejidos corporales cuya deficiencia causa estenosis aórtica. La deleción se produce casi siempre durante la división celular que da origen al espermatozoide o al óvulo, es decir durante la meiosis.
18 Secuencia Única Síndrome de Williams-Beuren 7q11.23 ELN LIMK1 D7S613 normal 7q23 D7S486 D7S522 deleción
19
20 Limitaciones: 1. Se debe tener un conocimiento previo o una sospecha previa de la naturaleza de la aberración. 2. Se debe contar con la sonda de la región de interés. 3. Sólo se obtiene información de la sonda que se está testeando, cualquier otra anomalía que esté presente no será detectada.
21 Por qué realizar un estudio citogenético??? Indicaciones para el estudio citogenético: 1. Ansiedad materna 2. Hijo previo afectado 3. Historia familiar Un diagnóstico certero y precoz es fundamental para evitar pasos innecesarios y planificar las medidas óptimas de seguimiento y tratamiento de un paciente.
22 Los preparados de Sindrome de Williams fueron gentilmente cedidos por el Dr. Eduardo Pastene. Centro Nacional de Genética Médica, ANLIS ``Dr. Carlos Malbrán``, Ministerio de Salud.
23 Protocolo FISH Slide Preparation -flat nuclei -spread chromosomes Isolation and Purification of DNA probe Labeling Nick translation PCR Labeled probe Place probe on slide Cover with coverslip Examination under a fluorescent microscope Detection 37 o C. O.N. Hybridization Various antibody/washing steps
24 Un isocromosoma es un cromosoma anormal en el que se ha perdido un brazo y el otro se ha duplicado de manera especular, dando lugar a una monosomía parcial debido al brazo perdido, y a una trisomía parcial, debido al brazo duplicado. Se origina durante la meiosis o mitosis, cuando la división del centrómero se produce según el plano horizontal en vez de vertical. Como consecuencia, uno de los brazos del cromosoma original se pierde y los brazos del isocromosoma resultante son genéticamente idénticos entre sí pero en sentido inverso.
25 No se ha determinado de forma precisa cómo son formados los isocromosomas, si bien hay dos mecanismos descritos: Un error de división del centrómero durante la meiosis II. Este es el mecanismo menos frecuente. Un intercambio en un brazo de un cromosoma con su homólogo o cromátida hermana en la porción proximal del brazo adyacente al centrómero. Los últimos cromosomas serían dicéntricos, si bien los dos centrómeros están demasiado juntos como para distinguirlos citogenéticamente. Este es el mecanismo más frecuente.
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