METODOLOGÍA Y TÉCNICAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA. ERRORES FRECUENTES Y SU SOLUCIÓN

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1 METODOLOGÍA Y TÉCNICAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA. ERRORES FRECUENTES Y SU SOLUCIÓN

2 Título original: Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio de Patología Anatómica. Errores frecuentes y su solución Autores: Francisco Javier Torres Gómez, Facultativo Especialista del Área de Anatomía Patológica Antonia Martínez Moyano, T.S.S. de Anatomía Patológica y Citología Pilar Fernández Machín, Facultativo Especialista del Área de Anatomía Patológica Rocío González Rodríguez, T.S.S. de Anatomía Patológica y Citología Edita e imprime: FESITESS ANDALUCÍA C/ Armengual de la Mota 37 Oficina Málaga Teléfono/fax Diseño y maquetación: Alfonso Cid Illescas Edición Octubre 2011

3 ÍNDICE UNIDAD DIDÁCTICA I PRESENTACIÓN Y METODOLOGÍA DEL CURSO Sistema de Cursos a Distancia Orientaciones para el estudio Estructura del Curso 10 UNIDAD DIDÁCTICA II FAMILIARIZACIÓN CON EL LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA Familiarización con el Laboratorio de Anatomía Patológica La muestra 16 UNIDAD DIDÁCTICA III HISTOTECNOLOGÍA. TÉCNICAS TINTORIALES Histotecnología. Introducción Tipos de coloraciones Técnicas tintoriales Tipos de coloraciones del tejido conjuntivo Coloraciones para material amiloide Técnicas para la identificación de glucógeno Técnica de tinción para mucina Técnicas para la identificación de fibrina Técnicas para la identificación de grasas Técnicas para la identificación de pigmentos e iones metálicos Técnica para la detección de iones cálcicos Técnicas para la identificación de microorganismos 49 UNIDAD DIDÁCTICA IV EL PAPEL DEL TEAP EN EL PROCESADO DE LIQUIDOS Introducción Procesamiento de líquidos Obtención de un botón celular 57 UNIDAD DIDÁCTICA V PAPEL DEL TEAP EN LA CONFECCIÓN DE LOS BLOQUES HISTOLÓGICOS Papel del TEAP en la confección de los bloques histológicos 61 UNIDAD DIDÁCTICA VI PAPEL DEL TEAP EN EL PROCESAMIENTO DE MUESTRAS HISTOLÓGICAS Introducción Pasos del procesamiento de las muestras Posibles errores y soluciones en el procesamiento de las muestras Corte al mocrotomo 75 UNIDAD DIDÁCTICA VII PAPEL DEL TEAP EN LA SALA DE MACROSCOPÍA Papel del TEAP en la sala de macroscopía Parte de tallado 87

4 UNIDAD DIDÁCTICA VIII PAPEL DEL TEAP DURANTE LA REALIZACIÓN DE PAAF (PUNCIÓN-ASPIRACIÓN CON AGUJA FINA) Papel del TEAP durante la ralización de PAAF (Punción-aspiración con aguja fina) 91 UNIDAD DIDÁCTICA IX EL TEAP COMO ASISTENTE DEL PATÓLOGO DURANTE LA BIOPSIA INTRAOPERATORIA El TEAP como asistente del patólogo durante la biopsia intraoperatoria Posibles errores y sus soluciones 99 UNIDAD DIDÁCTICA X EL TEAP EN LA SALA DE AUTOPSIAS El TEAP en la sala de autopsias 103 UNIDAD DIDÁCTICA XI EL TEAP Y LAS TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS EL TEAP y las técnicas inmunohistoquímicas 109 UNIDAD DIDÁCTICA XII PAPEL DEL TEAP EN EL ARCHIVO DE CASOS Papel del TEAP en el archivo de casos 117 UNIDAD DIDÁCTICA XIII EL TEAP EN EL CONTROL DE LAS TEMPERATURAS El TEAP en el control de las temperaturas 121 UNIDAD DIDÁCTICA XIV 125 PREVENCIÓN DE RIESGOS LABORALES (PRL) EN EL LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA Prevención de Riesgos Laborales (PRL) en el Laboratorio de Anatomía Patológica Recomendaciones generales para minimizar los riesgos en el Laboratorio Normas generales de seguridad para el almacenamiento de sustancias químicas Recomendaciones particulares 132 UNIDAD DIDÁCTICA XV ARTEFACTOS EN PREPARACIONES HISTOLÓGICAS Y CITOLÓGICAS Artefactos en preparaciones histológicas y citológicas 139 CUESTIONARIO 147 Cuestionario 149

5 UNIDAD DIDÁCTICA I PRESENTACIÓN Y METODOLOGÍA DEL CURSO

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7 Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio A.P. Errores frecuentes y su solución Presentación, normas y procedimientos de trabajo. Introducción Antes de comenzar el Curso, es interesante conocer su estructura y el método que se ha de seguir. Este es el sentido de la presente introducción. Presentación 1. Sistema de Cursos a Distancia En este apartado aprenderá una serie de aspectos generales sobre las técnicas de formación que se van a seguir para el estudio. 2. Orientaciones para el estudio. Si usted no conoce la técnica empleada en los Cursos a Distancia, le recomendamos que lea atentamente los epígrafes siguientes, los cuales le ayudarán a realizar el Curso en las mejores condiciones. En caso contrario, sólo tiene que seguir los pasos que se indican en el siguiente índice: Se dan una serie de recomendaciones generales para el estudio y las fases del proceso de aprendizaje propuesto por el equipo docente. 3. Estructura del Curso Mostramos cómo es el Curso, las Unidades Temáticas de las que se compone, el sistema de evaluación y cómo enfrentarse al tipo test. 1.1 Sistema de Cursos a Distancia Régimen de Enseñanza La metodología de Enseñanza a Distancia, por su estructura y concepción, ofrece un ámbito de aprendizaje donde pueden acceder, de forma flexible en cuanto a ritmo individual de dedicación, estudio y aprendizaje, a los conocimientos que profesional y personalmente le interesen. Tiene la ventaja de estar diseñada para adaptarse a las disponibilidades de tiempo y/o situación geográfica de cada alumno. Además, es participativa y centrada en el desarrollo individual y orientado a la solución de problemas clínicos. La Formación a Distancia facilita el acceso a la enseñanza a todos los Técnicos Especialistas/Superiores Sanitarios Características del Curso y del alumnado al que va dirigido Todo Curso que pretenda ser eficaz, efectivo y eficiente en alcanzar sus objetivos, debe adaptarse a los conocimientos previos de las personas que lo estudiarán (lo que saben y lo que aún no han aprendido). Por tanto, la dificultad de los temas presentados se ajustará a sus intereses y capacidades. Un buen Curso producirá resultados deficientes si lo estudian personas muy diferentes de las inicialmente previstas. Los Cursos se diseñan ajustándose a las características del alumno al que se dirige. 7

8 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Orientación de los Tutores Para cada Curso habrá, al menos, un tutor al que los alumnos podrán dirigir todas sus consultas y plantear las dificultades. Las tutorías están pensadas partiendo de la base de que el aprendizaje que se realiza en esta formación es totalmente individual y personalizado. El tutor responderá en un plazo mínimo las dudas planteadas a través de correo electrónico exclusivamente. Diferenciamos para nuestros Cursos dos tipos de tutores: Académicos. Serán aquellos que resuelvan las dudas del contenido del Curso, planteamientos sobre cuestiones test y casos clínicos. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrónico. Orientadores y de apoyo metodológico. Su labor se centrará fundamentalmente en cuestiones de carácter psicopedagógicas, ayudando al alumno en horarios, métodos de trabajo o cuestiones más particulares que puedan alterar el desarrollo normal del Curso. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrónico. 1.2 Orientaciones para el estudio Los resultados que un estudiante obtiene no están exclusivamente en función de las aptitudes que posee y del interés que pone en práctica, sino también de las técnicas de estudio que utiliza. Aunque resulta difícil establecer unas normas que sean aplicables de forma general, es más conveniente que cada alumno se marque su propio método de trabajo, les recomendamos las siguientes que pueden ser de mayor aprovechamiento. Por tanto, aún dando por supuestas la vocación y preparación de los alumnos y respetando su propia iniciativa y forma de plantear el estudio, parece conveniente exponer algunos patrones con los que se podrá guiar más fácilmente el desarrollo académico, aunque va a depender de la situación particular de cada alumno y de los conocimientos de la materia del Curso: Decidir una estrategia de trabajo, un calendario de estudio y mantenerlo con regularidad. Es recomendable tener al menos dos sesiones de trabajo por semana. Elegir el horario más favorable para cada alumno. Una sesión debe durar mínimo una hora y máximo tres. Menos de una hora es poco, debido al tiempo que se necesita de preparación, mientras que más de tres horas, incluidos los descansos, puede resultar demasiado y descendería el rendimiento. Utilizar un sitio tranquilo a horas silenciosas, con iluminación adecuada, espacio suficiente para extender apuntes, etc. Estudiar con atención, sin distraerse. Nada de radio, televisión o música de fondo. También es muy práctico subrayar los puntos más interesantes a modo de resumen o esquema. 8

9 Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio A.P. Errores frecuentes y su solución a) Fase receptiva. Observar en primer lugar el esquema general del Curso. Hacer una composición de lo que se cree más interesante o importante. Leer atentamente todos los conceptos desarrollados. No pasar de uno a otro sin haberlo entendido. Recordar que en los Cursos nunca se incluyen cuestiones no útiles. Anotar las palabras o párrafos considerados más relevantes empleando un lápiz o rotulador transparente. No abusar de las anotaciones para que sean claras y significativas. Esquematizar en la medida de lo posible sin mirar el texto el contenido de la Unidad. Completar el esquema con el texto. Estudiar ajustándose al horario, pero sin imbuirse prisas o impacientarse. Deben aclararse las ideas y fijarse los conceptos. Resumir los puntos considerados primordiales de cada tema. Marcar los conceptos sobre los que se tengan dudas tras leerlos detenidamente. No insistir de momento más sobre ellos. b) Fase reflexiva. Reflexionar sobre los conocimientos adquiridos y sobre las dudas que hayan podido surgir, una vez finalizado el estudio del texto. Pensar que siempre se puede acudir al tutor y a la bibliografía recomendada y la utilizada en la elaboración del tema que puede ser de gran ayuda. Seguir paso a paso el desarrollo de los temas. Anotar los puntos que no se comprenden. Repasar los conceptos contenidos en el texto según va siguiendo la solución de los casos resueltos. c) Fase creativa. En esta fase se aplican los conocimientos adquiridos a la resolución de pruebas de autoevaluación y a los casos concretos de su vivencia profesional. Repasar despacio el enunciado y fijarse en lo que se pide antes de empezar a solucionarla. Consultar la exposición de conceptos del texto que hagan referencia a cada cuestión de la prueba. Solucionar la prueba de cada Unidad Temática utilizando el propio cuestionario del manual. 9

10 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología 1.3 Estructura del Curso Contenidos del Curso Guía del alumno. Temario del curso en PDF, con un cuestionario tipo test. FORMULARIO, para devolver las respuestas al cuestionario. ENCUESTA de satisfacción del Curso Los Cursos Los cursos se presentan en un archivo PDF cuidadosamente diseñado en Unidades Didácticas Las Unidades Didácticas Son unidades básicas de estos Cursos a distancia. Contienen diferentes tipos de material educativo distinto: Texto propiamente dicho, dividido en temas. Bibliografía utilizada y recomendada. Cuestionario tipo test. Los temas comienzan con un índice con las materias contenidas en ellos. Continúa con el texto propiamente dicho, donde se desarrollan las cuestiones del programa. En la redacción del mismo se evita todo aquello que no sea de utilidad práctica. El apartado de preguntas test serán con los que se trabajen, y con los que posteriormente se rellenará el FORMULARIO de respuestas a remitir. Los ejercicios de tipo test se adjuntan al final del temario. Cuando están presentes los ejercicios de autoevaluación, la realización de éstos resulta muy útil para el alumno, ya que: Tienen una función recapituladora, insistiendo en los conceptos y términos básicos del tema. Hacen participar al alumno de una manera más activa en el aprendizaje del tema. Sirven para que el alumno valore el estado de su aprendizaje, al comprobar posteriormente el resultado de las respuestas. Son garantía de que ha estudiado el tema, cuando el alumno los ha superado positivamente. En caso contrario se recomienda que lo estudie de nuevo. Dentro de las unidades hay distintos epígrafes, que son conjuntos homogéneos de conceptos que guardan relación entre sí. El tamaño y número de epígrafes dependerá de cada caso. 10

11 Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio A.P. Errores frecuentes y su solución Sistema de Evaluación Cada Curso contiene una serie de pruebas de evaluación a distancia que se encuentran al final del temario. Deben ser realizadas por el alumno al finalizar el estudio del Curso, y enviada al tutor de la asignatura, con un plazo máximo de entrega para que pueda quedar incluido en la edición del Curso en la que se matriculó y siempre disponiendo de 15 días adicionales para su envío. Los tutores la corregirán y devolverán al alumno. Si no se supera el cuestionario con un mínimo del 80% correcto, se tendrá la posibilidad de recuperación. La elaboración y posterior corrección de los test ha sido diseñada por el personal docente seleccionado para el Curso con la intención de acercar el contenido de las preguntas al temario asimilado. Es IMPRESCINDIBLE haber rellenado el FORMULARIO y envío de las respuestas para recibir el certificado o Diploma de aptitud del Curso Fechas El plazo de entrega de las evaluaciones será de un mes y medio a partir de la recepción del material del curso, una vez pasado este plazo conllevará una serie de gestiones administrativas que el alumno tendrá que abonar. La entrega de los certificados del Curso estará en relación con la fecha de entrega de las evaluaciones y NUNCA antes de la fecha de finalización del Curso Aprendiendo a enfrentarse a preguntas tipo test La primera utilidad que se deriva de la resolución de preguntas tipo test es aprender cómo enfrentarnos a las mismas y evitar esa sensación que algunos alumnos tienen de se me dan los exámenes tipo test. Cuando se trata de preguntas con respuesta tipo verdadero / falso, la resolución de las mismas está más dirigida y el planteamiento es más específico. Las preguntas tipo test con varias posibles respuestas hacen referencia a conocimientos muy concretos y exigen un método de estudio diferente al que muchas personas han empleado hasta ahora. Básicamente todas las preguntas test tienen una característica común: exigen identificar una opción que se diferencia de las otras por uno o más datos de los recogidos en el enunciado. Las dos palabras en cursiva son expresión de dos hechos fundamentales con respecto a las preguntas tipo test: Como se trata de identificar algo que va a encontrar escrito, no va a ser necesario memorizar conocimientos hasta el punto de reproducir con exactitud lo que uno estudia. Por lo tanto, no debe agobiarse cuando no consiga recordad de memoria una serie de datos que aprendió hace tiempo; seguro que muchos de ellos los recordará al leerlos formando parte del enunciado o las opciones de una pregunta de test. El hecho de que haya que distinguir una opción de otras se traduce en muchas ocasiones en que hay que estudiar diferencias o similitudes. Habitualmente se les pide recordar un dato que se diferencia de otros por 11

12 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología ser el más frecuente, el más característico, etc. Por lo tanto, este tipo de datos o situaciones son los que hay que estudiar. Debe tenerse siempre en cuenta que las preguntas test hay que leerlas de forma completa y fijándose en determinadas palabras que puedan resultar clave para la resolución de la pregunta. La utilidad de las preguntas test es varia: Acostumbrarse a percibir errores de conceptos. Adaptarse a los exámenes de selección de personal. Ser capaces de aprender sobre la marcha nuevos conceptos que pueden ser planteados en estas preguntas, conceptos que se retienen con facilidad Envío Una vez estudiado el material docente, se contestará la encuesta de satisfacción, la cual nos ayudará para evaluar el Curso, corregir y mejorar posibles errores. Cuando haya cumplimentado la evaluación, envíe las respuestas a la dirección indicada. 12

13 UNIDAD DIDÁCTICA II FAMILIARIZACIÓN CON EL LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA.

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15 Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio A.P. Errores frecuentes y su solución 2.1 Familiarización con el Laboratorio de Anatomía Patológica El técnico especialista en Anatomía Patológica (TEAP), en consecuencia con su titulación, debería estar preparado para asumir las distintas labores desempeñadas en la práctica habitual de un laboratorio de Anatomía Patológica (Histotecnología); no obstante, las limitaciones propias de la docencia de los centros de formación, junto al gran número de técnicas y métodos incorporados a la rutina de los laboratorios, establece una serie de necesidades y conocimientos por parte del TEAP que en muchos casos sólo se conseguirán con el estudio y la experiencia. Pretendemos con este manual, realizar una sencilla aproximación a la rutina diaria de un laboratorio de Anatomía Patológica, haciendo hincapié en los problemas más comunes que puedan surgirle al TEAP en el desempeño de sus funciones, ofreciendo soluciones o propuestas que puedan ayudarle a salir airoso de los problemas que le puedan surgir. El TEAP debe de adquirir un compromiso vital y profesional en el desempeño de sus funciones, y debe de ser plenamente consciente de la repercusión que sus actos pueden significar en la cadena diagnóstica y en colectivo de profesionales del laboratorio. El TEAP tiene responsabilidades, y debe de asumirlas en el contexto del trabajo en equipo; para ello, es fundamental una formación adecuada, capacidad de autocrítica, aptitud y actitud, que se reflejarán en la efectividad y eficacia del trabajo realizado. El TEAP es una parte fundamental del equipo que trabaja en el laboratorio de Anatomía Patológica, y es imprescindible para que el trabajo global del laboratorio luzca en su medida. Si bien el patólogo es el facultativo responsable en último término de la emisión de diagnósticos, su labor se ve mermada sin el acompañamiento de una adecuada técnica, de la que el técnico es el responsable. El TEAP es asimismo carta de presentación de un laboratorio en cuanto su trabajo puede llegar a traspasar los límites físicos del mismo (presentaciones, ponencias, ilustraciones de manuales, etc ), es eslabón imprescindible en la consecución de objetivos y es fundamental al hacer posible el diagnóstico con su buen hacer. Por todo ello, el TEAP debe de ser consciente y consecuente con el papel real que desempeña, y actuar en consecuencia; Una de las primeras cosas que debe de hacer el TEAP a la hora de formar parte del equipo de trabajadores del laboratorio de Anatomía Patológica es familiarizarse con las rutinas del mismo; ello conlleva un proceso gradual de adaptación. Recomendamos dejarnos guiar por el personal más experimentado, que a buen seguro será el método más eficaz para esta primera aproximación en la que aun no hemos adquirido criterio. Uno de los pilares básicos en la organización de un laboratorio de Anatomía Patológica es el establecimiento y seguimiento de una serie de protocolos individualizados para cada una de las tareas a realizar. El TEAP debe de familiarizarse con las distintos tipos de muestras que se reciben en el laboratorio, diferentes según la categoría del centro, su cartera de servicios y su volumen de trabajo. 15

16 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología 2.2 La muestra Se entiende por muestra cualquiera de los especimenes orgánicos que son remitidos al laboratorio de Anatomía Patológica con el fin de obtener un diagnóstico. Existen múltiples tipos de muestras, las cuales pueden ser categorizadas en una primera aproximación como: 1. Citologías 2. Biopsias 3. Piezas quirúrgicas 4. Necropsias Si exceptuamos las necropsias debido a su peculiar naturaleza, pasamos a exponer el circuito normalizado que deben de seguir los distintos especimenes desde su obtención hasta la emisión de un diagnóstico, proceso complejo en el que el TEAP juega un papel primordial. A. Obtención de la muestra B. Identificación de la muestra en origen C. Envasado de la muestra D. Transporte E. Recepción F. Distribución G. Registro H. Procesado I. Estudio No hace falta especificar que la persona responsable de la obtención de la muestra es el facultativo responsable en origen. Según organización interna, la muestra será identificada y envasada por la persona asignada a tal función (auxiliar de enfermería, DUE, etc ), con las suficientes garantías para que no se produzcan errores preanalíticos. Tras el transporte, se produce la recepción de la muestra en el laboratorio de Anatomía Patológica. Digamos que es aquí donde interviene por primera vez el TEAP, que será el encargado de supervisar la entrega y comprobar la concordancia entre número y tipo de muestras con sus respectivos informes de petición de estudio anatomopatológico (el impreso de petición debe de ser el normalizado para tal fin, estando debidamente cumplimentados los datos básicos requeridos). En el caso de que se reciban varias partidas de muestras al mismo tiempo, el técnico es el responsable de priorizar y organizar la citada recepción, de modo que se clasifiquen las muestras según su orden de llegada y procedencia. Asimismo, será el TEAP el encargado de realizar la primera valoración macroscópica del espécimen recibido, pudiendo detectar errores de etiquetado, de presentación, relativos al líquido fijador, relativos al envase, etc Se trata de un paso de vital importancia pues a partir de entonces la muestra es asumida por el laboratorio, que será responsable, en su medida, de posibles errores detectados con posterioridad. 16

17 Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio A.P. Errores frecuentes y su solución La distribución dependerá del método de trabajo adoptado por cada laboratorio y no se pueden hacer generalizaciones al respecto. La clasificación de las muestras según su categoría y naturaleza en citologías y biopsias-piezas quirúrgicas parece ser la más adecuada e intuitiva. El registro de las muestras es un paso sumamente importante en cuanto que de su incorrecta realización se pueden derivar errores de gran trascendencia. Hoy en día existen programas informáticos sumamente eficaces en el registro de las muestras si bien no hay que olvidar que es la mano humana la que introduce tales datos en el mismo. Por tanto, habrá que ser muy cuidadoso a la hora de afrontar este paso. Generalmente es el programa informático el que asigna un número de identificación a la muestra, pero el TEAP y el patólogo van a trabajar a pie de campo con los informes de petición de estudio anatomopatológico; esta hoja de petición debe de estar correctamente identificada y para ello el TEAP la rotulará con el número identificativo asignado (Ej. B ), comprobando en un segundo tiempo la concordancia entre los datos de filiación del paciente con los consignados en el contenedor de la muestra. En muchos centros se lleva a cabo un registro paralelo en formato papel que si bien no es considerado oficial en algunos casos, permite localizar con rapidez y eficacia distintos errores para los que el programa informático no está familiarizado. Estos pasos contribuyen a elevar el nivel de seguridad y trazabilidad de la muestra. La labor del TEAP constituye un filtro inestimable a la labor propia del patólogo. Esta función se pone de manifiesto de forma importante en este paso de la cadena diagnóstica, es decir, en el registro de la muestra: Llegamos a otro punto de vital importancia en cuanto al papel del TEAP se refiere: el procesado de las muestras; aquí cobra vital importancia la naturaleza de la muestra a procesar pues el proceder será completamente distinto si nos referimos a una muestra citológica que cuando nos referimos a una muestra histológica. No nos detendremos en este punto en un análisis y descripción detallada del proceso, que será abordado en otro momento. Baste decir que del correcto procesado de la muestra dependerá en parte la posibilidad de que el patólogo pueda considerar valorable la muestra y por tanto emitir un diagnóstico en consecuencia. No nos cansaremos de recalcar el importante papel que juega el TEAP en este momento. De una mala técnica derivan gran parte de los errores interpretativos y, por tanto, será el punto de mayor tensión en la relación del TEAP con el facultativo. El patólogo, preocupado con el resultado de la técnica, exigirá corrección en la misma y rechazará las muestras que no cumplan con unos estándares mínimos de calidad. Si bien hoy en día el procesado de gran parte de las muestras es realizado con la ayuda de tecnología avanzada, la mano del TEAP será la que guíe su manejo, convirtiéndose en el responsable último del mismo así como de la subsanación de los errores que se pudieran derivar de su incorrecto funcionamiento. No debe el TEAP perder perspectiva y olvidarse de la técnica manual por la que se ha caracterizado tradicionalmente; la tecnología ayuda, pero no suple el saber que el técnico debe de atesorar para la realización de sus funciones pues no se entiende la figura del TEAP sin esta última cualidad; no es exagerar decir que la mayor parte del trabajo ejecutado por el técnico en su quehacer diario se realiza de modo manual. Es por ello fundamental dominar las técnicas manuales. 17

18 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Tras el procesado, las preparaciones citológicas e histológicas obtenidas serán debidamente presentadas y entregadas al patólogo para su estudio y diagnóstico. A continuación, iremos desgranando las distintas actividades desarrolladas por el TEAP. A las definiciones y protocolos intentaremos añadirles reflexiones, trucos o consejos, muchos de ellos fruto de la experiencia personal. Hemos decidido dar el primer paso analizando las distintas técnicas tintoriales usadas en el laboratorio. El TEAP que se precie se serlo debe de conocerlas. Existen distintos manuales que abordan el tema; creemos que la progresión que vamos a seguir en este manual es de fácil entendimiento. Aparte de conocer las distintas técnicas, no está de más que el TEAP conserve un manual en un lugar asequible, próximo a su puesto de trabajo, pues el desempeño de las labores diarias genera dudas que deben de ser resueltas. 18

19 UNIDAD DIDÁCTICA III HISTOTECNOLOGÍA. TÉCNICAS TINTORIALES

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21 Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio A.P. Errores frecuentes y su solución 3.1 Histotecnología. Introducción Sería sumamente difícil, si no imposible, distinguir los distintos componentes tisulares y celulares sin el auxilio de técnicas tintoriales que pusieran de manifiesto estructuras diferenciadas. La distinta afinidad, cualitativa o cuantitativa de dichas estructuras por uno u otro colorante será decisiva para el éxito de la técnica tintorial aplicada. Existe un amplio número de técnicas tintoriales, utilizadas con distinta frecuencia en los laboratorios de Anatomía Patológica de modo que podríamos hacer una subdivisión ficticia de la mismas en tinciones de uso frecuente o rutina y tinciones de uso infrecuente. La coloración como método de diferenciación estructural tiene sus orígenes en el siglo XVIII, utilizada por Van Leeuwenhoek para teñir fibras musculares estriadas de tejido animal con azafrán en vino. La esencia de una técnica tintorial es el colorante; estos pueden ser divididos según su origen en naturales o artificiales. También podemos dividirlos según su afinidad tintorial, tal como pasamos a detallar: Colorantes básicos: son los que presentan afinidad por estructuras aniónicas (ácidas). - Hematoxilinas - Azul de metileno - Azul de toloudina - Violeta de metilo - Verde de metilo - Rojo nuclear Colorantes ácidos: son los que presentan afinidad por estructuras básicas. - Eosinas - Fascina ácida - Orange G - Verde brillante - Eritrosina Colorantes neutros + sal: son los que presentan afinidad tanto por las estructuras ácidas y básicas. - Giemsa Colorantes indiferentes: actúan como disolventes dentro del tejido. - Sudán - Escarlata 21

22 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Colorantes metacromáticos - Azul de tolouidina - Tionina - Azul de Cresil - Azul B de metilo 3.2 Tipos de coloraciones a) Coloración progresiva: la coloración actúa hasta que se alcance la intensidad deseada. b) Coloración regresiva: es a lo que se le llama diferenciación; se sobrecolorea y luego se elimina lo que no se quiere. c) Coloración terminal: la coloración dependerá del tiempo que la dejemos actuar. d) Coloración de la muestra incluida en el bloque tisular: nos referimos a la tinción realizada sobre la muestra o tejido previamente a la inclusión. e) Coloración de cortes: la tinción se realiza tras haber incluido y realizado los cortes f) Coloración de inclusión sobre el porta: en este caso el porta no es el que se introduce en el colorante sino que se vierten unas gotas del colorante sobre el porta y secamos con papel de filtro el sobrante. g) Coloración sucesiva: como su nombre indica se van añadiendo los colorantes de modo sucesivo. h) Coloración simultánea: la solución que aplicamos contiene varios colorantes. i) Impregnación: esta forma de colorear con sales metálicas, hace que se originen precipitados en las estructuras que queremos ver. 3.3 Técnicas tintoriales Las técnicas para histotecnología se pueden clasificar en: Técnicas de rutina Se denominan de rutina o rutinarias aquellas técnicas se uso común y frecuente en el laboratorio de Anatomía Patológica, bien para la tinción de muestras tisulares o bien para la tinción de muestras citológicas. Constituyen uno de los pilares fundamentales del trabajo diario del TEAP y por ello su conocimiento teórico y práctico son imprescindibles y exigibles, sirviendo para evaluar de modo primario las habilidades profesionales de quien las ejecuta. Debido a que el patólogo necesita una buena técnica para realizar su trabajo, exigirá al técnico la excelencia de la misma; por tanto, una buena técnica no sólo será la carta de presentación del técnico sino una de los principales motivos de conflicto en el caso de que la calidad no alcance los niveles mínimos exigibles. 22

23 Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio A.P. Errores frecuentes y su solución Relacionando en cierto modo el término técnica con el término tinción o coloración, vamos a repasar las técnicas tintoriales más utilizadas en los laboratorios de Anatomía Patológica: Técnicas tintoriales en histología. Hematoxilina-Eosina La más utilizada es la conocida como HEMATOXILINA- EOSINA, utilizada cada día en todos los hospitales del mundo por poseer gran poder de resolución, por ser una técnica económica, y por tanto eficiente, y por ser fácil de realizar. La tinción manual con hematoxilina-eosina está siendo relegada al desuso debido a la emergente introducción en los laboratorios de Anatomía Patológica de teñidores automáticos que simplifican el trabajo. No obstante, el TEAP debe de conocer el protocolo o pasos a seguir para la realización de dicha técnica, y es lógica esta aseveración. Existen numerosas eventualidades en las que será necesario recurrir a técnicas manuales (fallos técnicos, averías ) y el TEAP debe de afrontarlas con naturalidad. Empecemos por conocer el fundamento de la técnica de hematoxilina-eosina: La Hematoxilina es un colorante natural que se extrae del árbol del Hematoxyloncumpechianum, palo de campestre o palo azul de Centroamérica. Al oxidarse, adquiere un color morado oscuro, pasando a ser denominado hemateína. Al proceso de oxidación también se le conoce como maduración de la hematoxilina. La hematoxilina se utiliza en histología para teñir componentes aniónicos (ácidos) de los tejidos, a los que aporta una coloración violeta (tiñe intensamente los núcleos de las células, ya que estos contienen ácidos nucleicos ricos en radicales ácidos). Tal como se obtiene de la planta, e incluso tras sufrir el proceso de oxidación, su capacidad de tinción es muy limitada. Por lo tanto, debe combinarse con iones metálicos, especialmente sales de hierro o aluminio, que actúan como mordiente ; de ahí la importancia que tienen tanto una buena oxidación como un buen mordiente y su proporción adecuada. Las hematoxilinas que más se utilizan son: la hematoxilina de Harris y la hematoxilina de Gill. Hematoxilina de Harris( composición) - Hematoxilina gr. - Alumbre aluminio potasio sulfato 12-hidrato gr. Hematoxilina de Gill II (composición) - Hematoxilina gr. - Alumbre aluminio sulfato 18-hidrato gr. En cuanto a la eosina, se utiliza para teñir los citoplasmas que son los componentes básicos de la célula, a los que aporta una coloración rosada anaranjada. Tiñe intensamente el citoplasma de las células y los componentes extracelulares. Se emplea en solución acuosa y alcohólica; centrémonos en la solución alcohólica. En su preparación intervienen dos pasos. Solución stock o solución madre: - Eosina Y gr. - Agua destilada ml. 23

24 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Se disuelve removiendo y calentando la solución. Cuando esté disuelta, enfriar y añadir: - Etanol 96º ml. Solución de trabajo o eosina hija: - Solución stock madre ml. - Alcohol 80º ml. Añadir 0.5 ml de ácido acético por cada 100 ml. de solución de trabajo. Tanto la eosina madre (solución stock) como la hija (solución de trabajo), deben almacenarse en frascos opacos. El TEAP será el responsable tanto del tratamiento como del almacenamiento, conservación y revisión de las reservas. El resultado final de la tinción dependerá mucho de la manipulación y la conservación de los reactivos, especialmente en el caso de la eosina pues la hematoxilina generalmente se suministra en soluciones prediluidas con lo cual, el riesgo de pérdida de intensidad de tinción tras su uso es menor. La eosina alcohólica es una fórmula que está comercializada; aunque la calidad de contraste no es la misma, es preciso valorar otros aspectos interesantes como pueden ser: el ahorro de tiempo y de espacio (no se almacenan tantos reactivos), y la perdida de calidad tintorial debida a una mala manipulación del colorante. Además de los dos colorantes base de la tinción, la realización de la técnica requiere: alcoholes de diferentes graduaciones (70º,96º, 100º), xileno, alcohol ácido, carbonato de litio y agua corriente. Realización de la técnica: 1. Retirar los restos de parafina: utilizaremos un disolvente siendo el xileno el más utilizado. 2. Hidratación de la muestra: después de la retirada de la parafina, hay que hidratar esa preparación y lo haremos con una batería de alcoholes de gradación decreciente: 100º o absoluto, 96º, 70º. 3. Coloración nuclear con hematoxilina. 4. Diferenciación: ahora nos tocaría retirar el exceso de hematoxilina con alcohol ácido (eliminamos tinción no selectiva a de baja afinidad). La retirada del sobrante tiene como finalidad dejar libre la entrada al colorante citoplasmático. 5. Viraje: este paso hace que la coloración morada de la hematoxilina se intensifique. 6. Coloración citoplasmática con eosina: en este paso hay que tener cuidado con el exceso de eosina, para que haya un buen contraste núcleocitoplasma. 7. Deshidratación: retiraremos el agua del tejido para poder más tarde poder introducir el medio de montaje. 8. Aclarado: se llama así al paso anterior al montaje y consiste en pasar los cortes histológicos por xileno, que los limpiará de restos de alcohol absoluto y al mismo tiempo servirá como medio de disolución para el DPX (medio de montaje). 24

25 Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio A.P. Errores frecuentes y su solución 9. Montaje: el montaje se realizará después de haber pasado la muestra con anterioridad por el disolvente, para la retirada de los alcoholes. Realización de la técnica: 1. Fijación y desparafinación con calor... aprox.20 m. 2. Xileno m. 3. Xileno m. 4. Alcohol absoluto... 5 s. 5. Alcohol 96º... 5 s. 6. Alcohol 70º... 5 s. 7. Hematoxilina m. 8. Agua corriente... 1 m. 9. Alcohol ácido... 5 s. 10. Carbonato de litio s. 11. Agua corriente... 1 m. 12. Eosina s. 13. Agua corriente... 5 s. 14. Alcohol 70º... 5s. 15. Alcohol 96º... 5s. 16. Alcohol 100º... 5 s. 17. Alcohol 100º... 5 s. 18. Alcohol 100º... 1 m. 19. Xileno... 1 m. 20. Xileno... 1 m. 21. Xileno... 1 m. 22. Montaje con DPX Tras su montaje, las preparaciones histológicas son revisadas, etiquetadas y presentadas al patólogo, quien en última instancia valorará la calidad de la técnica Técnicas utilizadas en citología Las más utilizadas son la tinción de PAPANICOLAOU y el PAPNÓPTICO RÁPIDO. Las técnicas nombradas con anterioridad se diferencian en el tiempo de respuesta ante el diagnostico aunque su finalidad sea la misma Técnica de Papanicolau La técnica de Papanicolau (Pap), técnica de elección para la tinción de las muestras de citología ginecológica exfoliativa requiere una fijación previa de las muestras, labor que debe de ser ejercida en el mismo momento de la toma. Generalmente es el personal auxiliar o el mismo facultativo quien realiza la fijación. Para ello sólo hace falta disponer de un fijador en spray (cytospray o similar) siendo asimismo posible realizar una fijación utilizando lacas comunes. 25

26 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Una vez recibida la muestra citológica fijada, se procederá a su registro y posterior tinción. Resumimos a continuación los diferentes pasos de la misma: Realización de la técnica: 1. Alcohol70º (para retirar el exceso de citospray)... 5 s. 2. Hematoxilina de Harris m. 3. Agua corriente... 1 m. 4. Alcohol ácido... 5 s. 5. Agua corriente... 1 m. 6. Carbonato de litio s. 7. Agua corriente... 1 m. 8. Orange G m. 9. EA m. 10. Alcohol 70º... 5 s. 11. Alcohol 96º... 5 s. 12. Alcohol 100º... 5 s. 13. Alcohol 100º... 5 s. 14. Alcohol 100º... 5 s. 15. Xileno... 5 s. 16. Xileno... 5 s. 17. Xileno... 1 m. 18. Montaje con DPX. Las preparaciones citológicas se repasarán y se etiquetarán previamente a ser entregadas a los patólogos Técnica del panóptico rápido Como su denominación indica, se trata de un método de tinción rápido y eficaz, utilizado principalmente en aquellos casos en los que urge hacer un diagnóstico o bien hacerse una idea de las características generales de la muestra. Es por ello por lo que su uso principal se desarrolla tanto en el acto intraoperatorio como en las muestras obtenidas por PAAF. Durante el acto intraoperatorio, es crucial aportar el diagnóstico más exacto posible en el menor tiempo posible y por tanto será muy importante contar con una tinción rápida que nos proporcione resultados óptimos. Por su parte, las muestras obtenidas mediante punción con aguja fina (PAAF), en ciertas ocasiones precisan de esta rapidez, en concreto en aquellos casos en los que es necesario comprobar si hay suficiente material en aras de realizar nuevas punciones si éste no lo fuera. Esta tinción se practica principalmente sobre material sin fijar si bien puede ser aplicada a muestras fijadas, previamente deshidratadas mediante inmersión en solución alcohólica de 70º. Se trata de una de las variantes de la tinción de Romanowski, morada, que permite observar la morfología nuclear pero no la estructura del núcleo. 26

27 Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio A.P. Errores frecuentes y su solución Realización de la técnica 1. Sumergir la/s preparaciones en la solución 1 (fijador) durante 30 s. 2. Sumergir la/s preparaciones en la solución 2 (colorante citoplasmático) 15 s. 3. Sumergir la/s preparaciones en al solución 3 (colorante nuclear) 30 s. Posteriormente se realiza un baño con agua destilada. Los portaobjetos se dejan secar al aire libre para proceder a continuación a su montaje (este montaje puede diferirse a un segundo tiempo tras la visualización del patólogo). En aquellos casos en los que nos urja en exceso la visualización de la muestra, podemos realizar un baño de diez pasadas o inmersiones en cada una de las soluciones previas al aclaración con agua Técnicas especiales para histología y citología Podemos definir, en un primer tiempo, las técnicas especiales como aquellas que no son de rutina. Se trata de una definición vaga e imprecisa pero en cambio útil desde el punto de vista didáctico. Se trata de técnicas a las que se recurre cuando se quieren poner de manifiesto estructuras o componentes tisulares para los que las técnicas de rutina no son lo suficientemente específicas o aclaradoras. El TEAP realizará dichas técnicas tras la petición específica por parte del patólogo o bien siguiendo las directrices dictadas por los protocolos de cada laboratorio: muchas técnicas de las consideradas especiales han pasado a formar parte de la rutina de determinados laboratorios e incluso su realización podría ser considerada de rutina de modo generalizado; tal es el caso de la realización de un Giemsa a todas las biopsias gástricas antrales con el fin de poner de manifiesto el microorganismo Helicobacter Pylori o bien la realización de un PAS a todas las biopsias esofágicas remitidas con sospecha de Esófago de Barrett. En otras ocasiones es imprescindible la realización de las técnicas especiales para el estudio de determinados tejidos, como es el caso de las biopsias hepáticas (se realiza un PAS, un Tricrómico de Masson, una reticulina y una tinción específica para el hierro) o renales. Las técnicas especiales pueden ser divididas de acuerdo con el tejido o estructura diana que queramos poner de manifiesto. Esta será la clasificación que tomaremos como referencia en este manual: Técnicas para tejido conjuntivo (conectivo). Los métodos de tinción para este tejido son muy variados, dependiendo del componente o estructura del mismo que queramos poner de manifiesto/resaltar: - Los fibroblastos son los principales componentes celulares del tejido conectivo. Su identificación se ve facilitada con la aplicación la Hematoxilina fosfotúngstica de Mallory si bien a tal efecto también será útil el Tricrómico de Masson. - Los mastocitos se identifican fácilmente con Azul de toluidina, que tiñe los gránulos con una tonalidad rojiza (fenómeno conocido como metacromasia: adquisición de un color diferente aplicado) También se puede aplicar un Azul Alcián-PAS. - Los adipositos o células grasas poseen problemas para la fijación; sin embargo se pueden identificar son la Solución de Flemming. - Las fibras de colágeno se tiñen de color verde con el Tricrómico de Masson. 27

28 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología - Las fibras elásticas adquieren un color pardusco con la tinción de Orceína de Van Gieson. - La fibras de reticulita son positivas con la tinción de PAS aunque se ponen mejor de manifiesto tras la aplicación de impregnaciones argénticas. FIBRAS DE COLÁGENO ACIDÓFILAS, H-E: ROSA TRICROMICO DE MASSON (VERDES). FIBRAS ELÁSTICAS SE TIÑEN MAL CON H-E ORCEÍNA DE VAN-GIESON (NEGRAS PARDUSCAS). FIBRAS DE RETICULINA NO SON VISIBLES CON H-E IMPREGNACIONES ARGENTICAS (NEGRAS). 3.4 Tipos de coloraciones del tejido conjuntivo Coloración para fibras de colágeno El principal componente del tejido conectivo es el colágeno. La aplicación de una tinción tricrómica de Masson facilita la detección de las mismas debido a la adquisición de un tono verdoso atribuible a la afinidad de los componentes tintoriales por las fibras de colágeno tipo I. La técnica se fundamenta en la permeabilidad del tejido conectivo a los diferentes colorantes y al grado de dispersión de los mismos. Para ello utilizaremos una hematoxilina férrica que tiña los núcleos (hematoxilina de Weigert), un mordiente para bloquear los residuos existentes en el tejido (solución de ácido fosfotúngstico y ácido fosfomolíbdico en disolución) y colorantes ácidos de diferente densidad para el citoplasma, el colágeno, etc (fucsina ácida para los citoplasmas, azul de anilina o en su defecto verde luz para las fibras de colágeno). Reactivos utilizados en la técnica: Hematoxilina de Weigert. Para su preparación seguiremos los siguientes pasos. Solución A: Solución B: Hematoxilina base... 1 gr. Etanol de 95º ml. Cloruro férrico anhidro... 4 gr. Agua destilada ml. Solución de trabajo: mezclar a partes iguales las soluciones A y B. Preparar en fresco y añadir: CLH concentrado.1 ml. La fuscina ácida, el azul de anilina y el verde luz están en el mercado en forma soluciones preparadas. No obstante, el TEAP puede prepararlos manualmente siguiendo las siguientes indicaciones. 28

29 Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio A.P. Errores frecuentes y su solución Procedimiento a seguir para la realización de la técnica TRICRÓMICO DE MASSON: 1. Desparafinar el corte histológico 2. Hidratar hasta llegar al agua destilada (alcoholes con graduación decreciente) 3. Teñir con la hematoxilina de Weigert durante 5 minutos. 4. Lavar con abundante agua corriente aprox. 2 minutos y en un segundo paso, lavar con agua destilada. 5. Teñir con fucsina ácida durante 5 minutos. 6. Lavar con agua destilada. 7. Aplicar la solución de ácido fosfotúngstico y fosfomolíbdico durante 10 minutos. 8. Teñir con azul de anilina durante 5 minutos. 9. Lavar con agua destilada. 10. Diferenciar con la solución de ácido acético al 1% durante minutos. 11. Deshidratar, aclarar y montar. Resultados: Núcleos... Azul-morado Citoplasmas, fibras musculares, queratina... Rojo Fibras de colágeno y reticulina... Azul También podemos utilizar otra variante de la técnica tricrómica de Masson, más sencilla, que sería la siguiente: 1. Desparafinar el corte histológico. 2. Hidratar hasta llegar al agua destilada. 3. Aplicar cloruro de mercurio en saturación durante 30 minutos (*) 4. Lavar con agua destilada. 5. Teñir con hematoxilina de Harris durante 5 minutos. 6. Lavar con agua destilada. 7. Teñir con fucsina ácida escarlata durante 5 minutos. 8. Lavar con agua destilada. 9. Solución de trabajo de ácido fosfotúnsgtico / ácido fosfomolíbdico (**) 10. Teñir con azul de Anilina durante 5 minutos. 11. Ácido acético al 1% durante minutos. 12. Deshidratar, aclarar y montar. (*) Solución de cloruro de mercurio: Cloruro de mercurio en polvo, añadir agua destilada hasta saturación. (**) Solución de trabajo ácido fosfotúngstico / ácido fosfomolíbdico: 29

30 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología 1 parte de ácido. Fosfotúngstico... 1 ml. 1 parte de ácido. Fosfomolíbdico... 1 ml. 2 partes de agua destilada... 2 ml. Mezclar bien y usar en el momento (la solución pierde su función si su acción se prolonga en el tiempo). Los resultados obtenidos en cuanto a tonalidad son similares a los obtenidos en la variante de la técnica anteriormente descrita Coloración para fibras elásticas Las fibras elásticas se encuentran principalmente en vasos sanguíneos, pulmón, piel, etc... Estas fibras absorben muy poca eosina cuando se tiñen con H-E ya que la elastina tiene una baja concentración en aminoácidos polares; es por eso por lo que acudimos a las técnicas de Orceína y Hematoxilina de Verhoeff Técnica de la orceína El fundamento de esta técnica consiste en colorear las fibras elásticas presentes en el tejido conjuntivo con un colorante ácido de origen natural. La orceína es un colorante selectivo pero no específico. Reactivos utilizados en la técnica: a) Solución de orceína: Orceína... 1 gr. Alcohol al 70º ml. Ácido clorhídrico concentrado ml. b) Solución de picrocarmín de índigo: Solución acuosa saturada de ácido pícrico ml. Carmín de índigo... de 0.25 a 0.4 gr. Procedimiento: 1. Desparafinar el corte histológico. 2. Hidratar hasta el agua destilada. 3. Teñir con la solución de orceína de minutos. 4. Lavar con abundante agua destilada y con rapidez. 5. Teñir con picrocarmín durante 20 segundos. 6. Diferenciar el exceso de orceína con baños de alcohol absoluto, aclarar y montar Resultados: Fibras y membranas elásticas... pardo- negruzco Citoplasma y otras estructuras...verde- amarillento Puede utilizarse cualquier fijador, pero los más idóneos son los alcoholes y la formalina. 30

31 Metodología y Técnicas de Trabajo en el Laboratorio A.P. Errores frecuentes y su solución Técnica de la Hematoxilina de Verhoeff El fundamento de esta otra técnica consiste en la tinción de las fibras elásticas con la laca que proporciona la hematoxilina férrica que le vamos a añadir ya que hay una atracción electrofísica entre la laca y elastomucina. Esta tinción también es poco selectiva (tiñe estructuras tales como la mielina) Reactivos para la técnica: a) Solución acuosa de cloruro férrico al 10%: b) Solución yodo-yodurada de lugol: Yodo metálico... 2 gr. Yoduro potásico... 4 gr. Lugol ml. c) Solución de Verhoeff : Se disuelven 1.5 gr. de hematoxilina en 30 ml. de alcohol de 100º, aplicando suavemente calor; se enfría y se filtra. A continuación se le añaden: - 12 ml. de solución de cloruro férrico al 10% ml. de la solución de lugol. Se le añadirán en este orden, agitando bien para su óptima mezcla y para su posterior aplicación. d) Solución de diferenciación acuosa de cloruro férrico al 2%. Procedimiento: 1. Desparafinar. 2. Hidratar hasta llegar al agua destilada. 3. Teñir con la solución de Verhoeff durante minutos, hasta que los cortes aparezcan de color negro. 4. Diferenciar con la solución de cloruro férrico durante varios minutos e ir verificando mediante agua destilada(lavados) y el microscopio que solo se han coloreado las fibras elásticas y los núcleos estando el resto del tejido de color gris. Este paso es el más importante ya que si nos excedemos en la diferenciación, podemos provocar una tinción deficiente de las fibras elásticas. Si esto sucediera, tan solo tendríamos que volver a aplicar la solución de Verhoeff al tejido y diferenciar de nuevo. 5. Lavar con agua destilada. 6. Aclarar con alcohol 96º para eliminar la tinción debida al yodo. 7. Lavar con agua destilada durante 5 minutos. 8. Contrastar con la tinción de Van Gieson durante 1-2 minutos. 9. Aclarar con alcohol 96º. 10. Deshidratar, aclarar y montar. 31