Área Virología Área Virología

Transcripción

1 Área Virología Departamento de Microbiología Facultad de Medicina UBA

2 Objetivos Generales: Conocer la metodología aplicada en el diagnóstico de laboratorio de infecciones virales humanas y la interpretación médica de sus resultados, asociando la obtención de las muestras clínicas y los exámenes virológicos solicitados con la patogenia de cada infección. Objetivo específicos: Reconocer los distintos efectos citopáticos virales en monocapas celulares infectadas y en muestras clínicas Conocer la metodología utilizada para la correcta obtención de las muestra, identificación, transporte y procesamiento según cual fuere la técnica diagnóstica a utilizar. Introducir al alumno en conocimientos sobre técnicas de cultivo, de pesquisa de anticuerpos o antígenos y de biología molecular utilizadas en el diagnóstico virológico. Reconocer la utilidad de los técnicas moleculares en el diagnóstico y monitoreo de las infecciones virales. PARTE 1 INTRODUCCIÓN A LOS METODOS DE DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO OBSERVACIÓN DE DISTINTOS ECP El alumno deberá asistir al trabajo práctico con los siguientes conocimientos: Patogenia de las infecciones virales: a nivel celular y orgánico. Conceptos claves: patogenicidad vs virulencia, tropismo, susceptibilidad vs permisividad. Mecanismos de daño tisular en la infección viral. Cultivo celular primario, línea diploide, línea continua. Cultivo en monocapa y en suspensión. Conceptos a discutir: Caracterización del efecto citopático (redondeamiento, lisis, sincicios, etc.). La importancia de la utilización de los métodos de diagnóstico directo e indirecto según la patogenia viral Objetivos del trabajo práctico: Que el alumno aprenda a diferenciar entre un cultivo control y el mismo infectado. Que pueda visualizar distintos ECP causados por distintos virus en el mismo cultivo. Que distinga el efecto de la infección en el tiempo sobre el mismo cultivo Que pueda visualizar el ECP en una muestra de lesiones genitales. Observar: 1) Efectos citopáticos virales sobre monocapas celulares infectadas comparándolas frente a un control sin infectar. Se utilizarán preparados de monocapas infectadas para su observación por microscopía óptica y/ó láminas. 2) Efecto citopático en preparados de lesiones genitales. Se solicita traer papel y lápiz para dibujar lo que observan y discutirlo 2

3 1) Efectos citopáticos virales sobre monocapas celulares infectadas Área Virología Cultivos normales: Líneas celulares continúas crecidas en monocapa y teñidas con Giemsa. a) A549: Originada a partir de tejido carcinomatoso de pulmón proveniente de un hombre adulto. Tipo epitelial. Placas fijadas a las 48 y 72 horas post-pasaje. b) GHOST: Linea derivada de un osteosarcoma humano modificada genéticamente de manera tal que expresan constitutivamente las moléculas CD4 y CXCR4. Placas fijadas a las 48 horas post-pasaje Línea celular diploide crecida en monocapa y teñida con Giemsa. c) PH: Fibroblastos obtenidos a partir de prepucio humano. Cultivos Infectados: Cultivo Infectado con Horas postinfección A549 Adenovirus HSV GHOST HIV 48 PH RSV 96 2) Efecto citopático en preparados de lesiones genitales. Los preparados de Tzanck se obtuvieron de la siguiente manera: Toma de la muestra con bisturí por raspado de la base de las lesiones Extendido del material obtenido en portaobjetos. Fijación con metanol durante segundos. Coloración con Giemsa al 20% por 45 minutos. Lavado. ACTIVIDAD: Dibuje lo observado al microscopio y responda: Se observan diferencias entre cultivos infectados y normales? Cuáles? Se observan diferencias entre los distintos tiempos post-infección? Se observan diferencias en los ECP de distintos virus en un mismo cultivo? Qué efecto citopático observa en los preparados de lesiones genitales? El ECP es diágnóstico de certeza? En cada caso justifique su respuesta 3

4 Células GHOST Línea celular continua derivada de un osteosarcoma humano. Modificadas genéticamente para que expresen de manera constitutiva las moléculas CD4 y CXCR4 4

5 Células GHOST infectadas con HIV (42 hs post-infección) 5

6 Células PH Línea celular diploide. Fibroblastos obtenidos a partir de prepucio humano 6

7 Células PH infectadas con RSV (96 hs post-infección) 7

8 Células A549 Línea celular continua tipo epitelial Originada a partir de tejido carcinomatoso de pulmón proveniente de un hombre adulto. 8

9 Células A549 infectadas con HSV (24 hs post-infección) 9

10 Células A549 infectadas con HSV (48 hs post-infección) 10

11 Células A549 infectadas con ADV (72 hs post-infección) 11

12 Células A549 infectadas con ADV (96 hs post-infección) 12

13 Test de Tzanck 13

14 PARTE 2: TOMA DE MUESTRAS, TRASLADO AL LABORATORIO Y PROCESAMIENTO. El alumno deberá asistir al trabajo práctico con los siguientes conocimientos: Patogenia de las infecciones virales a nivel orgánico. Puertas de entrada, mecanismos de diseminación y eliminación. Tipos de infección según su temporalidad. Conceptos a discutir: Metodología utilizada para la correcta obtención de las muestra, identificación, transporte y procesamiento según cual fuere la técnica diagnóstica a utilizar. Qué, dónde, cuándo y cómo busco la posible presencia de una infección viral? Objetivos del trabajo práctico: Que frente a distintas infecciones virales el alumno pueda determinar según el momento de la infección- que muestra tomar y que metodología diagnóstica utilizar. Que asocie la patogenia de cada infección con el tipo de muestra clínica a obtener. Que identifique cual es la metodología correcta de conservación y transporte para cada tipo de muestra. Observar: Se mostrarán fotografías de lesiones, curvas serológicas, etc., de distintas infecciones virales. ACTIVIDAD: Para cada lámina mostrada conteste las siguientes preguntas: Qué? (diagnóstico directo y/o indirecto) Dónde? (muestra) Cuándo? (temporalidad de la infección) Cómo busco? (técnica/s utilizada/s) Cómo identifica y transporta la muestra al laboratorio? En cada caso justifique su respuesta 14

15 HSV VARICELA-ZÓSTER 15

16 HPV Área Virología

17 SARAMPIÓN 17

18 INFLUENZA 18

19 ROTAVIRUS Área Virología

20 PARTE 3: DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO INDIRECTO y DIRECTO Introducir al alumno en los métodos de diagnóstico virológico indirectos y directos. Conceptos a discutir: Sensibilidad y especificidad de las distintas técnicas utilizadas en el diagnóstico indirecto y directo. Repasar el algoritmo diagnóstico para HIV. Curvas serológicas para HBV. Procesamiento de muestras (líquido, tejido, etc.) para la detección de antígenos y de ácidos nucleicos virales. Tipificación genómica: utilidad y ejemplos. Carga viral: uso en pronóstico y monitoreo de infecciones virales. Objetivos del trabajo práctico: Que el alumno comprenda el fundamento de las distintas técnicas en el diagnóstico indirecto y directo. Que pueda interpretar los resultados obtenidos mediante Westen Blot para HIV. Que pueda determinar el estadio de infección por el virus de Hepatitis B en función de las curvas serológicas mostradas. Que pueda interpretar los resultados obtenidos mediante una PCR para diagnóstico pediátrico de HIV Que pueda interpretar los resultados obtenidos mediante una RFLP para genotipificar HBV. Observar: 1. Mostración de fotos de tiras de Westen Blot para HIV y perfil de curvas serológicas para HBV. 2. Mostración de cubas electroforéticas para geles de agarosa y para separación electroforética de proteínas por SDS-PAGE. Demostración de procedimientos. 3. Mostración de geles de agarosa de corridas electroforéticas de PCRs y/o RFLPs teñidos con bromuro de etidio y transiluminados con luz UV. 4. Mostración de fotos de corridas electroforéticas de productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y de productos de digestión enzimática para observar el Polimorfismo en el Largo de los Fragmentos de Restricción (RFLP). ACTIVIDAD: Observar las láminas donde se muestran fotos de tiras de WB y geles de agarosa y presente un resultado diagnóstico para: Westen Blot para HIV PCR para diagnóstico pediátrico de HIV RFLP para genotipificar HBV. 20

21 Pos Western blot para HIV Neg gp 160 gp 120 P 55 gp 41 P 31 P 24 Criterio de interpretación con fines diagnósticos investiga presencia de Ac específicos Positivo: 2/3 bandas mayores (gp160/120, gp41, p24) Indeterminado: No cumple criterio de positividad Negativo: Ausencia de bandas RESULTADO: A) B) C) 21

22 RESULTADO: 1) 2) 3) 4) 5) 22

23 RESULTADO: 1) 2) 3) 23

24 ACTIVIDAD: Observar las láminas y discuta los perfiles serológicos para: Infección aguda por HBV Infección crónica por HBV 24