EFECTO DEL PRETRATAMIENTO CON MICROONDAS EN LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS RESIDUOS INDUSTRIALES DE LA PIÑA PARA LA OBTENCIÓN DE BIOETANOL

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1 ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Y DEL MEDIO NATURAL MÁSTER EN CIENCIA E INGENIERÍA DE LOS ALIMENTOS EFECTO DEL PRETRATAMIENTO CON MICROONDAS EN LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS RESIDUOS INDUSTRIALES DE LA PIÑA PARA LA OBTENCIÓN DE BIOETANOL TRABAJO FINAL DE MÁSTER ALUMNO: Igncio Bernt Senent DIRECTORAS: Lucí Seguí Gil Cludi Cones Domínguez

2 Vlenci, Septiembre 213

3 EFECTO DEL PRETRATAMIENTO CON MICROONDAS EN LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS RESIDUOS INDUSTRIALES DE LA PIÑA PARA LA OBTENCIÓN DE BIOETANOL Igncio Bernt Senent 1, Cludi Cones Domínguez 1, Lucí Seguí Gil 1 RESUMEN Los residuos procedentes de l industrilizción de l piñ pueden llegr lcnzr hst un 5% (m/m) del totl de frut procesd. Al trtrse de un mteril con un proporción significtiv de zúcres fermentbles, celulos y hemicelulos, podrí constituir un mteri prim de bjo coste pr l producción de bioetnol. No obstnte, l estructur lignocelulósic es difícilmente degrdble por lo que result necesrio plicr lgún pretrtmiento como pso previo l hidrólisis enzimátic. En concreto, el objetivo del presente trbjo consiste en evlur l eficci del pretrtmiento con microonds previo l hidrólisis enzimátic de los residuos industriles de l piñ pr l obtención de bioetnol. Pr ello, se plicron diferentes potencis (1.625, 8.5, 6.35, 4.25 y W/g) y tiempos (1-6 min, 8, 1, 14 y 2 min) y, posteriormente, se procedió l scrificción de ls muestrs (ph 5, 5 ºC,.4% (m/m) de celuls,.1% (m/m) de hemiceluls de Aspergillus niger, durnte 24 h). Se determinron los sólidos solubles totles, el ph y el perfil de zúcres del hidrolizdo finl. Los resultdos obtenidos sugieren que pretrtr con microonds el residuo sólido de l piñ permite mejorr l eficci de l hidrólisis enzimátic posterior. Los pretrtmientos 6.35 W/g, 4.25 W/g entre min y 8.5 W/g entre 1-3 min generron un incremento estdísticmente significtivo de los zúcres con respecto l muestr hidrolizd no sometid prettmiento. En concreto, en l muestr pretrtd 6.35 W/g durnte 4 min se produjo un incremento del 4% pr los zúcres fermentbles y del 46% pr los totles con respecto l residuo sólido hidrolizdo no pretrtdo y del 123% con respecto l residuo sólido inicil. PALABRAS CLAVE: Pretrtmiento con microonds, hidrólisis enzimátic, bioetnol, residuos industriles de l piñ. RESUM Els residus procedents de l industrilitzció de l piny poden rribr constituir fins un 5% (m/m) del totl de fruit processd. En trctr-se d'un mteril mb un proporció significtiv de sucres fermentbles, cel lulos i hemicel lulos, podri constituir un mtèri primer de bix cost per l producció de bioetnol. Mlgrt ixò, l'estructur lignocel lulósic és difícilment degrdble pel que result necessri plicr lgun pretrctment com ps previ l hidròlisi enzimàtic. En concret, l'objectiu del present trebll consisteix vlur l'eficàci del pretrctment mb microones previ 1 Instituto de Ingenierí de Alimentos pr el Desrrollo (IIAD) Universitt Politècnic de Vlènci (UPV) Cmino de Ver s/n, Vlenci

4 l hidròlisi enzimàtic dels residus industrils de l piny per l'obtenció de bioetnol. Per ixò, es vn plicr diferents potències (1.625, 8.5, 6.35, 4.25 i W/g) i temps (1-6 min, 8, 1, 14 i 2 min) i, posteriorment, es v procedir l scrificció de les mostres (ph 5, 5 ºC,.4% (m/m) de cel luls,.1% (m/m) de hemicel luls de Aspergillus niger, durnt 24 h). Es vn determinr els sòlids solubles totls, el ph i el perfil de sucres de l'hidrolitzt finl. Els resultts obtinguts suggereixen que pretrctr mb microones el residu sòlid de l piny permet millorr l'eficàci de l hidròlisi enzimàtic posterior. Els pretrctments 6.35 W/g, 4.25 W/g entre min i 8.5 W/g entre 1-3 min vn generr un increment estdísticment significtiu dels sucres pel que f l mostr hidrolitzd no sotmes pretctment. En concret, en l mostr pretrctd 6.35 W/g durnt 4 min es v produir un increment del 4% per ls sucres fermentbles i del 46% per ls totls pel que f l residu sòlid hidrolitzt no pretrctt i del 123% pel que f l residu sòlid inicil. PARAULES CLAU: Pretrctment mb microones, hidròlisi enzimàtic, bioetnol, residus industrils de l piny. ABSTRACT Industril pinepple wste cn rech up to 5% (w/w) of the totl processed fruit. This wste is chrcterized by contining significnt mount of fermentble sugrs, cellulose nd hemicelluloses; thus, it could be used s low cost lterntive for bioethnol production. However, the lignocellulosic structure is hrdly degrdble nd, therefore, pretretment step prior to the enzymtic hydrolysis is needed. The im of the present work is to evlute the effectiveness of microwve pretretment before enzymtic hydrolysis of industril pinepple wste for bioethnol production. With this purpose, the solid wste ws treted using different microwve powers (1.625, 8.5, 6.35, 4.25 nd W/g) nd times (1-6 min, 8, 1, 14 nd 2 min) nd then scchrified (ph 5, 5 ºC,.4% (w/w) of cellulse,.1% (w/w) of hemicellulse from Aspergillus niger during 24 h). Totl soluble solids, ph nd sugr profile were determined on the finl hydrolyzte. Results suggest tht, in generl, microwve pretretment enhnce the enzymtic hydrolysis of pinepple wste. Pretretments t 6.35 W/g, t 4.25 W/g during min nd t 8.5 W/g in the rnge 1-3 min generted sttisticlly significnt increse in the sugrs yield with respect to the nonpretreted hydrolyzed smple. Specificlly, the smples pretreted t 6.35 W/g during 4 min underwent n increse of 4% in fermentble sugrs, nd of 46% in totl sugrs, s compred with the non-pretreted hydrolyzed wste, nd of 123% with respect to the initil wste. KEYWORDS: Microwve pretretment, enzymtic hydrolysis, bioethnol, industril pinepple wste. 2

5 INTRODUCCIÓN L producción mundil de piñs se h incrementdo progresivmente hst lcnzr los 21 millones de tonelds en el ño 211, lo que l convierte en l tercer frut tropicl más importnte por detrás de l bnn y del mngo (FAO, 213). Sus dos principles industris de trnsformción son l industri de zumos y l conserver, que en muchos csos se combinn pr l obtención simultáne de zumos y de concentrdos, y de piñ enltd. Durnte su procesdo, lrededor de un 5% (m/m) de l frut cb convirtiéndose en residuos, constituidos principlmente por l cortez, l coron y el corzón, muy difíciles de degrdr y de gestionr (Ketnw et l., 212). No obstnte, nuevs investigciones se centrn en l obtención de bioetnol de segund generción prtir de estos residuos l trtrse de un mteril lignocelulósico que contiene lts proporciones de mono y discáridos fermentbles como l glucos, l fructos y l scros, y de celulos y de hemicelulos potencilmente hidrolizbles (Nigm, 1999; Tnk et l., 1999; Rungviriychi et l., 21). Ls moléculs de celulos se orgnizn en lrgs cdens lineles llmds microfibrills recubierts por hemicelulos y lignin que l protegen de l hidrólisis enzimátic (Therzdeh y Krimi, 28), por lo que pretrtr l mtriz lignocelulósic se convierte en un pso primordil pr l obtención de bioetnol. En l ctulidd existen diferentes tipos de pretrtmientos físicos (moliend, pirólisis), fisicoquímicos (utohidrólisis, AFEX, explosión de CO 2 ), químicos (ozonólisis, hidrólisis ácid o lclin, empleo de orgnosolventes) y biológicos, sí como un combinción de todos ellos (Sun y Chen, 22). Muchos de estos pretrtmientos requieren lts temperturs, que se lcnzn medinte clentmiento por convección o por conducción (Liu y Wymn, 25; Mosier et l., 25), pero que genern un elevdo coste energético y pueden producir compuestos inhibidores de l fermentción lcohólic. El empleo de microonds, rdiciones electromgnétics no ionizntes que se hlln dentro de un gm de frecuencis de 3 MHz (longitud de ond 1 m) 3 GHz (longitud de ond de 1 mm), es un método lterntivo los pretrtmientos convencionles (Hu y Wen, 28). En concreto, permite un clentmiento volumétrico, selectivo y rápido del producto, l existir un contcto directo entre este y el cmpo electromgnético generdo por el microonds (Dtt, 21; De l Hoz et l., 25). Esto se trduce en un myor efectividd energétic y fcilidd de mnejo con respecto los pretrtmientos convencionles de l mtriz lignocelulósic. Además, los últimos estudios demuestrn que ls microonds cmbin l ultrestructur de l celulos (Xiong et l., 2; De l Hoz et l., 25) y degrdn l lignin y l hemicelulos, incrementndo sí l efectividd de l hidrólisis enzimátic sobre l mtriz lignocelulósic (Azum et l., 1984; Ooshim et l., 1984; Kitchiy et l.; 23; Zhu et l., 25; Zhu et l., 26). No obstnte, l efectividd de un pretrtmiento depende tnto de ls condiciones del proceso, como de l mtriz lignocelulósic objeto de estudio. Por lo tnto, el objetivo del presente trbjo es evlur l eficci del 3

6 pretrtmiento con microonds previo l hidrólisis enzimátic de los residuos industriles de l piñ pr l obtención de bioetnol. MATERIALES Y MÉTODOS Mteri prim Ls piñs (Anns comosus) utilizds en el presente trbjo pertenecen l vriedd de cultivo MD-2, más conocid como Extr Sweet o Golden Sweet. Con el fin trbjr con un muestr homogéne, los frutos se seleccionron de cuerdo su tmño, peso, color, specto y estdo de mdurez. Obtención del residuo sólido Pr l obtención de l muestr, se lvron ls piñs en un disolución de gu e hipoclorito de sodio l.1%, durnte 5 minutos. Posteriormente se eliminó l coron del fruto con un cuchillo y se seprron l cortez y el corzón de l pulp con un cortdor de piñ (GEFU). A continución se troceron l cortez y el corzón y se prensron en un prens hidráulic 2.5 br (Vincent Corportion modelo CP-4). L tort de prensdo se trituró con un btidor mericn (Solc Professionl Mixter 1W Inox.). Por último, el residuo triturdo se introdujo en frscos de vidrio que se llevron congelción -22 ºC hst l relizción de los experimentos. A este residuo se le denominrá, lo lrgo del trbjo, residuo sólido inicil. Pretrtmiento con microonds El pretrtmiento se llevó cbo usndo un horno microonds doméstico (LG MH634F/MH634FS) con un frecuenci de 2.45 GHz. Se introdujeron 4 g de residuo triturdo y 4 ml de gu destild en recipientes de plástico especiles pr microonds. L mezcl se trtó 85, 68, 51, 34 y 1 W, lo que se trduce en ls siguientes potencis W/g: 2.125, 4.25, 6.35, 8.5 y 1.625, y intervlos de tiempo de 1 minuto hst 6, 8, 1, 12 y 2 minutos, respectivmente. Finlmente se justó el ph del residuo 5 medinte l dición de NOH 1 N (Pnrec Químic, S.L.U.). Todos los trtmientos se relizron por triplicdo. Hidrólisis enzimátic Se combinron.4% (m/m) de celuls (1.13 Uniddes/mg de sólido, Sigm-Aldrich Spin) y.1% (m/m) de hemiceluls (1.5 Uniddes/mg de sólido, Sigm-Aldrich Spin) producids mbs por Aspergillus niger con el residuo pretrtdo con microonds y sin pretrtr en vsos de precipitdos de 1 ml. L mezcl se llevó estuf de incubción (PSelect modelo Incudigit) 5 ºC durnte 24 h. 4

7 Efecto de l congelción L congelción del residuo sólido inicil se llevó cbo con l finlidd de conservr l muestr hst nálisis. No obstnte, puesto que l congelción en sí mism podrí contribuir l desestructurción del mteril, y con el fin de tener en cuent este posible efecto l utilizr este método con nterioridd l pretrtmiento con microonds, se procedió como sigue. Se procesó piñ y se sepró el residuo triturdo en dos prtes, un de ls cules se llevó congelción -22 ºC. En mbos csos, se pretrtó 51 W durnte 4 min y se llevó cbo l hidrólisis enzimátic. Crcterizción del residuo en ls diferentes etps del trtmiento Se determinron por triplicdo l humedd, el ph, los Sólidos Solubles Totles (SST) y el perfil de zúcres del residuo sólido inicil, del residuo hidrolizdo pretrtdo y sin pretrtr con microonds, y del residuo hidrolizdo y pretrtdo 51 W y 4 min congeldo y sin congelr. DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD Se vloró el contenido en gu (x w ) medinte el método grvimétrico de doble pesd (AOAC, 2) modificdo. Según este método, l humedd de l muestr puede obtenerse prtir de l ecución 1. Ls muestrs se secron en estuf 63 ºC (J.P.Select) hst peso constnte. Ls pesds se relizron con blnz nlític (Mettler Toledo modelo MS34S). xw(%) M mh M mh M M ms (1) Donde: M se corresponde con l ms del crisol vcío; M +mh con l ms del crisol con un pequeñ cntidd de l muestr húmed; M +ms con l ms del crisol junto con l muestr secd en estuf. DETERMINACIÓN DEL PH El ph se determinó con un ph-metro digitl con electrodo de contcto (Mettler Toledo Inlb) previmente clibrdo con tmpones (ph 4.1,. y 9.21). DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES (SST) Los SST se evluron por refrctometrí trvés de l medid de los grdos Brix (ºBrix) de l fse líquid. Pr ello, se utilizó un refrctómetro de mes (ABBE ATAGO 3T) termosttdo 2 ºC según el método ISO 143:1982. L fse líquid se obtuvo por prensdo con un prens mnul. 5

8 DETERMINACIÓN DEL PERFIL DE AZÚCARES L determinción de los zúcres presentes en l fse líquid del residuo se relizó medinte Cromtogrfí Líquid de Intercmbio Iónico (cromtógrfo modelo 16 Compct IC Metrohm), con column Metrosep Crb 1 25/4.6 (25 mmlx 4.6 mmid), utilizndo.1 M NOH (1 ml/min) como fse móvil. Pr relizr ls determinciones, se preprron diluciones 1:2 con gu milliq de l fse líquid del residuo que se filtrron con un filtro de nilon de.45 µm. Los ptrones utilizdos pr l cuntificción del contenido en zúcres del residuo fueron rbinos (purez 98%), glucos (purez 99.5%), xilos (purez 99%), fructos (purez 99%) y scros (purez 99.5%), preprdos en diluciones de 2.5, 5, 1, 15, 25 y 5 ppm. L lectur de los cromtogrms se relizó medinte el progrm IC Net 2.3 (Metrohm). Análisis Estdístico Se relizron nálisis de l vrinz (ANOVA) pr estudir los resultdos obtenidos en los experimentos. Pr ello se utilizó el progrm estdístico Sttgrphics Centurion XVI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Crcterizción del licor de prensdo Los resultdos de l crcterizción fisicoquímic del licor de prensdo del residuo industril de l piñ se presentn en l tbl 1. Según puede precirse, l fse líquid se crcteriz por un ph ácido y los zúcres presentes en l mism son glucos, fructos y scros, lo que lo convierte en un fuente potencil de obtención de bioetnol. En concreto, l glucos es el zúcr que se encontrb en un myor proporción seguido por l fructos y, en menor medid, por l scros. Los vlores obtenidos de zúcres totles fueron inferiores los obtenidos por Abdullh y Hnfi (28): 3,6 g/l y Sski et l. (1991): 1 g/l. Est diferenci se puede deber l proceso de obtención del residuo de l piñ y/o l estdo de mdurez de los frutos. TABLA 1. Crcterizción fisicoquímic del licor de prensdo 1. Licor de prensdo SST Glucos Fructos Scros Azúcres Totles ph ( Brix) 1.8 (.8) 3.31 (.4) 1 (5) 12. (2.6) 3.1 (1.1) 33 () 1 Los vlores se corresponden l medi de tres repeticiones (Desvición Estándr). 6

9 Crcterizción del residuo sólido de industrilizción de l piñ En l tbl 2 se muestrn el ph, l humedd, los sólidos solubles totles y el contenido en zúcres del residuo sólido trs hber sido reconstituido con gu. Se ñdió gu en l proporción de 1:1 (m/m) l tort de prensdo puesto que lgunos utores como Azum et l. (1984) y Ooshim et l. (1984) sugieren que en presenci de gu, el pretrtmiento con microonds mejorrí l hidrólisis enzimátic de los mteriles lignocelulósicos. El nálisis de los cromtogrms (figur 1) de l fse líquid permitió identificr y cuntificr los zúcres presentes en el residuo sólido resturdo. Como consecuenci de l resturción del residuo sólido con gu en un proporción de 1:1 (m/m), el ph es ligermente superior con respecto l licor de prensdo y en generl, l concentrción de los distintos zúcres se reduce proximdmente l mitd. TABLA 2. Crcterizción fisicoquímic y contenido en zúcres del residuo sólido reconstituido con gu 1. SST ( Brix) x w (%) Residuo Sólido reconstituido con gu ph Glucos Fructos Scros Azúcres Totles 3.8 (.2) 92.2 (.5) 3.8 (.5) 1 (5) (2) 1.5 (.6) 19 () 1 Los vlores se corresponden l medi de tres repeticiones (Desvición Estándr). FIGURA 1. Cromtogrm obtenido por cromtogrfí líquid de intercmbio iónico correspondiente l residuo sólido reconstituido con gu (dilución 1:2 v/v). G: Glucos; F: Fructos; S: Scros. Hidrólisis enzimátic del residuo sólido de piñ sin pretrtr y pretrtdo con microonds CARACTERIZACIÓN DEL RESIDUO HIDROLIZADO ENZIMÁTICAMENTE SIN PRETRATAMIENTO En l tbl 3 se muestrn los resultdos de l crcterizción fisicoquímic del residuo sólido hidrolizdo (24 h) sin pretrtmiento con microonds.

10 A prtir de los cromtogrms, se deduce que trs l hidrólisis enzimátic existe un incremento con respecto l residuo resturdo de glucos (6%), fructos (39%) y scros (6,%), como consecuenci de l cción de l celuls fúngic que const de tres grupos de enzims: ls endoglucnss (EC ), ls celobiohidrolss o exoglucnss (EC ) y ls β- glucosidss (EC ) (Goyl et l., 1991). El mecnismo enzimático de l hidrólisis de l celulos, polímero de D-glucos unid por enlces β-1,4-oglucosídicos, const de ls etps descrits continución: En primer lugr ls endoglucnss hidrolizn l zr enlces glicosídicos en ls regiones morfs de l celulos generndo oligoscáridos. Posteriormente ls celobiohidrolss ctún sobre los extremos no reductor y reductor de ls cdens de celulos liberndo glucos y celobios. Finlmente ls β- glucosidss hidrolizn l celobios no fermentble glucos (Ting et l., 29). Algunos utores como Bn-Koffi y Hn (199) y Abdullh y Mt (28) sugieren que ph ácido, l scros se hidroliz D-glucos y D- fructos, lo que justificrí el menor incremento de l scros con respecto los dos monoscáridos. Además de los zúcres inicilmente presentes, los cromtogrms permitieron identificr dos nuevos zúcres: rbinos y xilos (figur 2). Como se h indicdo en l introducción, l celulos está recubiert por hemicelulos. Este polímero complejo de heteropoliscáridos está formdo por pentoss (D-xilos y L-rbinos) y hexoss (D-glucos, D-mnos y D- glctos) y ácidos urónicos (Scheller, 21). En el cso del residuo de l piñ, l cden principl recibe el nombre de xilno l trtrse de un polímero de xiloss con enlces β-(1 4) sustituidos por cdens de L- rbinos y D-ácido glucurónico, fácilmente hidrolizbles. L prición de estos dos zúcres se debe l hidrólisis de l hemicelulos por l cción de l hemiceluls. Este complejo enzimático const de enzims que hidrolizn l cden principl: ls xilnss y ls β-xilosidss (Shllom y Shohm, 23); sí como de ls responsbles de l hidrólisis de ls rmificciones de l hemicelulos: ls α-l-rbinofurnosidss y ls α-dglucuronosidss (Sh, 25). Según puede observrse en l tbl 3, existe un myor liberción de xilos que de rbinos l trtrse l primer del principl constituyente de l cden linel de xilno. Con todo ello, l hidrólisis enzimátic permite incrementr en 1 g/l (53%) el contenido en zúcres totles del residuo sólido. El término zúcres fermentbles hce referenci, lo lrgo de este trbjo, l conjunto formdo por l glucos, l fructos y l scros. Esto se debe que estos son los zúcres nturlmente fermentbles por l levdur Scchromyces cerevise, microorgnismo mejor estudido y más utilizdo nivel industril pr l fermentción. No obstnte existen en l ctulidd diferentes bcteris (Lee et l., 2; Crdon y Sánchez, 2) y levdurs (Hung et l., 29), sí como ceps modificds de S. cerevise cpces de fermentr tnto l glucos, l fructos y l scros, como l xilos y l rbinos etnol (Hhn-Hgerdl et l., 2; Musstto et l., 21). Es por ello que el término zúcres totles hce referenci en este trbjo l conjunto formdo por los zúcres fermentbles, junto con l rbinos y l xilos. 8

11 Como consecuenci del umento en zúcres totles, se constt un incrementos en los SST (ºBrix) del 68%. Por último, se preci un ligero descenso en el contenido de humedd del residuo hidrolizdo debido que l hidrólisis de un enlce glucosídico se llev cbo medinte l disocición de un molécul de gu del medio. TABLA 3. Crcterizción fisicoquímic y contenido en zúcres del residuo sólido hidrolizdo y sin pretrtmiento con microonds. 24 h de hidrólisis con.4% (m/m) celuls y.1% (m/m) hemiceluls 1. SST (ºBrix) x w (%) Residuo sólido hidrolizdo y sin pretrtmiento con microonds ph A G X F S AF AT 6.4 (.2) 91.4 (.) 4.28 (.).59 (.12) 16 (5).61 (.14) 1.1 (1.3) 1.6 (.3) 28 () 29 () 1 Los vlores se corresponden l medi de tres repeticiones (Desvición Estándr). A: Arbinos; G: Glucos; X: Xilos; F: Fructos; S: Scros; AF: Azúcres Fermentbles; AT: Azúcres Totles. FIGURA 2. Cromtogrm obtenido por cromtogrfí líquid de intercmbio iónico del residuo hidrolizdo sin pretrtmiento (dilución 1:2 v/v). A: Arbinos; G: Glucos; X: Xilos; F: Fructos; S: Scros. CARACTERIZACIÓN DEL RESIDUO PRETRATADO CON MICROONDAS E HIDROLIZADO ENZIMÁTICAMENTE En l figur 3 se muestr el contenido en zúcres totles y fermentbles del residuo sólido (RS), del residuo sólido hidrolizdo enzimáticmente sin pretrtmiento (SP) y del residuo sólido pretrtdo con microonds y scrificdo pr cd uno de los trtmientos estudidos. Pr evlur el efecto del pretrtmiento con microonds, se relizron sendos ANOVA de tipo monofctoril pr cd un de ls potencis estudids (nivel de confinz del 95%) escogiendo como vribles respuest el contenido en zúcres totles y fermentbles pr cd tiempo de exposición l pretrtmiento. El resultdo del contrste de rngo múltiple de este nálisis se muestr tmbién en l figur 3. 9

12 En generl, se observó un comportmiento similr de los zúcres totles y de los zúcres fermentbles pr todos los trtmientos. Esto se debe que l myor proporción de los zúcres totles está compuest por los zúcres fermentbles, como se h visto previmente. Pretrtr con microonds el residuo industril de piñ W/g no gener un incremento estdísticmente significtivo del contenido en zúcres totles y fermentbles con respecto l residuo hidrolizdo sin pretrtmiento. En este cso (figur 3A), los vlores de zúcres obtenidos trs el pretrtmiento pr los diferentes tiempos de exposición osciln lrededor del contenido en zúcres del residuo hidrolizdo sin pretrtmiento. El pretrtmiento un potenci ligermente superior (4.25 W/g, figur 3B) generó un incremento del contenido en zúcres totles y fermentbles tiempos de exposición ltos ( prtir de 8 min) unque no se observron diferencis estdísticmente significtivs con respecto l residuo hidrolizdo sin pretrtmiento. Por su prte, pretrtr con microonds el residuo industril de piñ 6.35 W/g y pr culquier tiempo de exposición produjo un incremento estdísticmente significtivo del contenido en zúcres fermentbles y totles con respecto l residuo hidrolizdo sin pretrtr como se preci en l figur 3.C. No obstnte, no se observron diferencis estdísticmente significtivs entre los diferentes tiempos de exposición ls microonds, lcnzándose el myor rendimiento en zúcres fermentbles (4.65 g/l) y totles (41.93 g/l) los 4 min de trtmiento. El pretrtmiento con microonds 8.5 W/g (figur 3D) tiempos cortos de exposición (hst 3 min pr los zúcres fermentbles y hst 4 min pr los zúcres totles) provocó un incremento del contenido en zúcres totles y fermentbles con respecto l residuo hidrolizdo sin pretrtmiento, unque este efecto no resultó estdísticmente significtivo. Por otro ldo, se observ ciert tendenci un disminución del rendimiento en zúcres en el residuo hidrolizdo medid que ument el tiempo de exposición. Por último, el pretrtmiento del residuo W/g y pr culquier tiempo de exposición generó un descenso del contenido en zúcres totles y fermentbles con respecto l residuo hidrolizdo sin pretrtmiento, como se observ en l figur 3.E. 1

13 Azúcres Fermentbles 56 Azúcres Totles 56 A) ghi cdefghi hi fghi bcdefgh bcdefghi bcdefghi bcdefghi bcdef bcdefg bcdefg b bc bcde efghi i defghi bcdefghi bcd SP ±,4 RS ± 6, efg fg defg defg bcdef cdefg bcdefg bcdefg bcdefg bcde bcdbcde bcde b b g cdefg bc bc SP ±,4 RS ± 6, tiempo (min) W/g tiempo (min) W/g Azúcres Fermentbles 56 Azúcres Totles 56 B) SP ±,4 RS ± 6, b b b b b b b b b b b b SP ±,4 RS ± 6, tiempo (min) 4.25 W/g tiempo (min) 4.25 W/g Azúcres Fermentbles 56 Azúcres Totles 56 C) SP ±, SP ±, RS ± 6, RS ± 6, tiempo (min) 6.35 W/g tiempo (min) 6.35 W/g Azúcres Fermentbles 56 Azúcres Totles 56 D) d d cd bc bc b b SP ±,4 RS ± 6, d cd cd bc b b SP ±,4 RS ± 6, tiempo (min) 8.5 W/g tiempo (min) 8.5 W/g Azúcres Fermentbles 56 Azúcres Totles 56 E) b b b b b SP ±,4 RS ± 6, SP ±,4 RS ± 6, tiempo (min) W/g tiempo (min) W/g FIGURA 3. Contenido en zúcres totles y fermentbles del Residuo Sólido (RS), del residuo no pretrtdo e hidrolizdo enzimáticmente (SP) y del residuo pretrtdo con microonds e hidrolizdo enzimáticmente: A) W/g; B) 4.25 W/g; C) 6.35 W/g; D) 8.5 W/g; E) W/g. 11

14 Algunos utores como De l Hoz et l. (25) sugieren que el efecto de l plicción de ls microonds sobre ls recciones químics se corresponde con l sum de los efectos térmicos y no térmicos. Los efectos térmicos surgen de ls diferencis existentes entre el clentmiento convencionl y el clentmiento dieléctrico por microonds. El clentmiento por microonds se bs en l cpcidd de lgunos compuestos (líquidos o sólidos) pr trnsformr l energí eléctric en clor, como consecuenci de dos mecnismos: l orientción e inducción dipolr y l conducción iónic (Lidström et l., 21). De est mner el empleo de microonds gener un clentmiento de elevd penetrción que permite cmbios estructurles msivos diferenci del clentmiento por conducción (Tlens et l., 213). Ests crcterístics hcen que el empleo de ls microonds pued mejorr el rendimiento de ciertos procesos bioquímicos l reestructurr el medio y fcilitr el cceso de ls enzims l sustrto. Los resultdos obtenidos sugieren que potencis bjs (2.125 W/g) no existe ningún efecto del pretrtmiento con microonds en el rendimiento en zúcres fermentbles y totles durnte l hidrólisis enzimátic. Esto se deberí que l potenci plicd no serí suficiente pr generr l desestructurción de l mtriz lignocelulósic y, por lo tnto, no cturí como fcilitdor de l posterior cción de ls enzims hidrolítics. En el extremo opuesto, pretrtr l mtriz lignocelulósic potencis elevds (1.625 W/g) tmpoco supondrí un beneficio puesto que disminuye el contenido en zúcres totles y fermentbles en el residuo hidrolizdo con respecto l que no h sido pretrtdo. De hecho, lgunos utores sugieren que potencis elevds, l tempertur lcnzd durnte el pretrtmiento puede provocr l degrdción de los zúcres, produciéndose sí un efecto contrrio l desedo (Zhu et l., 25). No obstnte, potencis intermedis sí se observ un efecto positivo del pretrtmiento con microonds sobre l desestructurción de l mtriz lignocelulósic. En concreto, potencis intermedis bjs (4.25 W/g) el myor rendimiento en zúcres fermentbles y totles se obtiene pr tiempos de exposición ltos. Pr potencis intermedis lts (8.5 W/g), ls myores concentrciones se lcnzn tiempos cortos de exposición mientrs que pr potencis intermedis de pretrtmiento (6.35 W/g), culquier tiempo de exposición l microonds fvorece l hidrólisis enzimátic. Considerndo todos los trtmientos, el nálisis estdístico mostró que el myor contenido en zúcres fermentbles y totles se obtiene pr culquier trtmiento 6.35 W/g, 4.25 W/g entre min y 8.5 W/g entre 1-3 min, obteniéndose diferencis estdísticmente significtivs con respecto los vlores correspondientes l residuo hidrolizdo sin pretrtmiento. Pr ello se relizron ANOVA monofctoriles (nivel de confinz del 95%) escogiendo como vribles respuest el contenido en zúcres totles y fermentbles y como fctores cd combinción de potenci y tiempo de exposición. De est mner, pretrtr el residuo sólido 6.35 W/g durnte 4 min gener un incremento del 4% pr los zúcres fermentbles y del 46% pr los totles comprándolo con el residuo sólido hidrolizdo sin pretrtr y del 123% con respecto l residuo sólido inicil. 12

15 Por otr prte, los resultdos correspondientes l crcterizción fisicoquímic (SST, humedd y ph) del residuo pretrtdo con microonds diferentes potencis e hidrolizdo, se resumen en l tbl 4. Según puede precirse, el contenido en humedd de ls muestrs pretrtds con microonds es, en generl, inferior l del residuo hidrolizdo que no h recibido pretrtmiento. Esto se deberí, como se h comentdo previmente, que l hidrólisis enzimátic gener un descenso de l humedd del residuo y l hidrólisis enzimátic se produce en myor proporción cundo se reliz el pretrtmiento con microonds. Además, el nálisis estdístico (ANOVA monofctoril, nivel de confinz del 95%) mostró que no existín diferencis estdísticmente significtivs entre los distintos pretrtmientos con respecto l humedd. El contenido en SST (ºBrix) pr cd trtmiento siguió en generl un tendenci similr l de los zúcres totles y fermentbles, incrementándose medid que umentn los zúcres en el residuo pretrtdo e hidrolizdo. Por último, el ph no vrí de mner significtiv en ninguno de los trtmientos estudidos. 13

16 14 TABLA 4. Crcterizción fisicoquímic del residuo sólido hidrolizdo pretrtdo con microonds. 1 Trtmiento (W/g) Determinciones [ ] Continución Tbl 4. Tiempo (min) SST ( Brix) 6.4 (.14) b 6. (.14) cdef 6.8 (.5) def 6.8 (.) ef 6.8 (.2) ef 6.8 (.12) ef 6.88 (.1) f 6.85 (.14) f 6.5 (.) ef 6.5 (.14) ef x w (%) 91.6 (.) c 91.4 (.) bc 9.9(.6) b 91.4 (.6) bc 9.9 (.3) b 91.5 (.9) bc 91.4 (.8) bc 91.3 (.14) bc 91.2 (.2) bc 91. (.3) bc ph 4.4 (.14) 4.39 (.16) 4.4 (.18) 4.39 (.4) 4.3 (.) 4.38 (.9) 4.39 (.1) 4.36 (.4) 4.42 (.) 4.41 (.11) SST ( Brix) 6.8 (.2) b 6.63 (.18) b 6.6 (.3) b 6.8 (.14) b 6. (.14) b 6.5 (.) b 6.4 (.8) b 6.88 (.1) b 6. (.2) b 6.5 (.) b x w (%) 9.9 (.6) 91.6 (.6) 91.1 (.8) 91.4 (.2) (.8) 91.3 (.) (.4) (.) 91.3 (.1) 9.9 (.2) ph 4.28 (.16) 4.39 (.16) 4.2 (.4) 4.2 (.8) 4.31 (.6) 4.25 (.1) 4.3 (.14) 4.34 (.1) 4.3 (.2) 4.3 (.) SST ( Brix) 6.5 (.8) 6. (.2) 6.8 (.4) 6. (.2) 6.9 (.4) 6.8 (.2) 6.5 (.) 6.8 (.12) 6.8 (.13) 6.68 (.1) x w (%) 91.1 (.2) 91.3 (.) 91.3 (1.1) 91.3 (.4) 91.1 (.) 9.95 (.16) 91.1 (.2) 9.9 (.14) 91.2 (.8) 91.4 (.8) ph 4.39 (.) 4.33 (.) 4.2 (.5) 4.3 (.8) 4.39 (.1) 4.24 (.3) 4.26 (.5) 4.4 (.2) 4.3 (.1) 4.2 (.6) SST ( Brix) 6. (.5) 6.61 (.16) 6.6 (.2) 6.5 (.4) 6.5 (.3) 6.5 (.4) 6. (.5) 6.6 (.5) x w (%) 92.3 (.9) 91.5 (.) 91.4 (.5) 91.5 (.6) 91.2 (1.) 91.4 (.5) 91.1 (.6) 91.1 (.5) ph 3.31 (1.) 3.6 (.8) b 3.8 (.4) b 4.15 (.) b (.4) b 4.6 (.6) b 4.8 (1.) b 5.2 (1.3) b SST ( Brix) 6.4 (.14) 6.53 (.1) 6.4 (.4) 6.5 (.2) 6.5 (.) 6.3 (.3) x w (%) (.2) 91.1 (.4) 9.5 (1.) 9.9 (.9) 91. (.1) 91.4 (.5) ph 4.2 (.15) 4.19 (.13) 4.24 (.4) 4.24 (.4) 4.2 (.4) 4.29 (.) Trtmiento (W/g) Tiempo (min) Determinciones SST ( Brix) 6. (.2) cdef 6.64 (.5) bcdef 6.3 (.4) def 6. (.4) cdef 6.8 (.12) ef 6.53(.4) bcdef 6.5 (.3) bcd 6.5 (.9) bcde 6.44 (.5) bc 6.34 (.2) x w (%) 91.2 (.4) bc 91.8 (.3) bc 91.5 (.4) bc 9. (.4) 91.4 (.4) bc 91.4 (.5) bc 91.4 (.4) bc 92. (.4) bc 91.4 (.3) bc 91.4 (.4) bc ph 4.4 (.2) 4.5 (.2) 4.44 (.4) 4.34 (.13) (.) 4.42 (.13) 4.33 (.14) 4.3 (.2) 4.28 (.) 4.3 (.2) SST ( Brix) 6. (.) b 6.66 (.12) b 6.55 (.) 6.58 (.3) x w (%) 91.1 (.4) 91.5 (1.) 91.2 (.1) 91.4 (.4) ph (.3) 4.3 (.4) 4.3 (.1) 4.34 (.2) 1 Los vlores se corresponden l medi de tres repeticiones (Desvición Estándr).,b,c Superíndices similres indicn grupos estdísticmente homogéneos con un nivel de confinz del 95%.

17 EFECTO DE LA CONGELACIÓN SOBRE EL PRETRATAMIENTO CON MICROONDAS Durnte el proceso de congelción se produce l cristlizción de ls moléculs de gu, psndo del estdo líquido l sólido. Los cristles de hielo se formn lrededor de un núcleo de cristlizción, l cul se gregn moléculs de gu decudmente orientds en l estructur cristlin que hcen crecer el cristl medid que el proceso de congelción vnz. En este fenómeno son importntes dos fctores: l velocidd de formción de los núcleos de cristlizción y l velocidd de crecimiento de los cristles de hielo. En concreto, si los cristles de hielo se formn lentmente, es decir, cundo se formn tss lents de congelción, se producirá un número reltivmente pequeño de centros de nucleción y por consiguiente de cristles de hielo, los cules tendrán un ts de crecimiento elevd. Por lo tnto cundo se congel lentmente un producto, se genern pocos cristles de hielo pero de grn tmño, lo que puede producir deformciones y roturs celulres irreversibles. Según se h comentdo nteriormente, es necesrio conocer si un congelción previ l prettmiento fvorecerí l cción de ls microonds y enmscrrí los resultdos obtenidos en el prtdo nterior (efectos solpdos). Pr comprobrlo se crcterizron fisicoquímicmente y se determinron los perfiles de zúcres de dos muestrs, un de ells congeld y l otr sin congelr, pretrtds con microonds e hidrolizds enzimáticmente. Estos nálisis y el resultdo del contrste de rngo múltiple pr ls medis de cd uno de los prámetros medidos y escogiendo como vrible respuest l congelción (ANOVA monofctoril, nivel de confinz del 95%), se resumen en l tbl 5. TABLA 5. Crcterizción fisicoquímic y contenido en zúcres totles y fermentbles del residuo congeldo y sin congelr, pretrtdo con microonds e hidrolizdo enzimáticmente 1. Congelción SST (ºBrix) ph x w (%) Azúcres Fermentbles Azúcres Totles No.8 (.4) 4.46 (.4) (.8) 46.2 (1.) 48 (2) Sí.18 (.11) 4.44 (.4) 89 (1) 5.8 (.9) 52.5 (.) 1 Los vlores se corresponden l medi de tres repeticiones (Desvición Estándr).,b,c Superíndices similres indicn grupos estdísticmente homogéneos con un nivel de confinz del 95%. Según el nálisis estdístico, no existen diferencis estdísticmente significtivs en el contenido en zúcres totles y fermentbles, SST (ºBrix), ph y humedd entre l muestr congeld y l muestr sin congelr. No obstnte, se observ que l muestr congeld tiene un cntidd ligermente superior de zúcres que l muestr sin congelr y por lo tnto de SST (ºBrix), lo que sugerirí cierto efecto de l congelción sobre l estructur lignocelulósic. En culquier cso, puesto que este efecto no result significtivo, se podrí firmr que el hecho de conservr l muestr en congelción no interferirí sobre los resultdos obtenidos en el presente trbjo. 15

18 CONCLUSIONES Los resultdos obtenidos en el presente trbjo sugieren que, en generl, pretrtr con microonds el residuo sólido de l piñ permite mejorr el proceso de hidrólisis enzimátic. Esto es el resultdo de l sum de los efectos térmicos (clentmiento volumétrico, selectivo y rápido) y no térmicos sobre l mtriz lignocelulósic que pueden fcilitr l ruptur de l estructur lignocelulósic y fvorecer l hidrólisis enzimátic. Los pretrtmientos 6.35 W/g, 4.25 W/g entre min y 8.5 W/g entre 1-3 min generron un incremento estdísticmente significtivo de los zúcres totles y fermentbles con respecto l muestr hidrolizd sin prettmiento. En concreto, en l muestr pretrtd 6.35 W/g durnte 4 min se produjo un incremento del 4 % pr los zúcres fermentbles y del 46% pr los totles con respecto l residuo sólido hidrolizdo sin pretrtmiento y del 123% con respecto l residuo sólido inicil. Por otro ldo, se demostró que l congelción previ l empleo de ls microonds no interfiere significtivmente en los resultdos. Futuros trbjos se centrrán en el estudio de los cmbios (micro) estructurles producidos en l estructur lignocelulósic pr entender mejor el efecto del pretrtmiento con microonds, como por ejemplo exminr ls muestrs medinte microscopí electrónic de brrido de congelción (Cryo- SEM). Por otro ldo, es necesrio l relizción de estudios utilizndo microonds continuos de tipo industril pr determinr el beneficio potencil (rendimiento y económico) del empleo de pretrtmientos con microonds escl industril. Además serí conveniente nlizr l eficci de un pretrtmiento combinndo el efecto de ls microonds junto con un pretrtmiento químico convencionl, es decir, en medio lclino o ácido. AGRADECIMIENTOS Me gustrí dedicr ests línes quells persons que hn hecho posible que este trbjo finl de máster se un relidd. A tod mi fmili, especilmente mis pdres, por su poyo, sus consejos y l motivción constnte que me hn brinddo pr concluir est tesin. Agrdecerles tmbién mis migos, que con su entusismo y criño me lentron continur. Tmbién mis compñeros y profesores del Instituto de Ingenierí de Alimentos pr el Desrrollo (IIAD), especilmente l Dr. Milgro Reig por su pcienci y yud con l cromtogrfí. A mi director de trbjo finl de máster, l Dr. Lucí Seguí, por su sbidurí, esfuerzo y dedicción pr l elborción de est tesin. 16

19 Y, en especil mi director, compñer, y sobretodo mig Cludi Cones. Porque después de todo este ño tn difícil de sonriss y lágrims, de legrís y decepciones, siempre hs estdo hí nimándome y poyándome, sin nunc flojr, porque eres un de ls mejores persons que he conocido, por todo lo que me hs enseñdo y porque trbjr contigo es un ventur en l que superr obstáculos se convierte en lgo sencillo y reltivo. Grcis por tod tu comprensión y yud, sin tu poyo no hbrí sido posible. Te deseo siempre lo mejor de todo corzón, Mucho ánimo y sigue sí! Y todos quellos que prticipron direct o indirectmente en l elborción de este trbjo, mi myor grdecimiento y grtitud. REFERENCIAS Abdullh, A. y Mt, H. (28). Chrcteriztion of solid nd liquid pinepple wste. Rektor, 12: Azum, J.; Tnk, F.; Koshijim, T. (1984). Enhncement of enzymtic susceptibility of lignocellulosic wstes by microwve irrdition. Journl of Fermenttion Technology, 62: Bn-Koffi, L; Hn, Y. W. (199). Alcohol production from pinepple wste. World Journl of Microbiology nd Biotechnology, 6: Crdon, C. A. y Sánchez, O. J. (2). Fuel ethnol production: Process design trends nd integrtion opportunities. Bioresource Technology, 98: Dtt, A. K. (21). Fundmentls of het nd moisture trnsport for microwveble food product nd process development. En: Dtt, A. K.; Anntheswrn, R. C. Editors. Hndbook of microwve technology for food pplictions. New York: Mrcel Dekker Inc., New York, De l Hoz, A.; Diz-Ortiz, A.; Moreno, A. (25) Microwves in orgnic synthesis. Therml nd non-therml microwves effects. Chemicl Society Reviews, 34: FAO. FAOSTAT dtbse [en líne]. Dirección URL: < [Consult 18 Abril 213) Fengel, D. y Wegener, G. (1984). Wood: Chemistry, ultrstructure, rections. De Gruyter, Berlin.Goyl, A.; Ghosh, B.; Eveleigh, D Chrcteristics of fungl cellulose. Bioresource Technology, 36: 3-5. Hhn-Hgerdl, B.; Krhum, K.; Fonsec, C.; Spencer-Mrtins, I.; Gorw-Gruslund, M. F. (2). Towrds industril pentose-fermenting yest strins. Applied Microbiology nd Biotechnology, 113: Hu, Z. y Wen, Z. (28). Enhncing enzymtic digestibility of switchgrss by microwvessisted lkli pretretment. Biochemicl Engineering Journl, 38: Hung, C. F.; Lin, T. H.; Guo, G. L.; Hwng, W. S. (29). Enhnced ethnol production by fermenttion of rice strw hydrolyste without detoxifiction using newly dpted strin of Pichi stipitis. Bioresource Technology, 1: Ketnw, S.; Chiwut, P.; Rwdkuen, S. (212). Pinepple wstes: A potentil source for bromelin extrction. Food nd Bioproducts Processing, 9: Kitchiy, P.; Intnkul, P.; Krirish, M. (23). Enhncement of enzymtic hydrolysis of lignocellulosic wstes by microwve pretretment under tmospheric pressure. Journl of Wood Chemistry nd Technolgy, 23: L Lee, W. J.; Ryu, Y. W.; Seo, J. H. (2). Chrcteriztion of two-substrte fermenttion processes for xylitol production using recombinnt Scchromyces cerevise contining xylose reductse gene. Process Biochemistry, 35: Lidström, P.; Tierney, J.; Wther, B.; Westmn, J. (21). Microwve ssisted orgnic synthesis. A review. Tetrhedron, 5:

20 Liu, C. G. y Wymn, C. E. (25). Prtil flow of compressed-hot wter through corn stover to enhnce hemicellulose sugr recovery nd enzymtic digestibility of cellulose. Bioresource Technology, 96: Mosier, N.; Wymn, C.; Dle, B.; Elnder, R.; Lee, Y. Y.; Holtzpple, M.; Ldisch, M. (25). Fetures of promising technologies for pretretment of lignocellulosic biomss. Bioresource Technology, 96: Musstto, S. I.; Drgone, G.; Guimres, P. M. R.; Silv, J. P. A.; Crneiro, L. M.; Roberto, I. C.; Vicente, A.; Domingues, L.; Teixeir, J. A. (21). Technologicl trends, globl mrket nd chllenges of bioethnol production. Biotechnology Advnces, 28: Nigm, J.N. (1999). Continuous ethnol production from pinepple cnnery wste. Journl of Biotechnology, 2: Ooshim, H.; Aso, K.; Hrno, Y. (1984). Microwve tretment of cellulosic mterils for their enzymtic hydrolysis. Biotechnology Letters, 6: Rungviriychi, C.; Niwswong, C.; Kosiknon, N.; Chnthi, S.; Chimrt, P. (21). Pinepple Peel Wste for Bioethnol Production. Journl of Biotechnology, 15: 1. Sh, B. C.; Iten, L. B.; Cott, M. A.; Wu Y. V. (25). Dilute cid pretretment, enzymtic scchrifiction nd fermenttion of whet strw to ethnol. Process Biochemistry, 4: Sski, K.; Noprtnrphorn, N.; Ngi, S. (1991). Use of photosynthetic bcteri for the production of SCP nd chemicls from gro industril wste. In Bioconversion of wste mteril to industril product. Editoril Mrtin A.M. Elsevier Applied Science, London: Scheller, H. V. y Ulvskov, P. (21). Hemicelluloses. Annul Review Plnt Biology, 61: Shllom, D. y Shohm, Y. (23). Microbil hemicellulses. Current Opinion in Microbiology, 6: Sun, Y. y Cheng, J. (22). Hydrolysis of lignocellulosic mterils for ethnol production: review. Bioresource Technology, 83: Therzdeh, M. J. y Krimi, K. (2) Process for etnol from lignocellulosic mterils I: Acid-bsed hydrolysis processes. Bioresources, 2: Tlens, C.; Cstro-Giráldez, M.; Bld, C.; Fito, P.J. (213). Thermodynmic model of microwve drying of citrus peel with different tretments. Book of Proceedings: InsideFood Symposium 213. Tnk, K.; Hilry, Z. D.; Ishizki, A. (1999). Investigtion of the utility of pinepple juice nd pinepple wste mteril s low-cost substrte for ethnol fermenttion by Zymomons mobilis. Journl of Bioscience nd Bioengineering, 8: Ting, C. L.; Mkrov, D. E.; Wng, Z. G. (29). A Kinetic Model for the Enzymtic Action of Cellulse. The Journl of Physicl Chemistry, 113: Xiong, J.; Ye, J.; Ling, W. Z.; Fn, P. M. (2). Influence of microwve on the ultrstructure of cellulose I. J South Chin University of Technology, 28: Zhu, S. D.; Wu, Y. X.; Yu, Z. N. (25). Pretretment by microwve/lkli of rice strw nd its enzymtic hydrolysis. Process Biochemistry, 4: Zhu, S. D.; Wu, Y. X.; Yu, Z. N. (26). Microwve-ssisted lkli pre-tretment of whet strw nd its enzymtic hydrolysis. Biosystems Engineering, 94: