Regulación de la expresión génica

Transcripción

1 Regulación de la expresión génica Regulación del operon lac M. en C. J. Abraham León Domínguez

2 Cuántos genes y proteínas tiene una célula? Genoma Humano Genoma bacteriano Tiene aprox. 4.6 millones de pares de bases Codifica aprox genes proteínas codificadas El control de la síntesis de un producto génico en particular es conocido como regulación génica. En muchos casos, la actividad génica es regulada a nivel de transcripción.

3 Los genes que codifican para productos génicos necesarios para el metabolismo básico celular se expresan a nivel más o menos constante, en prácticamente todas las células de un organismo, es decir, se expresan de forma constitutiva o continua. Genes constitutivos o housekeeping Frente a los genes constitutivos se encuentran los genes que se expresan solamente en determinadas situaciones y que, por consiguiente, codifican para productos génicos que se requieren en determinado estado celular o, en respuesta a cierta condición externa. Genes regulados o adaptativos

4 Puntos de control de la expresión génica Re-arreglo del DNA Regulación transcripcional Procesamiento del mrna Estabilidad del mrna Control post-transcripcional Control traduccional

5 Nivel transcripcional Los mecanismo de regulación caen dentro de dos categorías: Regulación positiva Regulación negativa Activación de la transcripción Represión de la transcripción

6 Regulación positiva: en la regulación positiva la actividad transcripcional se encuentra apagada. El inicio de la transcripción es estimulado por la unión de una proteína que activa la expresión de los genes, actúa como un activador. Regulación negativa: en la regulación negativa la actividad transcripcional se encuentra encendida. El apagado o impedimento de la expresión de los genes ocurre por la unión de una proteína que impide el inicio de la transcripción, actúa como un represor.

7 Un sistema de regulación negativa puede ser inducible o reprimible. Transcripción inducible Transcripción reprimible En presencia de una molécula pequeña llamada inductor, el represor pierde su capacidad de unión al DNA, y la transcripción ocurre. El represor no tiene actividad de unión al DNA por si solo, hasta que se une a una molécula pequeña llamada corepresor. En este caso el represor se conoce como aporepresor.

8 Regulación génica del operon El conjunto formado por el grupo de genes, el promotor, y las secuencias adicionales implicadas en la regulación, se denomina operon. Promotor: región del DNA de unión para la RNA polimerasa. Operador: región del DNA que es reconocida por la proteína represora. Precede a los genes estructurales y sobrelapa con la región promotora.

9 Genes estructurales : genes involucrados en el metabolismo, transcritos como una unidad (mensajero policistrónico). Gen regulatorio: codifica una proteína que regula la transcripción de los genes estructurales. Se une al operador.

10 El modelo del operon Lac Muchos de los principios que regulan la expresión génica fueron estudiados a detalle en E. coli, en respuesta al metabolismo del azúcar lactosa. El desarrollo del concepto operon fue introducido y estudiado por François Jacob y Jacques Monod. En 1960 publicaron un artículo en el que demostraron que dos genes implicados en el metabolismo de la lactosa estaban regulados coordinadamente mediante un elemento génico adyacente a ellos.

11 Metabolismo de la lactosa El operon lac tiene 3 genes involucrados en el metabolismo de la lactosa: lacz, lacy y laca y, un gen que codifica para la proteína represora que regula la expresión de estos genes: laci.

12 LacZ: codifica para la enzima β-galactosidasa, la cual rompe a la lactosa en galactosa y glucosa. LacY: codifica para una lactosa permeasa, una molécula transportadora requerida para la entrada de lactosa en la célula. LacA: codifica para la enzima transacetilasa, que transfiere un grupo acetilo de Acetil-CoA a los azúcares galactósidos. Como tal, no participa propiamente en el metabolismo de la lactosa. LacI: codifica para una proteína tetramérica que se une al operador, impidiendo la expresión de los genes estructurales. Proteína represora.

13 Expresión inducible del operon A) En ausencia de lactosa En ausencia de lactosa, el producto génico de laci (proteína represora) se une al operador y bloquea la unión de la RNA polimerasa, impidiendo la expresión de los genes estructurales del operon.

14 Expresión inducible del operon B) En presencia de lactosa Una molécula inductora se une a un sitio específico del represor, provocándole un cambio conformacional que le lleva a perder afinidad por el operador, permitiendo a la RNA polimerasa su unión al promotor y la transcripción del operon.

15 El inductor de este sistema no es la lactosa propiamente dicha sino un isómero de la misma llamado alolactosa. La misma β-galactosidasa cambia a la lactosa en alolactosa. La alolactosa es un ejemplo de un inductor fisiológico natural. También existen inductores no metabolizables o inductores gratuitos, como el IPTG, que permite inducir la expresión del operon lac. Se ocupan en técnicas de clonación.

16 Análogos de la lactosa La mayoría de estos compuestos son galactósidos derivados de la lactosa, donde la glucosa ha sido sustituida por algún radical o grupo químico. IPTG (isopropil-β-d-tio-galactósido) Fenil-Gal (fenil-β-d-galactosa) ONPG (orto-nitrofenil-β-d-galactopiranósido) X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido) Alolactosa

17 IPTG Un inductor efectivo del operon lac y no metabolizable, que se usa a menudo experimentalmente, es el IPTG. Es capaz de unirse al represor LacI, pero no es sustrato para la β-galactosidasa y no puede ser metabolizado por la bacteria. Permite regular la expresión génica (inducción).

18 Fenil-Gal Es un sustrato de la β-galactosidasa, pero no es un inductor del operon, ya que es incapaz de unirse al represor LacI. Esto hace que las cepas bacterianas silvestres sean incapaces de crecer cuando su única fuente de carbono es fenil-gal. Solo aquellos mutantes donde se encuentre ausente el represor LacI podrán crecer en esta fuente de carbono.

19 X-gal Es otro sustrato de la β-galactosidasa que, al ser hidrolizado, produce un compuesto (indoxil) que en contacto con el aire se transforma en dicloro-índigo insoluble, el cual presenta un inteso color azul.

20 En experimentos de clonación génica, es usado como indicador de aquellas células que expresan la enzima β-galactosidasa. Aquellas colonias que estén expresando la enzima se tornarán de color azul más o menos intenso en función de la cantidad de enzima que estén expresando.

21 Alolactosa Es un isómero de la lactosa y es el verdadero inductor del operon. Mientras que la lactosa tiene enlaces β-1,4, la alolactosa posee enlaces β-1,6.

22 ONPG Es otro sustrato de la β-galactosidasa que, al ser hidrolizado, produce un compuesto (ortonitrofenol) que presente un intenso color amarillo. El ONPG es muy utilizado en los ensayos in vitro de β-galactosidasa, en los que se puede saber la concentración de β-galactosidasa en función de la intensidad de color amarillo, medida por absorbancia a 420 nm.

23 Recordando En presencia de lactosa Regulación del metabolismo

24 La glucosa es la principal fuente de energía y carbono en el metabolismo celular. Cuando la glucosa y lactosa están presentes en el medio, la transcripción del operon lac no esta activa, hasta que toda la glucosa del medio ha sido consumida. Esta observación lleva a plantear un segundo nivel de regulación del operon lac: modelo de represión catabólica.

25 El efecto represor de la glucosa en la expresión del operon lac es indirecto, mediado por una molécula pequeña de AMPc y, una proteína llamada proteína receptora de AMPc (CRP) o, también conocida como proteína activadora de catabolito (CAP) AMPc: es un derivado del ATP, sintetizado por la enzima adenilato ciclasa. CRP o CAP: proteína codificada por el gen crp. Se une al AMPc formando un complejo que sirve como activador transcripcional. CAP-AMPc: activador transcripcional. Se une a una región del DNA presente río arriba del promotor del operon lac.

26 Regulación positiva del operon lac Aún en ausencia del represor, el promotor del operon lac no es muy fuerte, por lo que requiere la actividad de otras proteínas. Bajo AMPc Alto AMPc

27 En ausencia de CAP-AMPc, la RNA polimerasa se une débilmente al promotor. Esto lleva a bajos niveles de transcripción, debido a que no ocurre una interacción correcta entre la RNA polimerasa y el promotor. La presencia de CAP-AMPc y, su unión al promotor del operon lac, causa un giro del DNA que facilita la unión de la RNA polimerasa al promotor, llevando a niveles altos de transcripción.

28 La glucosa regula los niveles de AMPc Sin AMPc la proteína CAP no puede unirse al DNA y es inactiva. A diferencia del represor, el cual regula negativamente el operon lac, la presencia del complejo CAP-AMPc regula positivamente la expresión del operon.

29 Elección del mejor azúcar a metabolizar Cómo actúa el operon en presencia o ausencia de glucosa y lactosa? a) Glucosa presente, lactosa ausente NO HAY TRANSCRIPCIÓN

30 Elección del mejor azúcar a metabolizar b) Glucosa presente, lactosa presente BAJOS NIVELES DE TRANSCRIPCIÓN

31 Elección del mejor azúcar a metabolizar c) Glucosa ausente, lactosa ausente NO HAY TRANSCRIPCIÓN

32 Elección del mejor azúcar a metabolizar d) Glucosa ausente, lactosa presente ALTOS NIVELES DE TRANSCRIPCIÓN

33 Resumen de respuestas de operon lac

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35 Inducción de proteína recombinante Antecedentes y experimento M. en C. J. Abraham León Domínguez

36 OBJETIVOS: Conocer el fundamento de la inducción de síntesis de proteínas recombinantes en E. coli. Realizar la inducción de una proteína recombinante (βlactamasa). Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante. Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína recombinante. Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas recombinantes.

37 Tecnología del ADN recombinante ADN recombinante: molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN. Tecnología del ADN recombinante: conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro organismo. Clonación molecular

38 Etapas de la clonación

39 Herramientas de la tecnología del ADN recombinante

40 Expresión del gen clonado Los vectores de expresión deben diseñarse para asegurar que el mrna producido sea traducido de manera eficiente.

41 A menudo hay que realizar ajustes para asegurar una traducción de alta eficiencia una vez que el gen se ha clonado. Por ejemplo: Si el gen clonado contiene intrones (gen eucariótico) no se sintetizará el producto proteico si el hospedador es procariota. Los sitios de unión a ribosomas bacterianos no son los mismos para genes eucariotas. El uso codónico puede ser también un obstáculo.

42 Una vez producida la proteína también hay que tomar en cuenta diversas consideraciones Compartimento en el que la proteína se expresará necesita una secuencia señal? Si la proteína tiene puentes disulfuro, el huésped debe ser capaz de formar los puentes disulfuro. Modificaciones post-traduccionales. El huésped debe ser capaz de hacer estas modificaciones. La posible toxicidad de la proteína, utilizar un huésped resistente.

43 Vector de expresión pet-24a(+)

44 El vector pet tiene la secuencia del promotor T7 y del LacO cerca de la secuencia del transgen Promotor T7 Promotor del bacteriófago T7. Se encuentra bajo el control del operador de la lactosa. Esto indica que la expresión de la proteína recombinante puede ser inducible.

45 Y, de donde proviene la T7 RNA polimerasa? Se utiliza una bacteria lisogénica BL21, en cuyo cromosoma se ha insertado el gen que codifica la T7 RNA polimerasa precedido del promotor del operon lac. La expresión de esta polimerasa esta controlada en un sistema que se puede inducir. La activación de la transcripción de la T7 RNA polimerasa es inducida por un inductor del operon lac, como el IPTG.

46 Sistema de expresión de T7 y, de la proteína clonada

47 Esta polimerasa es tan activa que utiliza la mayoría de los precursores del RNA, de forma que los genes del hospedador quedan, en su mayoría sin transcribir y, por tanto, la célula deja de crecer. El sistema de control T7 es muy eficaz para generar cantidades extremadamente grandes de una proteína de interés concreta.

48 En la práctica experimental SDS-PAGE de la producción de proteína recombinante.