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Transcripción

1 1 TRABAJO PRÁCTICO No. 8 ENTEROBACTERIAS OBJETIVOS 1. Identificar las características morfológicas y tintoreales a partir frotis teñidos con el método de Gram. 2. Desarrollar los criterios necesarios para la selección de medios selectivos adecuados para el aislamiento de Enterobacterias. 3. Explicar el fundamento del aislamiento e identificación de Enterobacterias en medios selectivos y diferenciales. 4. Estudiar y reconocer las características diferenciales entre las enterobacterias fermentadoras de la lactosa (coliformes) y no fermentadoras de la lactosa (no coliformes). 5. Esquematizar la marcha diagnóstica para la identificación de las especies de enterobacterias estudiadas. GENERALIDADES La familia Enterobacteriacea se caracteriza por agrupar bacilos anaerobios facultativos Gramnegativos, aunque no se debe olvidar que los miembros de la familia Vibrionaceae y de los géneros Haemophilus, Pasteurella y Actinobacillus también se caracterizan por agrupar bacilos anaerobios facultativos Gram negativos. Esto debe tenerse presente en algunos casos para establecer un diagnóstico diferencial entre este tipo de bacilos. La familia Enterobacteriaceae comprende un gran número de especies de forma bacilar Gram-negativas, no esporuladas, generalmente móviles, algunos poseen capsula. En cuanto al metabolismo, debido a su carácter fermentador tienen la propiedad de reducir los nitratos a nitritos, de fermentar diferentes carbohidratos con o sin producción de gas y son negativos a la prueba de oxidasa. Las especies de esta familia constituyen la flora bacteriana normal y patológica del tracto intestinal. En esta familia pueden establecerse grupos bioquímicos homogéneos, cuyas especies se relacionan serológicamente. Para la diferenciación de las especies de enterobacterias se utilizan una gran variedad de reacciones bioquímicas, así como también sus propiedades antigénicas, aunque, generalmente se establecen criterios convencionales para facilitar su taxonomía. Una diferenciación primaria muy útil puede basarse en la fermentación de la lactosa, así tenemos, que las bacterias

2 2 coliformes fermentan este carbohidrato con rapidez formando ácido y gas en un período de 24 horas; otras como por ejemplo, Shigella y Salmonella, no la fermentan. No obstante, este criterio no es absoluto por cuanto algunas especies de Shigella la fermentan lentamente, sin embargo, desde el punto de vista práctico la actividad fermentativa sobre la lactosa tiene aplicación en la clasificación. En este trabajo práctico se estudiarán los géneros: Escherichia y Salmonella. A) ESTUDIO MORFOLÓGICO Y TINTORIAL MATERIAL a) Cultivo de una enterobacteria en caldo nutritivo de 24 horas. b) Batería de colorantes para tinción según el método de Gram. Cuando la identificación de enterobacterias se realiza a partir de producto patológico el procedimiento es el siguiente. 1. Tipo de muestra 1.1. Material Fecal: Se hace una suspensión en solución salina fisiológica estéril o se siembra determinada cantidad pesada en gramos en un medio de preenriquecimiento Material de necropsia, carne, queso y otras muestras sólidas: Se procede a efectuar un macerado en mortero estéril, o se realiza un licuado de la muestra añadiendo un poco de solución salina fisiológica. La parte líquida se utiliza para efectuar el diagnóstico Huevos de aves de corral: Se sumergen en un recipiente con alcohol de 70% durante unos 3 minutos, a fin de eliminar las bacterias presentes en la parte externa. Luego se coloca, en un recipiente con agua estéril, con la finalidad de eliminar el alcohol. Con un ligero golpe se fracciona la cáscara y con precaución de asepsia se vierte su contenido en un recipiente estéril, agitando para obtener una mezcla uniforme Los líquidos orgánicos y otras muestras en estado líquido no necesitan procesamiento previo. 2. Preparar frotis a partir de un cultivo puro, alimentos y medios de cultivo. 3. Observar al microscopio las características morfológicas y afinidad al Gram. B) CARACTERÍSTICAS DEL CULTIVO MATERIAL a) Muestra En el material fecal, las bacterias entéricas patógenas se encuentran siempre asociadas a una

3 3 gran variedad de microorganismos que constituyen la flora normal del tracto intestinal. Además estos microorganismos patógenos cuando se encuentran en los líquidos orgánicos así como también en el agua y en los productos alimenticios como carne y queso, suelen encontrarse conjuntamente con una flora asociada no patógena. Para el aislamiento de las enterobacterias se emplean medios selectivos, los cuales inhiben el desarrollo de la flora asociada que puede estar presente. b) MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO b.1) Caldo tetrationato de Muller y Kauffmann. El caldo tetrationato tiene en su composición peptona, sales biliares, carbonato de calcio y tiosulfato de sodio. En el momento de sembrar la muestra, se agrega solución yodo-yodurada y la combinación del yodo y el tiosulfato de sodio, forman tetrationato, sustancia que inhibe el desarrollo de casi la totalidad de las enterobacterias, exceptuando el de Salmonella y algunas cepas de Proteus, por esto, se emplea solo para la búsqueda de Salmonella. c) MEDIOS DE AISLAMIENTO (Semidemostrativo) c.1) Medio de Mac-Conkey: Este medio selectivo contiene sales biliares que provoca la inhibición de la flora Gram-positiva. Los gérmenes del grupo coliforme forman colonias de color rojo ladrillo (debido al indicador rojo neutro) debido a que fermentan la lactosa. En cambio, las bacterias no fermentadoras forman colonias incoloras. c.2) Medio de S.S. agar: Es un medio selectivo para los géneros Salmonella y Shigella. Entre otras sustancias, contiene lactosa, sales biliares, verde brillante, citrato, tiosulfito de Na y rojo neutro. En este medio, Shigella forma colonias pequeñas, incoloras, translúcidas, generalmente lisas. Salmonella y Proteus forman colonias incoloras, sin tendencia invasora, con un punto central negro. En cambio los gérmenes del grupo coliforme, que fermentan la lactosa, desarrollan colonias de color rosado o rojo. Las bacterias Gram positivas son inhibidas. c.3) Medio de Endo: Se emplea para determinar la presencia de organismos coliformes en el agua, leche u otros materiales de importancia sanitaria. El medio presenta en su composición peptona lactosa, sulfito de sodio y fucsina básica. Las colonias de Escherichia coli fermentadora de la lactosa, aparecen de color rosado, en cambio las de otros bacilos entéricos incluyendo Salmonella y Shigella son incoloras. Los microorganismos al fermentar la lactosa producen ácidos que recolorean la fucsina decolorada por el sulfito de sodio.

4 4 c.4) Medio de Levine (Agar eosina - azul de metileno): Es un medio de aislamiento que contiene lactosa, sacarosa, eosina - azul de metileno. Escherichia coli forma colonias pequeñas moradonegruscas, con brillo metálico. Salmonella y Shigella forman colonias pequeñas e incoloras. Las especies de los géneros Klesbsiella y Enterobacter, forman colonias mucosas color café, sin reflejos metálicos. c.5) Agar verde brillante: Presenta en su composición lactosa, sacarosa, rojo de fenol y verde brillante. Cuando las colonias fermentan los azúcares (Escherichia coli) las colonias toman color amarillo verdoso y el medio se torna verde brillante. Las colonias no fermentadoras son de color rosado y el medio toma un color rojo. d) MEDIOS DIFERENCIALES Existen varios medios de cultivo que aportan características bastantes diferenciales entre los géneros de la familia Enterobacteriaceae. Se describirán dos de los medios diferenciales más utilizados. d.1) Medio Triple azúcar hiero: comúnmente denominado TSI (por sus siglas en inglés: Triple Sugar Iron). El agar TSI, es un medio inclinado que contiene en el fondo y en la porción en bisel del agar los azúcares glucosa, sacarosa y lactosa, los cuales son dispensados en el tubo de manera tal que en el fondo del tubo se encuentra la glucosa, en la parte media la sacarosa y en el resto del bisel la lactosa. Además presenta sulfato de hierro y amonio. Este medio permite diferenciar Proteus y Salmonella de coliformes principalmente por la fermentación de sacarosa y glucosa; y permite distinguir los bacilos tifoides de Shigella por precipitar el sulfuro de hierro y oscurecer el agar. La lectura e interpretación se realiza después de horas de incubación. No obstante se recomienda el examen diario durante siete días para una lectura definitiva. La degradación de los azúcares se establece por acidificación del medio lo cual se evidencia por un cambio de color del indicador, rojo de fenol, a un color amarillo. Y la degradación de aminoácidos azufrados se evidencia por oscurecimiento del fondo del tubo debido a la formación de sulfuro (Tabla I). d.2) Medio Costa Vernin (CV): El medio de CV presenta dos indicadores, indicador de Andrade y Azul de timol, y solución urea - azúcares (urea - lactosa - sacarosa). Presenta una base compuesta por una parte semi-sólida (peptona, NaCl, agar 0.5%, y H 2 0). La base sólida en la parte superior del tubo compuesta por peptona, tripticasa, agar y H 2 0, llevan también sulfato ferroso amoniacal y tiosulfato de sodio. La utilización de este medio permite obtener información sobre la acción que tienen estas

5 5 especies bacterianas sobre la lactosa, la sacarosa (el indicador de Andrade vira al color rojo si el medio se acidifica), si producen de gas como producto de la fermentación de los azúcares, si degradan aminoácidos que contienen azufre (a través de la producción de H 2 S), si poseen motilidad y si son capaces de hidrolizar de la urea. Tabla I Lectura e interpretación de los resultados obtenidos en el medio TSI Género Fondo Bisel Producción de H 2 S Escherichia Amarillo c/gas Amarillo - Klebsiella Amarillo c/gas Amarillo - Enterobacter Amarillo c/gas Amarillo - Citrobacter *Amarillo c/gas Rojo + Proteus *Amarillo c/gas Rojo +/ - Shigella Amarillo Rojo - Salmonella *Amarillo Rojo + * El color amarillo del fondo puede estar enmascarado con el color negro de H 2 S +. Para utilizar cualquiera de los dos medios diferenciales descritos se deben seguir los siguientes pasos: 1. Procesar las muestras según las indicaciones para cada caso en particular. 2. Sembrar la muestra en los medios de aislamiento de Mac-Conkey y S.S. agar, cuando se sospecha de Salmonella se procede a sembrarlas en el medio de caldo tetrationato de Muller y Kauffmann. Incubar a 37º C por un período de horas. 3. Observar las características de las colonias y las modificaciones ocurridas en los medios utilizados. 4. Una vez obtenido un cultivo puro de la cepa a identificar se procede a sembrar en los medios diferenciales de TSI o CV 5. La siembra se realiza por punción y estría, dado que estos medios son agar taco inclinado. 6. Incubar por horas a 37º C. 7. Observar las características de crecimiento y los cambios producidos en los medios para establecer el género de enterobacterias.

6 6 C) PROPIEDADES METABÓLICAS Cepas bacterianas: Escherichia coli y Salmonella. MATERIAL a) Cultivo puro de cada género bacteriano en agar nutritivo o agar BHI. b) Medios para pruebas metabólicas: b.1) Test O/F b.2) Carbohidratos. Glucosa, lactosa y sacarosa b.3) Agua peptonada (para indol) b.4) Caldo glucosado Klark y Lubs (para RM) b.5) Caldo glucosado Klark y Lubs (para VP) b.6) Agar citrato b.7) Agar acetato b.8) Agar Urea b.9) Agar motilidad NOTA: revisar en el trabajo práctico No. 4, el fundamento de cada unas de las pruebas metabólicas a realizar. Tabla II Diferenciación de los géneros de la familia Enterobacteriacea de acuerdo a las pruebas metabólicas realizadas en la práctica Género O/F Glucosa Lactosa Sacarosa Indol RM VP Citrato H 2 S Urea Motilidad Escherichia F + + d Klebsiella F D - Enterobacter F Salmonella F Shigella F D - - D Proteus F D - + D + - D D D + d: 11 a 89% positivos/ diferentes reacciones en distintas cepas de una especie. D: diferentes reacciones en distintas especies de un género.