Universidad Nacional Autónoma de México

Transcripción

1 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Química Curso Genética y Biología Molecular (1630) Licenciatura Químico Farmacéutico Biológico Dra. Herminia Loza Tavera Profesora Titular de Carrera Departamento de Bioquímica Lab 105, Edif E hlozat@unam.mx

2 IX. PRINCIPIOS DE INGENIERÍA GENÉTICA Objetivo general El alumno conocerá los principios de la tecnología del DNA recombinante y su potencial para generar organismos genéticamente modificados.

3 Objetivos particulares 1. Aislamiento, análisis y manipulación de ácidos nucleicos 2. Generación de moléculas de DNA recombinante 3. Ingeniería Genética 4. Clonación y células troncales. El alumno Examinará los principios y las bases de algunas técnicas utilizadas en biotecnología (PCR, construcción y escrutinio de bibliotecas, Northern y Southern-blot, microarreglos) Distinguirá las diferencias entre biblioteca genómica y de cdna Comprenderá el principio de la técnica de la amplificación de ácidos nucleicos por PCR Conocerá los métodos de análisis para evaluar la expresión genética a nivel de RNA y proteínas Conocerá las características, funcionamiento e importancia de las enzimas de restricción Conocerá las características principales de los plásmidos como vectores de clonación Conocerá la existencia de vectores de clonación diferentes a los plásmidos (fagos, cósmidos, BACS y YACS) Describirá las técnicas y pasos para la clonación y expresión de moléculas recombinantes de DNA en organismos heterólogos Conocerá los métodos utilizados en la expresión de proteínas recombinantes en organismos heterólogos Conocerá la aplicación de los organismos transgénicos en la agricultura, farmacia y medicina Conocerá la aplicación de producción fármacos y vacunas en animales y plantas transgénicos Conocerá las estrategias generales de clonación de células de mamíferos Conocerá las características generales de las células troncales y las aplicaciones potenciales de éstas en la terapia. X X X X X X X X X X X X Conocimiento Comprensión Aplicación

4 Ingeniería Genética II

5 Expresión de proteínas recombinantes Vectores de expresión Características adicionales: - Promotor regulable - Terminador de la transcripción - Sitio de reconocimiento por el ribosoma

6 Análisis de la expresión de proteínas recombinantes empleando PAGE IPTG inductor

7 Producción de proteínas recombinantes en bacterias

8 Escalamiento y purificación de la proteína

9 La tecnología de DNA recombinante genera herramientas para estudiar los genes y sus productos Insertar en vector de expresión Deducir secuencia de aminoácidos Transformar E. coli u otro hospedero Preparar péptidos sintéticos Preparar anticuerpos específicos para una proteína Secuencia de aminoácidos Anticuerpo específico Sintetizar sonda específica Escrutinio de una biblioteca de DNA por Southern blot Escrutinio de una biblioteca de expresión por Western blot

10 Western blot. Detección de proteínas específicas empleando anticuerpos.

11 La detección de proteínas permite conocer: 1. Niveles de expresión 2. Isoformas 3. Modificaciones postraduccionales 4. Tiempo de vida media y degradación 5. Localización subcelular

12 El uso de anticuerpos permite la localización de proteínas en las estructuras celulares

13 Uso de las técnicas de DNA recombinante en diferentes ámbitos de utilidad al hombre

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16 Aplicaciones las técnicas de DNA recombinante en Biotecnología Vegetal Plantas transgénicas que expresan proteínas que le confieren alguna propiedad agronómica importante: Resistencia a plagas de insectos Resistencia a herbicidas Resistencia a virus Detección de microorganismos patógenos en plantas por métodos moleculares. Virus, bacterias, micoplasmas

17 Mejoramiento tradicional de plantas Implica hacer una cruza entre genotipos distintos para incorporar un carácter y luego hacer selección y autocruzas para obtener un homocigoto. Muchas de las características a mejorar se heredan de forma Mendeliana. Puede llevar varios años hasta obtener el homocigoto con los caracteres deseados.

18 La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento de un gen de cualquier especie e incorporarlo en plantas para que tengan una nueva característica Una limitación importante es la transformación (introducción del DNA) de céluals vegetales. Transformación por bombardeo

19 Transformación de células vegetales T-DNA: plásmido presente en Agrobacterium tumefaciens

20 Agrobacterium tumefasciens produce tumores en las plantas

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22 Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens

23 Transformación por Agrobacterium tumefaciens

24 Proceso de transformacion por Agrobacterium

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26 Transformación por biobalística

27 Aplicación: resistencia a plagas de insectos Gusano barrenador en maíz En las esporas de Bacillus thuringensis se acumulan proteínas (Cry) con actividad insecticida. Toxinas Bt

28 Mecanismo de acción de las toxinas Bt El insecto ingiere la protoxina al alimentarse del tejido de la planta La protoxina sufre proteólisis en el intestino del insecto y se genera la toxina activa La toxina se une a receptores en las células epiteliales del intestino La toxina se oligomeriza y forma poros en la membrana plasmática de las células epiteliales

29 La toxina Bt es orgánica, por lo tanto es biodegradable Por el uso de cultivos Bt resistentes a insectos: Se reduce el número de aplicaciones de insecticidas. Se incrementa el rendimiento El uso de estos cultivos se ha incrementado mundialmente en los últimos años:

30 Controversias sobre plantas transgénicas. Los vectores para la transformación de plantas tienen marcadores de resistencia a antibióticos como marcadores de selección. La presencia ubicua de estos genes pueden facilitar la transferencia de resistencia a antibióticos a bacterias pátogenas. Generalmente los marcadores de selección son Kan R y Neo R Escape de genes del cultivo transgénico a malezas. Por ej. generación de malezas con capacidades de resistencia a herbicidas.

31 El caso de maíz en México. Riesgos que hay que considerar para diseñar estrategias para evitarlos. México es el centro de origen del maíz. Hay amplia diversidad y especies de maíz silvestre en México. Transferencia de genes a estas especies.

32 Bancos de mutantes en los organismos modelos

33 Clonación en células animales Métodos de transfección Permeabilización química de las membranas Electroporación Liposomas Vectores Vectores derivados de virus animales SV40 Retrovirus Vacuna Vectores mixtos Métodos de selección Detección de actividades enzimáticas Resistencia a inhibidores Resistencia a antibióticos Integración dirigida

34 Transformacion en células eucariontes Biobalística Transformación directa Microinyección Virus

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36 Vectores de expresión para transformar células animales Promotor inducible para animales

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40 Animales transgénicos

41 Mutación en una helicasa causa envejecimiento prematuro

42 Creando ratones Knockout Los ratones knockout permiten estudiar la función de una proteína codificada por un gen

43 La técnica implica la mutación dirigida de un gen específico

44 Medicina genómica/ Terapia génica Introducir células transformadas (con un gen intacto) en el tejido somático para corregir una función defectuosa o en la línea germinal. Inmunodeficiencia combinada severa. Defecto en la desaminasa de adenosina. Células madre de la médula ósea se transforman.