Cuantificación de Legionella mediante real time PCR. Resultados de un estudio experimental.

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1 Cuantificación de Legionella mediante real time PCR. Resultados de un estudio experimental. Gemma Saucedo. Laboratorio Aguas de Barcelona de noviembre de 2006

2 Introducción PCR: Polymerase Chain Reaction Técnica de Biología Molecular inventada en 1985 por Kary B. Mullis (Premio Nobel de Química, 1993) Objetivo de la PCR: amplificación del material genético para hacer posible su detección. Aplicaciones múltiples. Cada organismo tiene una secuencia genética única, pero comparte genes con los organismos de su especie, género, etc.. ADN de Legionella Selección de una región de su ADN Región de un gen específico de Legionella Realización de múltiples copias

3 Introducción Muestra DNA/RNA cdna Producto Preparación Extracción Retro Amplificación Detección muestra ácidos nucleicos transcripción Máxima variabilidad de los resultados Equipos, técnicas y reactivos estandarizados

4 Cómo funciona la PCR? Técnica de amplificación selectiva de una región de DNA escogida. Reacción cíclica de síntesis. Reactivos necesarios: DNA + Enzima TaqPol + nucleótidos + primers específicos Pasos: 1) Desnaturalización de la doble cadena de DNA 2) Hibridación de los primers (annealing) 3) Amplificación (elongation) Es cualitativa PCR product compared with DNA ladder in agarose gel. DNA ladder (lane 1), the PCR product in low concentration (lane 2), and high concentration (lane 3). Image published with permission of Helmut W. Klein, Institute of Biochemistry, University of Cologne, Germany From Nupedia

5 Cómo funciona la PCR cuantitativa? Mide la relación entre la cantidad de ácidos nucleicos diana iniciales y la cantidad de producto amplificado durante la fase exponencial Un reactivo más: las sondas (probes) Es real time. Permite calcular la Tm (temperatura de melting) L CICLO EN EL QUE SE INICIA EL NCREMENTO DE FLUORESCENCIA OR ENCIMA DEL UMBRAL ES ROPORCIONAL A LA ONCENTRACIÓN INICIAL DE DNA By Qiagen

6 Cómo funciona la reverse transcriptase PCR? El RNA es extremadamente sensible a la degradación por RNAsas Transcriptasa inversa Aplicaciones Obtención de cdna a partir del cual se puede hacer real time PCR (cuantitativa) Recuento de viables (mrna) Recuento de la mayoría de virus

7 VENTAJAS Por qué la PCR? Rapidez: plazo de obtención de resultados muy reducido Especificidad, fiabilidad, sensibilidad, reproducibilidad y robustez Complementaria a las técnicas tradicionales Posibilidad de analizar diferentes microorganismos de varias muestras en un mismo análisis Análisis de microorganismos para los cuales no existen metodologías tradicionales de detección Unificación de las técnicas de detección y cuantificación de diferentes microorganismos Posibilidad de estandarización y de automatización de análisis Apertura de nuevas líneas de investigación Económicamente viable con una relativa inversión inicial INCONVENIENTES Métodos no incluidos como métodos oficiales en la legislación vigente Posibles falsos positivos Inhibiciones de la reacción Es necesario acondicionar el laboratorio de biología molecular

8 Comparación entre métodos de detección 1 criobola 250 ml medio de cultivo líquido (variante CYE): 10 g/l extracto levadura + cisteína + hierro + antibióticos Variables: Crecimiento en agitación A temperatura ambiente Cepa de L. pneumophila ambiental o de colección BHI infusión 0,5 ml Inocular: 10 µl (duplicado) Análisis: Recuento de cultivables: siembra directa de 100 µl por duplicado Recuento de viables por Chemscan. PCR cuantitativa (DO) Tiempo: 0 h 24 h 48 h 72 h 7 días 10 días 15 días

9 Resultados obtenidos con diferentes métodos de detección Datos logarítmicos de los diferentes métodos Día Promedio Cultivables (UFC/ml) 1,83 1,75 1,32 1,15 0* 1,21 ± 0,73 Viables (viables/ml) 4,56 4,52 4,45 4,32 4,06 4,38 ± 0,20 PCR 16S multicopia (copias / ml) 5,29 5,19 5,19 5,29 5,09 5,21 ± 0,08 PCR mip monocopia (copias genoma / ml) 4,54 4,52 4,46 4,50 4,33 4,47 ± 0,08 *: log (n+1)

10 Comparación numérica entre métodos de detección (diferencias logarítmicas) Día Promedio Viables vs cultivo 2,73 2,77 3,13 3,17 4,06 3,17 ± 0,54 PCR 16S vs cultivo 3,45 3,44 3,87 4,14 5 4,00 ± 0,68 16S vs Viables 0,73 0,67 0,74 0,97 1,02 0,83 ± 0,16 mip vs Viables -0,02 0 0,01 0,18 0 0,09 ± 0,13 16S vs mip 0,75 0,67 0,73 0,79 0,76 0,74 ± 0,04

11 Comparación gráfica entre métodos de detección 6 5 Log resultado Cultivo Viables PCR16S PCR MIP Días

12 Detección de Legionella por real time PCR Norma AFNOR XP T Qualité de l eau Détection et quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila amplification génique par réaction en chaîne de polymérisation (PCR) Informe técnico sobre Normalización de métodos moleculares de análisis microbiológico de alimentos y aguas. Comisión de Normalización de la Sociedad Española de Microbiología (SEM).

13 Resultados q-pcr en muestras reales Aguas tratadas y Torres Refrigeración Tabla con los resultados de q-pcr de L. pneumophila (16S, gen MIP) y Legionella spp. en aguas tratadas y torres de refrigeración Tipo muestra Aguas Tratadas % Torres refrigeración % n Positivas para L. pneumophila 16S 8 11,4% 11 52,4% Positivas para L. pneumophila mip 6 8,6% 10 47,6% Positivas para el género Legionella 37 52,9% %

14 Comparación qpcr vs. cultivo Aguas tratadas Tabla con los resultados de q-pcr y de cultivo de L. pneumophila y Legionella spp. (16S) en aguas tratadas Análisis n % Promedio Legionella pneumophila Cultivo PCR (copias/litro) % 1% 89% 11% <lq Pres/20ml <lq 472 Legionella spp Cultivo (UFC/litro) % 1% <lq 142 Cultivo (UFC/litro) % 3% <lq 142 Género Legionella PCR (copias/litro) % 53% 22% <lq % 177

15 Resultados cultivo y q-pcr en muestras reales Aguas tratadas Tabla comparativa resultados de cultivo y de q-pcr de L. pneumophila (16S, gen mip) y Legionella spp. en aguas tratadas Muestras aguas tratadas Cuantificación por cultivo (UFC/l) L. pneumo L. pneumo Leg. spp 0 Positivo Cuantificación por PCR (copias/litro) 16s ARN L.pneumophila ,4E+03 1,3E+03 Negativo Negativo Negativo MIP gene L. pneumo Negativo Negativo s ARN gén. Legion ,50E+03 1,27E+03 1,81E+03 4,18E+04 1,38E+03

16 Resultados cultivo y q-pcr en muestras reales Aguas de torres de refrigeración Tabla comparativa resultados de cultivo y de q-pcr de L. pneumophila (16S, gen MIP) y Legionella spp. en torres refrigeración Muestras torres refrigeración Cuantificación por cultivo (UFC/l) L. pneumo 1 L. pneumo 2-14 Leg. spp Cuantificación por PCR (copias/litro) 16s ARN L. pneumophila MIP gene L. pneumo 16s ARN gén. Legion ,1E+05 1,3E+04 2,42E ,5E+05 9,8E+03 1,56E ,0E ,84E+03 4 < ,6E+06 9,9E+04 6,77E+06 5 <20 1,8E+03 Negativo 3,67E ,7E+04 3,1E+03 3,87E ,8E ,47E ,9E+04 8,27E+02 2,52E ,0E+07 7,53E+06 1,75E ,0E+02 3,33E+01 1,51E ,3E+05 5,90E+04 8,60E+04

17 CONCLUSIONES La concentración de la muestra y la extracción del DNA son pasos básicos en la eficiencia del proceso global Las técnicas moleculares y concretamente la qpcr ya son una herramienta básica para los laboratorios de análisis La cuantificación de una cepa de colección de Legionella en medio líquido por qpcr (gen 16S) es del orden de 4 logaritmos superior que la cuantificación por cultivo Tanto con muestras reales como en cepas de colección la PCR cuantitativa es mucho más sensible que el cultivo La cuantificación de Legionella por qpcr utilizando el gen 16S es más sensible que el gen mip (0,74 logaritmos superior) Un 88,6% de las muestras de aguas tratadas analizadas son negativas para Legionella pneumophila por qpcr. Sólo un 47,1% lo son para el género Legionella

18 AGRADECIMIENTOS LABORATORIO MICROBIOLOGÍA AGUAS DE BARCELONA Ingrid Salazar Belén Galofré Anna Terradillos Ferran Ribas EMATSA A USTEDES POR SU ATENCIÓN

19 Enzima Taq polimerasa Thermus aquaticus, denominado también Thermophilus aquaticus, es una bacteria termófila que vive en la proximidad de las fuentes de agua caliente (de 50 a 80 C). Thermus aquaticus fue descrito por Thomas Brock en 1969 en una fuente del parque de Yellowstone. Es una bacteria gram-negativa, aerobia y heterótrofa. Esta bacteria vive a temperaturas comprendidas entre 50 y 80 C, debido a que su cóctel enzimático resiste tales condiciones. Normalmente a esas temperaturas, las proteínas constitutivas de la mayoría de los seres vivos se desnaturalizan y no vuelven a ser funcionales. Es por ello por lo que, una de sus enzimas, la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, la Taq polimerasa, es ampliamente utilizada por sus propiedades de termo resistencia en las reacciones de PCR. En efecto, esta enzima tiene una temperatura óptima de funcionamiento alrededor de los 75 C.

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