Métodos de Biología Molecular y de Ingeniería Genética

Transcripción

1 Métodos de Biología Molecular y de Ingeniería Genética

2 I. Enzimas de restricción Análisis

3 Las enzimas de restricción fueron aisladas de bacterias; su función natural es proteger contra DNA extraño

4 II. Producción de DNA recombinante DNA A ligasa DNA B DNA AB

5 III. Separación electroforética de moléculas de DNA (A) Geles de secuenciación (separación de bandas con 1 nt de diferencia) (B) Electroforesis para RFLP (sepración entre 100 a nt) + (C) Electroforesis de campo pulsante (separación de DNA cromosomal) + +

6 IV. Secuenciación de DNA por el método de Sanger No acepta elongación de la cadena de nucleotidos por la DNA polimerasa dsdna molde ( secuencia?) 4 desoxiribonucleótidos (dntps) cebador de DNA DNA polimerasa

7 Secuenciación automatizada de DNA

8 Hibridación y reconocimiento de secuencias con alta homología 65 o C 50 o C

9 V. Marcaje de un fragmento de DNA (obtención de una sonda) dctp[ P 32 ]

10 Secuencia de pasos para la detección de genes específicos A nivel de DNA Southern Blot A nivel de RNA Northern Blot 1. Aislamiento de DNA 2. Cortar con enzimas de restricción 3. Separar fragmentos por electroforesis 4. Desnaturalizar el DNA 5. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 6. Hibridar con sonda específica 7. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager Presencia de genes 1. Aislamiento de RNA 2. Desnaturalizar el RNA 3. Separar por electroforesis desnaturalizante 4. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 5. Hibridar con sonda específica 6. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager Expresión de genes

11 Southern Blot (DNA) o Northern Blot (RNA) Bromuro de etidio Sonda P 32

12 Southern Blot Northern Blot 28S 18S

13 Western Blot (detección de proteínas específicas con anticuerpos)

14 La detección de proteínas sirve para conocer: 1. Niveles de expresión 2. Isoformas 3. Modificaciones postraduccionales 4. Tiempo de vida media y degradación 5. Localización subcelular

15 VI. DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS mediante Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cebador reverso cebador directo Desnaturalizar ADN a 94 C Alineamiento Cebadores a C Polimerización Taq polimerasa a 72 C

16 La amplificación es exponencial En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento particular de interés

17 El PCR se puede utilizar como alternativa del Southern y Northern blot DNA: PCR Amplificación directa Exones + intrones RNA: RT-PCR 1. Transcripción reversa (obtención de cdna) 2. Amplificación por PCR Solo exones

18 Vectores de clonación 1. Plásmidos 2. Fagos 3. Cósmidos 4. Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz)

19 Plásmidos DNA doble cadena, circular, origen propio de replicación Se pueden clonar fragmentos entre 1,000 y 10,000 nucleótidos

20 Otras características de los plásmidos Sitios de clonación múltiples: varias enzimas de restricción que solo cortan una vez en el plásmido

21 Después del PCR los fragmentos se pueden clonar Los cebadores son diseñados con extremos reconocidos por enzimas de restricción

22 Marcadores de resistencia a antibióticos Permiten la selección de bacterias transformadas con el plásmido o con el DNA recombinante

23 Plásmido de bajo número de copias Plásmido de alto número de copias La transformación implica la introducción de DNA extraño a una célula hospedante

24 Múltiples copias de DNA recombinante

25 Plásmidos de expresión Caracteristicas adicionales: - Promotor regulable - Terminador de la transcripcion - Sitio de reconocimiento por el ribosoma

26 Clonación en Fagos

27 Bibliotecas genómicas DNA genomico Digestion con enzima de restriccion

28 Bibliotecas de cdna RNA mensajero Reverso transcripcion Cebador de oligo dt Sintesis de DNA doble cadena

29 Clonación en células animales Métodos de transfección Permeabilización química de las membranas Electroporación Liposomas Vectores Plásmidos Vectores derivados de virus animales SV40 Retrovirus Vacuna Vectores mixtos Métodos de selección Detección de actividades enzimáticas Resistencia a inhibidores Resistencia a antibióticos Integración dirigida

30 Vectores de expresión para células animales Promotor inducible para animales

31 Transformacion en celulas eucariontes Biobalística Transformación directa Microinyección Virus

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33 Transformación en células vegetales mediada por Agrobacterium tumefaciens

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35 Transformación por biobalística

36 Construcción de Genes Reporteros 5 UTR X Alguna proteína que sea medible fácilmente 3 UTR X Promotor del gen X Gen reportero El resto de características de los vectores de expresión son similares

37 Proteínas reporteras Luciferasa de luciérnaga (LUC) Proteína verde fluorescente (GFP) Betaglucoronidasa (GUS)

38 Se tiene un plásmido con un gen de resistencia a gentamicina y otro de resistencia a ampicilina. Este plásmido posee un sitio único de corte para Hind III que mapea detro del gen de resistencia a gentamicina. Se introduce un fragmento de DNA de interés en el sitio de Hind III (cortando ambos fragmentos de DNA con esta enzima), se liga el plásmido y se transforman bacterias con dicho material genético. Luego se plaquean colonias en tres cajas de cultivo. La 1 no lleva antiobiótico, la 2 lleva gentamicina, la 3 lleva ampicilina y la 4 ambos antiobióticos. En cuál (es) caja (s) crecen colonias bacterianas que portan el DNA de interés?

39 a) b) c) d) EcoRI Amp Amp HindIII Amp EcoRI Amp HindIII EcoRI EcoRI ORI HindIII ORI HindIII ORI ORI Cuál de estos plásmidos utilizarías para clonar un fragmento de DNA cortado con las enzimas EcoRI y Hind III?