2015/PCU/3452 TÉCNICAS INSTRUMENTALES Y RECURSOS ANÁLITICOS. NIVEL BÁSICO

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1 2015/PCU/3452 TÉCNICAS INSTRUMENTALES Y RECURSOS ANÁLITICOS. NIVEL BÁSICO 1

2 Josefa María Navarro Acosta Mª del Pilar Flores Fernández-Villamil María Josefa Jordán Bueso María Pilar Hellín García Los contenidos de este manual están bajo una licencia Creative Commons de tipo Reconocimiento No Comercial Sin Obra Derivada. Se permite su copia y distribución por cualquier medio siempre que mantenga el reconocimiento de sus autores, no haga uso comercial de las obras y no realice ninguna modificación de ellas 2

3 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN. TÉCNICAS ANALÍTICAS 1.1. Clasificación de los métodos analíticos Técnicas Instrumentales Componentes básicos de un instrumento analítico Consideraciones para la selección de un método analítico Estandarización de un método analítico Validación de un método analítico. 2. ESPECTROFOTOMETRÍA VIS-UV 2.1. Luz y longitud de onda Qué es la espectrofotometría? 2.3. Espectrofotómetro VIS-UV Ventajas e inconvenientes de la espectrofotometría VIS-UV Tipos de medida Errores en el análisis espectrofotométrico Procedimiento a seguir Práctica. Medida de la capacidad antioxidante de muestras vegetales (ensayo ABTS) Objetivo Fundamento de la metodología Pasos a seguir Preparación de patrones y reactivos Cálculos. 3. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA HPLC Fundamentos del análisis cromatográfico Definición Nomenclatura básica utilizada en cromatografía Clasificación de los métodos cromatográficos Según el soporte Según la naturaleza de la fase móvil y estacionaria Según el tipo de equilibrio que se establece en la separación Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (High Pressure Liquid Chromatography- HPLC) Características de un sistema de HPLC Elementos de un sistema de HPLC Elección y preparación de solventes para cromatografía líquida Sistema de bombeo Sistemas de inyección Columnas Sistemas de detección Parámetros cromatográficos Determinación de la concentración de un compuesto Normalización de área. 3

4 Calibración con patrones o estándar Patrón interno Problemas más comunes encontrados en HPLC. 4. INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS Cromatografía de gases. Generalidades 4.2. Instrumentación Gas portador Puertos de inyección Columnas cromatográficas Detector 4.3. Optimización de la separación y la detección 4.4. Aplicaciones de la cromatografía gas líquido 4.5. Acoplamiento de la cromatografía de gases a la espectrometría de masas 4.6. Componentes de un espectrómetro de masas Sistemas de introducción de muestras Fuente de iones Analizador de masas Detector 4.7. Aplicaciones de la espectrometría de masas 4.8. Interpretación de un espectro 5. ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN DE PLASMA ACOPLADA INDUCTIVAMENTE (ICP) Técnicas espectrométricas Espectrometría atómica de emisión con plasma acoplado inductivamente (ICP-AES) Fundamentos de la técnica Descripción del equipo Plasma Fuente de alimentación Sistema de introducción de la muestra Sistema óptico Sistema de tratamiento de la señal Características del plasma de acoplamiento inductivo (ICP) Aplicaciones del ICP-AES Aspectos a estudiar en análisis mediante ICP-AES Preparación de la muestra Rectas de calibrado e interferencias. 4

5 1. INTRODUCCIÓN. TÉCNICAS ANALÍTICAS 1.1. Clasificación de los métodos analíticos. De forma general, los métodos analíticos se clasifican como métodos clásicos o instrumentales. Los primeros corresponden al grupo de métodos químicos más antiguos, donde el analito era separado de la muestra mediante precipitación, extracción o destilación. Posteriormente, el analito era determinado mediante métodos gravimétricos (ej. determinación sulfatos mediante precipitación con cloruro de bario) o volumétricos (ej. determinación de la alcalinidad del agua). En los métodos instrumentales, a menudo se suelen utilizar técnicas de separación mas eficaces como son las técnicas cromatográficas y la determinación de los compuestos de interés se basa en la medición de una determinada propiedad física del analito, como son conductividad, absorción o emisión de luz, fluorescencia, potencial de electrodo y relación masa carga. Las propiedades que se utilizan para conocer la composición química de una muestra se denominan señales analíticas. Los métodos instrumentales presentan numerosas ventajas frente a los clásicos como presentar mayor selectividad, proporcionar límites de detección más bajos o permitir el análisis de un mayor número de muestras gracias a la instrumentación automatizada Técnicas Instrumentales. En función de la señal analítica que utilicen, las técnicas instrumentales quedan englobadas en dentro de dos áreas principales: técnicas espectroscópicas y técnicas electroquímicas. Sin embargo, algunas técnicas muy utilizadas como la espectrometría de masas y el análisis térmico, no se ajustan exactamente a estas áreas. Otro tipo de técnica analítica es la cromatografía que habitualmente se utiliza de forma acoplada a otras técnicas instrumentales extendiendo así su utilidad (ej. GS-MS, L-MS, MS-MS, etc.). 5

6 TÉCNICAS INSTRUMENTALES ESPECTROSCÓPICAS Espectrofotometría de visible y ultravioleta Espectrofotometría de fluorescencia y fosforescencia Espectrometría atómica (emisión y absorción) Espectrofotometría de infrarrojo Espectroscopía Raman Espectroscopía de rayos X Técnicas radioquímicas Espectroscopía de RMN Espectroscopía de resonancia de espin electrónico ELECTROQUÍMICAS Potenciometría Voltamperometría Técnicas voltamperométricas Técnicas de redisolución Técnicas amperométricas Coulombimetría Electrogravimetría Técnicas de conductancia Análisis térmico Espectrometría de masas CROMATOGRAFÍA GC MS ICP MS GC IR MS MS Comparando los métodos instrumentales y no instrumentales, ambos tipos de métodos tienen sus ventajas e inconvenientes. En general, los métodos instrumentales son más rápidos y más sensibles. Sin embargo, aunque mucho más lentos, los métodos clásicos pueden llegar a ser mas exactos y ofrecer límites de detección mejores que los de métodos instrumentales Componentes básicos de un instrumento analítico. Un instrumento analítico convierte una señal analítica no detectable o cuantificable por el ser humano en otra forma que si lo es. De forma general, todos los instrumentos analíticos están, constituidos por cuatro componentes fundamentales: Generador de señales: Producen señales analíticas a partir de los componentes de la muestra, por la aplicación de una señal externa a la muestra (ej. espectrofotometría VIS/UV) o bien por la creación de un ambiente sobre la muestra, que permite al analito producir una señal (ej. potenciometria). 6

7 Transductor de entrada: Convierte una señal determinada en otro tipo de señal. Ej. en un espectrofotómetro la señal analítica (haz de luz atenuado) se convierte en el transductor de entrada (fotocelda) en una señal eléctrica. Procesador de señales: Modifica la señal transducida para hacerla más adecuada para el dispositivo de lectura. La modificación más frecuente es la amplificación. Transductor de salida: Se trata de un dispositivo de lectura que transforma la señal modificada por el procesador de señales en otra señal que el analista puede entender. Señal analítica Señal de entrada mecánica o eléctrica Señal de salida Escala Generador de señales Transductor de señales (detector) Procesador de señales Transductor de salida o lectura Registrador Unidad digital 1.4. Consideraciones para la selección de un método analítico. El empleo de una instrumentación analítica compleja implica a menudo la necesidad de aumentar la destreza del analista en el laboratorio. Antes de seleccionar la instrumentación requerida para el análisis de un compuesto determinado, se deben considerar otros aspectos previos que son también una parte fundamental del método analítico: 7

8 Definir el problema analítico Especies que deben analizarse: propiedades físicas y químicas del analito. Naturaleza de la muestra: propiedades de la matriz de la muestra, la presencia de interferencias probables, el intervalo de concentraciones esperado para el analito. Uso final de los resultados: exactitud, precisión y límites de detección requeridos, coste del análisis, tiempo requerido para efectuar el análisis, número de muestras. Muestreo Medidas necesarias para proporcionar la información deseada. Representatividad de la muestra. Procedimientos de toma de muestras que aseguren la integridad de los resultados analíticos. Etiquetado y registro correcto. Preparación de la muestra Procedimientos de procesado de muestras que aseguren la integridad de los resultados analíticos. Procedimientos adecuados para almacenar y preservar las muestras y los estándares. Operaciones previas al análisis final (separación, dilución/concentración, derivatización, etc.). Control del ambiente (luz, Tª) y del medio (ph, complejación de componentes, Tª, etc.). Otros Limpieza adecuada del material. Uso y el conocimiento de las tolerancias de las balanzas analíticas, del material volumétrico y de los aparatos de filtrado. 8

9 1.5. Estandarización de un método analítico. Una vez que se ha seleccionado el método más adecuado según nuestras necesidades, debemos asegurar la precisión deseada para el análisis. Para ello, se ha de seleccionar el método de estandarización más adecuado que permitan determinar experimentalmente la relación entre la señal y la cantidad de analito. Existen dos tipos de métodos de estandarización: 1. Estándares externos, en los que se utilizan uno o varios patrones externos que contienen concentraciones conocidas de analito y que se analizan separadamente de las muestras. 2. Estándares añadidos, que a su vez se dividen en dos categorías: Estándar interno, en la que un estándar, suficientemente diferente al analito para que no interfiera con este y suficientemente similar al analito para que tenga el mismo comportamiento, se adiciona a la muestra y a una disolución en blanco. El estándar interno puede añadirse antes de la preparación de la muestra o antes de la medida. Adición estándar, en la que, después de una medida inicial, se añaden cantidades fijas de analito a cada muestra y por extrapolación se averigua la concentración de analito 1.6. Validación de un método analítico. La validación es el proceso por el cual se demuestra que los procedimientos analíticos son aptos para el uso indicado. Los métodos que deben ser validados son: Métodos no estandarizados Métodos que han sido desarrollados en el laboratorio Métodos estandarizados para otro rango de concentración diferente Extensiones de métodos estandarizados a otros analitos 9

10 Las características analíticas que se deben estudiar para la validación de un método son las siguientes: Rango útil: rango de concentración comprendido entre el límite de cuantificación y el límite de linealidad (máximo valor de la concentración a partir de la cual no tiene significado cuantitativo). Límite de detección: mínima concentración detectable del analito a partir de la cual puede cuantificarse. Límite de cuantificación: valor de la concentración a partir de la cual tiene significado cuantitativo. Exactitud: es el grado de proximidad entre una medida y el valor verdadero o esperado. Sensibilidad: corresponde a la mínima cantidad de analito que puede producir un resultado significativo. Selectividad: Es la capacidad para originar resultados que dependen de forma exclusiva del analito para su identificación o cuantificación en la muestra. Precisión: refleja la medida en la que los valores de una serie repetida de ensayos analíticos que se realizan sobre una muestra homogénea son semejantes entre sí: Repetibilidad: refleja la precisión de un método cuando se desarrolla bajo las mismas condiciones, utilizando la misma muestra, analizada por el mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos y durante una misma sesión de trabajo en un período corto. Reproducibilidad. medida de la precisión de los resultados de ensayos realizados sobre la misma muestra homogénea, pero ejecutados por diferentes analistas en días diferentes. 10

11 2. ESPECTROFOTOMETRÍA VIS-UV 2.1. Luz y longitud de onda. La luz es un conjunto de radiaciones que se mueven por todo el espacio. Estas radiaciones se pueden describir como partículas y como ondas pero, a nivel analítico, sus propiedades como onda son más utilizadas. Los conceptos que describen a una onda son: longitud de onda (λ), definida como la distancia entre dos picos de una onda; el tiempo que tarda un punto en describir una oscilación completa es el periodo (T) y la inversa del periodo es la frecuencia (f o ν) que representa el número de oscilaciones por segundo; por último, la amplitud (A) es la distancia desde el punto más alto de la onda (desde el pico) hasta la base de la onda (el eje horizontal de equilibrio). cresta valle Al conjunto de radiaciones electromagnéticas se le llama espectro electromagnético. La luz visible es solamente una pequeña parte del espectro electromagnético: 11

12 2.2. Qué es la espectrofotometría VIS-UV? La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y la cantidad de radiación absorbida depende de forma lineal de la concentración de la sustancial absorbente y la longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a través de la disolución. La ley de Lambert-Beer, relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado mediante la ecuación: A = ε l c donde: A es la absorbancia o densidad óptica y es adimensional. En el rango entre 0 y 2 unidades de absorbancia se cumple la ley de Lambert-Bert. 12

13 l es la distancia recorrida a través de la disolución (espesor de la capa absorbente) y se mide en cm. c es la concentración del analito en la disolución ε es la absortividad molar que tiene un valor constante para cada sustancia a una determinada longitud de onda (λ). Si la concentración (c) se expresa en mol L -1, se denomina coeficiente de extinción molar (mol L -1 cm -1 ) y coeficiente de extinción específico (g L -1 cm -1 ) si la concentración se expresa en g L -1. La medida real que realizan los instrumentos para mediar la absorción de luz por la muestra es la transmitancia (T) que se define como la relación entre la intensidad de luz inicial que incide en la muestra (I o ) y la intensidad de luz transmitida (I f ): SUSTANCIA ABSORBENTE RADIACIÓN TRANSMITIDA I o I f % T = (I f / Io) x 100 Cuya relación con la absorbancia (A) es: A = -log T La medida de transmitancia es transformada a absorbancia. El empleo de la absorbancia presenta una ventaja fundamental: la relación entre la absorbancia y la concentración es lineal. 13

14 Transmitancia Absorbancia Concentración Concentración 2.3. Espectrofotómetro VIS/UV. El espectrofotómetro es un instrumento que permite la determinación cuantitativa de compuestos absorbentes de radiación electromagnética, para longitudes de onda comprendidas aproximadamente entre 200 y 1100 nm, comparando la radiación absorbida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto con una que contiene una cantidad conocida. Sus componentes principales son: FUENTE: dispositivo emisor de radiación electromagnética. Pueden ser: Lámpara de filamento Tungsteno o Wolframio (VIS). Lámpara de Hidrógeno-Deuterio (UV) Lámpara de Xenón (VIS y UV) 14

15 MONOCROMADOR: o selector de longitud de onda. A menor ancho de banda se consigue mayor pureza de radiación emitida. Consta de lentes, espejos y rendijas para dispersar, separar, restringir y enfocar la radiación deseada. CELDA: para colocar la muestra a medir, son transparentes en la región de λ. Pueden ser de vidrio (VIS) o de cuarzo (VIS y UV), suelen ser de 1 cm de lado. DETECTOR: produce una señal eléctrica cuando recibe un fotón que posteriormente es convertida en unidades de potencia transmitida o absorbida. Para la zona VIS-UV se utilizan: Fototubo o tubo fotomultiplicador (fototubos en serie). Fotodiodos array, señal simultánea para un amplio rango de λ. SISTEMA DE LECTURA: o registrador, los instrumentos actuales disponen de un display digital o conectados a un ordenador con software específico. Tipos de espectrofotómetros: De haz simple, el haz de luz sigue una única trayectoria entre la fuente y el detector. De doble haz, el haz de luz es dividida en dos haces después de salir del monocromador mediante un sistema de espejos divisores, uno que se dirige a la celda de referencia (con el blanco), y el otro que se dirige hacia la celda de muestra. La ventaja del espectrofotómetro de doble haz es que cualquier variación, ajena a la muestra, que sufra la luz (intensidad de la fuente, la reflectividad de los espejos, la eficiencia del detector, etc.), afecta simultáneamente a los dos haces y por lo tanto la relación de energía entre los dos haces permanece siempre constante. 15

16 2.4. Ventajas e inconvenientes de la espectrofotometría VIS-UV. Ventajas: Gran aplicación (muy versátil, aplicable a sustancias inorgánicas e inorgánicas que absorben en la región VIS y UV o que pueden ser convertidas mediante tratamiento químico en sustancias absorbentes). Bajo coste. Sensibilidad relativa elevada. Facilidad para realizar mediciones rápidas y en continuo. Inconvenientes: Selectividad moderada Tipos de medida. De tipo cualitativo: escasa utilidad, para una sustancia determinada existe un número escaso de máximos y mínimos y por lo tanto es imposible la identificación inequívoca (baja selectividad). De tipo cuantitativo: muy utilizadas Aplicaciones a especies absorbentes: Mediciones de la absorbancia de especies absorbentes y aplicación de la ley de Lambert-Beer, mediante recta de calibrado (ej. determinación β-caroteno) o coeficiente de absortividad molar (ej. determinación de la concentración de clorofilas mediante las ecuaciones ecuación propuesta por Arnon, 1949). Aplicaciones a especies no absorbentes: Especies no absorbentes que mediante su exposición a reactivos específicos se transforman en especies que absorben fuertemente en las regiones VIS o UV (ej. determinación de hierro mediante la quelación con o-fenantrolina). 16

17 Las determinaciones a su vez pueden ser en discontinuo (técnica batch) donde se mide la absorbancia a tiempo final (ej. determinación directa de especies absorbentes o de especies no absorbentes transformadas a tiempo final), o en continuo, ofrece más información pero es más tedioso (ej. valoraciones fotométrica, cinéticas enzimáticas) Errores en el análisis espectrofotométrico. Los errores que se pueden producir durante el análisis espectrofotométrico pueden ser debidos a errores instrumentales: Desviaciones de la Ley de Lambert-Beer: Alta concentración de analito Alta Absorbancia Baja potencia radiante Detector en zona límite de detección Baja concentración de analito Baja Absorbancia Alta potencia radiante Detector en zona límite de saturación Imposibilidad de seleccionar una radiación de única longitud de onda, lo que produce interacciones con otras absorciones (radiación policromática) y radiación parásita. o a errores químicos: Ionización o asociación parcial del analito, con diferente absorbancia que la especie molecular (fijar ph con disolución tampón). Interacción entre iones o moléculas que afecten al índice de refracción del analito en disoluciones muy concentradas. Efecto matriz (dilución de la muestra, calibración mediante adiciones múltiples). Disminución de absorbancia por radiación emitida (fluorescencia) o aumento de la absorbancia por partículas en suspensión (turbidez). Limitación de reactivo en caso de reacción previa. 17

18 2.7. Procedimiento a seguir. 1. Selección de la longitud de onda Se realiza un espectro de absorción (gráfico en el que se representa A vs λ). Para ello se ajusta el 0 de absorbancia mediante blanco de reactivos, se reemplaza el blanco por la muestra y se realiza un barrido de absorbancia a diferentes λ. Se selecciona aquella λ donde la absorbancia es máxima y/o se minimizan las interferencias. 2. Establecer el rango de linealidad Es el intervalo de concentraciones dentro del cual se puede medir la concentración del analito en una muestra o patrón con elevado nivel de certidumbre. Para establecerlo hay que realizar una recta de calibrado. 3. Comprobar la existencia o no de efecto matriz Se debe a la presencia de sustancias ajenas al analito que aumentan o disminuyen la señal de este. Para comprobar la existencia de un posible efecto matriz se calcula la concentración de una muestra y la de esa misma muestra a la que se le ha añadido una cantidad conocida de analito. Se puede solucionar mediante la dilución de la muestra o mediante adiciones múltiples del analito a la muestra. 4. Establecer el límite de cuantificación Mínima concentración que se puede medir con la técnica. Se puede calcular multiplicando por diez la señal correspondiente al ruido de fondo. 5. Otras recomendaciones Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con precipitados. El volumen de la muestra en la cubeta no debe ser excesivo para evitar que se desborde (máximo, hasta ¾ partes de la cubeta) pero suficiente para que se realice bien la medida. 18

19 La cubeta debe estar exenta de suciedad y marcas y se sujeta por los lados opacos. No se deben derramar líquidos, sobre todo solventes, ácidos o bases; dentro del contenedor de la cubeta. Se debe mantener, el espectrofotómetro limpio y libre de humedad Práctica. Medida de la capacidad antioxidante de muestras vegetales (ensayo ABTS) Objetivo El objetivo de esta práctica es medir la capacidad de un extracto vegetal mediante el ensayo ABTS Fundamento de la metodología La actividad antioxidante es una medida global in vitro de la capacidad de un extracto para atrapar radicales libres. La actividad antioxidante no puede ser medida directamente, pero puede determinarse por los efectos del compuesto antioxidante en un proceso de oxidación controlado. La mayoría de los ensayos para determinar de capacidad antioxidante pueden ser divididos en dos categorías: 1) ensayos basados en la reacción por transferencia de átomos de hidrógeno (HAT) y 2) ensayos basados en la reacción por transferencia de electrones (ET). El ensayo ABTS pertenece a este último grupo. El compuesto cromógeno ABTS (2,2 ácido azinobis-3-etil- benzotiazolin-6- sulfónico) presenta color azul/verde con máximo de absorción a 342 nm. Es soluble en agua y disolventes orgánicos. A partir de ABTS se genera el radical catión (ABTS + ) de color verde intenso. 19

20 El radical ABTS + se puede generar enzimáticamente (mioglobina, peroxidasa de rábano), químicamente (dióxido de manganeso, persulfato potásico, radicales peroxilo) y electroquímicamente. Los antioxidantes se añaden una vez formado el radical ABTS +, y se determina la disminución de la absorbancia debida a la reducción del radical (decoloración) Pasos a seguir. Preparación de recta de calibrado. Preparación de reactivos. Comprobación de la concentración de las disoluciones de ABTS, H 2 O 2 y HRP preparadas mediante el uso del coeficiente de extinción molar (ABTS: ε 340 =36 mm -1 cm -1 ; H 2 O 2 : ε 240=43,6 mm -1 cm -1 y HRP: ε 403=100 mm -1 cm - 1 ). Generación enzimática del radical ABTS +. Puesta a punto de la metodología al extracto a analizar (cálculo de la cantidad de extracto necesario y tiempo de reacción). 20

21 Determinación de la AOX. Cálculos Preparación de patrones y reactivos. Disolución madre de Trolox 5 mm Disoluciones standard de Trolox de 0, 0.5, 1, 2, 3, 4 y 5 mm Tampón fosfato 50 mm ph 7,5 Peróxido de hidrógeno 30 µm Peroxidasa de rábano (HRP) 0,25 µm ABTS 5 mm Cálculos. Porcentaje de inhibición: % inhibición= (A 0 -A f ) x 100 / A 0 Índice TEAC (AEAC): % inhibición = a + b [Trolox] Índice TEAC = (% inhibición a) / b 21

22 3. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA HPLC 3.1. Fundamentos del análisis cromatográfico Definición. La cromatografía es un método físico de separación de los componentes de una mezcla compleja. La separación de los componentes de esta mezcla se logra teniendo en cuenta el diferente comportamiento de partición entre una fase móvil y una fase estacionaria de dichos componentes. En resumen, una cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas que se quiere separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria y posteriormente, un segundo medio o fase móvil que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para eluir a las moléculas en la muestra. Por lo tanto, los componentes básicos de una cromatografía son una fase móvil, una fase estacionaria y una mezcla de partículas. La fase estacionaria se suele encontrar dentro de una columna u otro soporte y puede ser sólida o líquida y la fase móvil puede ser un líquido, un gas o un fluido supercrítico Nomenclatura básica utilizada en cromatografía. Cromatógrafo. Es el instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica. Cromatógrama. Es una gráfica u otro tipo de presentación en la que se representa la respuesta de un detector o la concentración de un analito frente al volumen del efluente o al tiempo. Cuando hablamos de cromatografía plana, "cromatógrama" se puede referir al papel o capa con las zonas separadas. Fase Ligada. Es una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las partículas de soporte o a la pared interior de la columna. Fase estacionaria (FE). Es una fase que está inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, puede ser solida o líquida. 22

23 Fase Móvil (FM). Es el fluido que se filtra a través o a lo largo la fase estacionaria en una dirección definida. Puede ser un líquido (Cromatografía Líquida), un gas (Cromatografía de Gases) o un fluido supercrítico (Cromatografía con Fluidos Supercríticos). En cromatografía de gases se usa la expresión Gas Portador para la fase móvil. En la cromatografía de líquida se usa también la expresión eluyente. Eluir. Aplicar la cromatografía de elución. Efluente. Es la fase móvil que abandona la columna. Muestra. Es la mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se pretende. Componentes de la Muestra. Son constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente Clasificación de los métodos cromatográficos. Las técnicas cromatográficas pueden clasificarse en función de la naturaleza de la fase móvil y la fase estacionaria, del mecanismo de separación de los componentes entre fases, según el soporte etc Según el soporte. Cromatografía plana. Ventajas: sencillas, rápidas, bajo costo. Desventajas: poca eficiencia en la separación y no se adapta a sistemas automatizados. Cromatografía en columna. Ventajas: amplia versatilidad, adaptación a sistemas automatizados, buena resolución y mayor capacidad de carga. Desventajas: necesidad de equipamiento, alto costo inicial y necesidad de personal capacitado. 23

24 Según la naturaleza de la fase móvil y estacionaria. Fase móvil: gas. Cromatografía de gases. Fase móvil: líquido. Cromatografía líquida. En el siguiente esquema aparecen los diferentes métodos cromatográficos dependiendo de la naturaleza de las fases móvil y estacionaria Según el tipo de equilibrio que se establece en la separación. Cromatografía de adsorción. Se basa en un fenómeno superficial por el cual las partículas del soluto son adsorbidas por la fase estacionaria (que en este caso también se denomina adsorbente). La fuerza con que es adsorbido un componente depende de la polaridad de este, de la actividad del adsorbente y de la polaridad de la fase móvil. La fase estacionaria siempre es un sólido, se utiliza casi exclusivamente sílice y en menor medida alúmina. Cuanto más polar sea un compuesto más fácilmente es adsorbido. La fase móvil debe ser polar o más polar que la FE, los disolventes pueden ser H 2 O, metanol, etanol, 24

25 etc.. Es una técnica para compuestos de polaridad baja o media (hidrocarburos, derivados halogenados), estos deben ser menos polares que la FM para poder ser retenidos por la FE. Adsorbentes y disolventes más comunes en cromatografía de adsorción. Secuencia de menor a mayor orden de elución, actividad adsorbente y fuerza de elución Secuencia Orden de elución de compuestos - Alcanos Alquenos Hidrocarburos saturados Hidrocarburos aromáticos Halogenados Aldehídos Éteres + Cetonas Ésteres Aminas Alcoholes Tioles Fenoles Ácidos carboxílicos Actividad adsorbente Celulosa Sulfato cálcico Silice Florisil Oxido Magnesio Alumina Carbón Activo Fuerza de elución de disolventes Eter de petróleo Ciclohexano Benceno Tetracloruro carbono Diclorometano Cloroformo Eter dietílico Acetato de Etilo Acetona n-propanol Etanol Metanol Agua Ácido acético de Cromatografía de reparto. El soluto está en equilibrio en la fase móvil, (líquida o gas) y la fase estacionaria (sólida). La mayor o menor migración de un compuesto se produce por diferencia de solubilidades entre la fase móvil y la estacionaria. En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos químicamente a un soporte de sílice. Se la subdivide en cromatografía en fase normal y fase reversa. En la cromatografía en fase normal, la fase estacionaria es altamente polar y los compuestos menos polares eluyen primero. 25

26 En la cromatografía en fase reversa (RPC), se utiliza un empaque hidrofóbico, normalmente con un grupo funcional C8 o C18 y una fase móvil polar, en la mayoría de los casos solventes orgánicos (metanol, 2-propanol o acetonitrilo) generalmente acidificados (TFA, ácido fosfórico, acético o fórmico). Los solutos no polares tienden a adsorberse en la fase estacionaria y se mueven a través del sistema más lentamente que los solutos polares, por lo que las sustancias más polares eluyen primero. La retención hidrofóbica del soluto en la fase estacionaria puede disminuirse añadiendo un disolvente orgánico a la fase móvil acuosa, es decir disminuyendo la polaridad de la fase móvil, de esta manera cuanto menos polar sea la fase móvil menor será la adsorción de la muestra a la fase estacionaria. Normalmente, la elución del soluto se inicia con un eluyente de elevada polaridad como es el caso de una solución acuosa, cuya polaridad se va disminuyendo mediante a adición de solventes orgánicos, siendo el acetonitrilo y el metanol los solventes más utilizados. En la figura anterior se muestra la relación entre la polaridad y la elución en fase normal y fase reversa. Cromatografía de exclusión molecular. No hay equilibrio de separación. Las partículas se separan según su tamaño molecular y geometría. La característica principal de las fases estacionarias utilizadas en este tipo de cromatografía, es 26

27 que poseen cavidades en las cuales las moléculas de los compuestos a separar pueden penetrar y ser retenidas. Las moléculas grandes fluyen más rápido que las pequeñas. Hay que ajustar muy bien el intervalo de pesos moleculares que se quieren separar antes de elegir la fase estacionaria. Dirección del flujo En la figura se representa la elución de moléculas de diferente tamaño en una columna de exclusión molecular Cromatografía de intercambio iónico. Los iones del soluto son retenidos por los grupos funcionales que se encuentran en la fase estacionaria. Se utiliza para la separación de sustancias iónicas tanto orgánicas como inorgánicas. Las partículas cargadas negativamente se unen a la matriz sólida cargada positivamente y son retenidas y las partículas con carga positiva son rechazadas de la matriz, eluyéndose. Para regenerar la matriz, se eluyen las partículas retenidas haciendo circular una solución que modifica el ph del solvente hasta igualarlo a su punto isoeléctrico o invertir su carga neta. 27

28 Cromatografía de afinidad: La base de esta cromatografía es una reacción inmunológica donde el soluto es el antígeno y los anticuerpos se encuentran adsorbidos en la fase estacionaria. Resumiendo lo anteriormente descrito: Para pesos moleculares mayores a Da se utiliza cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de reparto en fase reversa. Para pesos moleculares menores a Da y especies iónicas se utiliza la cromatografía de intercambio iónico. Para especies no iónicas, polares y pequeñas se utiliza la cromatografía de partición o reparto. Para especies no polares e isómeros estructurales, hidrocarburos alifáticos y alcoholes alifáticos se utiliza la cromatografía de adsorción o líquido-sólido Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (High Pressure Liquid Chromatography-HPLC). Esta cromatografía nace a partir del intento por optimizar la clásica cromatografía de columna, en la cual el paso de un soluto por la columna podía tardar horas, incluso días. La inclusión de un sistema de alta presión supone el aumento de la velocidad de flujo y por tanto la aceleración el proceso. Además de aumentar el flujo, se utilizan columnas altamente empacadas, muy selectivas y eficaces. 28

29 Características de un sistema de HPLC. Elevada sensibilidad. Elevada aplicabilidad. Permite realizar análisis cualitativos exactos. Es adecuada para la separación de especies termolábiles y no volátiles. Ventajas en el análisis cualitativo: separa materiales muy afines. Ventajas en el análisis cuantitativo: aplicación amplia a los materiales menos volátiles y al análisis de multicomponentes. Limitaciones del método: se tarda en desarrollar el método. Limitaciones para la muestra: ninguna Elementos de un sistema de HPLC. Un sistema de HPLC está compuesto por los siguientes elementos: Depósito de solventes. Desgasificador. Bomba. Inyector. Compartimento de columnas. Detector. Registrador de señal. Salida de solvente. Diagrama de un sistema de HPLC 29

30 Fotografía de un sistema de HPLC Elección y preparación de solventes para cromatografía líquida. El solvente es el líquido o la mezcla de ellos que transporta la muestra a través del sistema de cromatografía. Puede ser polar o apolar, ácido o básico, acuoso u orgánico. Características que debe tener un solvente para HPLC. Pureza y estabilidad. Productos de calidad y pureza cromatográfica con un bajo contenido en impurezas. Espectroscópicamente puros. Capaz de disolver la muestra. Que sea miscible con otros solventes para formar mezclas útiles para las diferentes aplicaciones. No degradar o disolver la fase estacionaria. Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión en aplicaciones con gradiente de solventes. 30

31 Ser compatible con el detector utilizado. P.e., tener transparencia óptica cuando se usan detectores UV o Diodos. Tipos de solvente. Los solventes más utilizados suelen ser agua, disoluciones tampón acuosas y disolventes orgánicos (metanol, acetonitrilo o diferentes mezclas) Preparación de solventes para HPLC. 1. Filtrado. Eliminación de partículas en suspensión que pueden ser perjudiciales para los componentes del sistema HPLC, ocasionando costosos daños en la bomba y capilares de la columna, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Generalmente se utilizan los siguientes métodos: Filtro a la entrada del solvente. Filtración a vacío. Filtración en línea. 2. Desgasificación. Eliminación de los gases disueltos en el solvente (principalmente oxigeno y nitrógeno). Estos gases causan interferencias en detectores como de fluorescencia y electroquímico y pueden producir burbujas en la columna de HPLC, produciendo picos falsos y desviaciones de la línea base. Generalmente se utilizan los siguientes métodos: Ultrasonidos. Burbujear helio. Desgasificación electrónica en línea. Desgasificación a vacío en línea. Programación del solvente Existen dos métodos de programación de solvente en HPLC. Isocrático. Durante todo el análisis el solvente se encuentra a la misma concentración. 31

32 Gradiente de Elución. La composición de la fase móvil va cambiando durante el análisis. Los gradientes pueden ser de dos tipos: Lineales (curva 5). La velocidad de cambio del disolvente fuerte es lineal en el tiempo. Exponenciales. (curvas 1 a 4 y 6 a 9). Éstos a su vez pueden ser: o Convexos (curvas 1-4). Rápidas en alcanzar la composición final de la fase móvil. Se utilizan para separar picos superpuestos al final del cromatograma. o Cóncavos (curvas 6-9). Lentas en alcanzar la composición final de la fase móvil. Se utilizan para separar picos superpuestos al principio del cromatograma. Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir cinco pasos fundamentales: 1. Determinar la composición inicial y final del solvente. 2. Ajustar el tiempo del gradiente. 3. Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa). 4. Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolución. 5. Regresar a las condiciones iniciales la columna Sistema de bombeo. La bomba es la responsable de mantener el flujo de fase móvil y de efectuar las mezclas de solventes en las separaciones con gradiente. Características que debe tener una bomba de HPLC. Los componentes de la bomba deben ser resistentes a la corrosión química. Debe producir presiones estables hasta 6000 psi. Poca variabilidad. Control y reproducibilidad del flujo de solvente. Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min). Flujo constante y libre de pulsaciones. Buen mezclado de los solventes. 32

33 Reproducibilidad en la formación de los gradientes. Clasificación de las bombas que se usan en HPLC. Reciprocas o de pistón. Se usan en el 90% de los equipos y consisten generalmente en una cámara pequeña (35 μl a 400 μl), en la que el disolvente se bombea hacia delante y hacia atrás mediante un pistón movido por un motor. Dos válvulas que se abren y cierran alternadamente controlan el flujo del disolvente. Estas bombas generan una alta presión de salida con caudales constantes y la posibilidad de usar la elución por gradiente. Tipo jeringa o de desplazamiento. Son adecuadas para columnas pequeñas y se utilizan en aplicaciones con flujo constante. Neumática o de presión constante. La fase móvil es conducida a través de la columna mediante la presión de un cilindro de gas. Necesitan una fuente de gas a baja presión. Dentro de estas, según el numero de solventes con los que pueden trabajar al mismo tiempo se clasifican en isocráticas (1), binarias (2) y cuaternarias (4) Sistemas de inyección La introducción de la muestras es uno de los factores de reproducibilidad de la medida más importante. Los volúmenes a inyectar normalmente oscilan entre 5 y 100 µl, esto depende del tamaño de la columna, concentración de la muestras y presión del sistema. Características que debe tener un sistema de inyección de HPLC. Inyección rápida para evitar perturbar el régimen de circulación de la fase móvil. Alta reproducibilidad. Sistema de mantenimiento de altas presiones. Válvulas rotatorias de alta presión. Bucle de inyección fijo o variable. Tipos de inyectores de HPLC. Inyector automático. Permite la inyección de series de muestras en secuencia. 33

34 Inyector manual. Prácticamente en desuso, se utiliza en cromatografía preparativa. Altos volúmenes de inyección (hasta 500 µl) Columnas. La columna es el lugar físico donde se produce la separación cromatográfica. Son de tamaños y rellenos variables dependiendo del tipo de aplicación y separación que se va a desarrollar. Tipos de Columna. Según su relleno se clasifican en: Peliculares. Este tipo de relleno se suele utilizar para precolumnas. Partícula porosa. Consiste en un conjunto de micropartículas de sílice porosas que tienen diámetros entre 3 μm a 10 μm. Según sus características, Precolumnas. Se colocan antes de la columna analítica para incrementar su vida útil. Eliminan las posibles partículas y los contaminantes del solvente. Sirven para saturar la fase móvil con la fase estacionaria. La composición del relleno debe ser similar a la de la columna analítica, pero el tamaño de partículas es generalmente más grande. Cuando se contamina, se rellena nuevamente o se descarta y reemplaza por una nueva del mismo tipo. Columnas analíticas. Según el tipo de separación las columnas pueden ser: Fase Reversa (FR) Fase normal (FN) Interacción hidrofílica Intercambio iónico Ligando intercambio Iones exclusión 34

35 GPC GFC Multi modo Afinidad Quiral Además de estas, según su tamaño pueden ser: Columnas capilares: Tienen un diámetro menor a 1 mm. Estas columnas permiten trabajar con volúmenes de muestra muy pequeños todo el sistema se debe de adaptar a ellas. Columnas de calibre estrecho: se usan para pequeños volúmenes de muestra. El diámetro típico es de 1-2 mm. Como en las columnas capilares, los instrumentos deben ser modificados para acomodarse a la pequeña capacidad de estas columnas. Columnas estándar: son las que se usan comúnmente. Las partículas pueden ser de sílica o de otros polímeros especiales que les confiere resistencia a phs extremos Columnas rápidas: Estas columnas tienen el mismo diámetro interno pero son mucho más cortas que la mayoría de las columnas. Las ventajas incluyen incremento de la sensibilidad, descenso en el tiempo de análisis, descenso en la fase móvil usada, e incremento en la reproducibilidad. Columnas preparativas: son columnas utilizadas con el objeto de permitir purificar grandes cantidades de muestra (mg). Una columna preparativa normalmente tiene un gran diámetro porque está diseñada para facilitar grandes volúmenes de inyección Sistemas de detección. Características que debe tener un detector para HPLC. Sensibilidad. Linealidad. Confiabilidad. Fácil de usar. 35

36 Bajo volumen muerto. La eficiencia de un detector cromatográfico depende de la relación entre la cantidad física medida y la composición del efluente, así como también de las características de las señal de transferida. Tipos de detectores. En la siguiente tabla se enumeran los diferentes detectores que se suelen utilizar en HPLC Detector Quimioluminiscencia Conductividad Electro Químico Dispersión Luminosa Fluorescencia Espectrómetro de Masas Laser Multi Angulo de dispersión de luz Rotación Óptica Fotodiodo Array Indice de Refracción Ultra Violeta Visible Nombre Abreviado CL CD EC LS FL MS MALS OR PDA RI UV VIS De los anteriormente mencionados los más habituales son los siguientes: 36

37 Detector de Índice de Refracción. En un detector universal, no depende del caudal, robusto, sensible a cambios de temperatura, tiene menor sensibilidad que otros detectores. Detector de Fluorescencia, detecta compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatización. El detector esta colocado perpendicularmente al haz de excitación. o Detector de Fluorescencia Inducida por Láser. o Según la Fuente de Excitación. o Según el sistema óptico. Detector Ultravioleta, es utilizado en más del 70% de los equipos HPLC. La señal es proporcional a la concentration del compuesto. Se detectan alquenos, compuestos aromáticos y aquéllos que tienen uniones múltiples de C, O, N, y S. Se mide la absorbancia de los eluyentes de una columna y para minimizar el ensanchamiento de banda, se mantiene el volumen lo más pequeño posible, entre 1μl y 10μl y largos de celda entre 2 mm y 10 mm. Están restringidos a presiones debajo de 600 psi, por lo que se requiere un reductor de presión. o Detector de Longitud de Onda Fija. o Detector de Longitud de Onda Variable. o Detector de Diodos. Permiten recoger el espectro completo en 1 segundo (cromatografía tridimensional). Detectores Electroquímicos. Pueden tener un electrodo indicador de platino, oro, carbón vítreo o pasta de carbono, un electrodo de referencia y un contra electrodo en el canal de flujo. o Detector Amperométrico. o Detector Conductimétrico. o Detector Potenciométrico Parámetros cromatográficos. 37

38 Coeficiente de distribución o de reparto. El coeficiente de distribución de un componente A se define como: D A = (A est )/A móvil Donde D A es el coeficiente de distribución del componente A, y [A est.] y [A móvil.] son respectivamente las concentraciones del componente A en la fase estacionaria y en la fase móvil. El valor del coeficiente de distribución es característico de un componente para una fase estacionaria y una fase móvil determinadas. Pico de aire. Es el que corresponde a la detección de una cantidad muy pequeña de aire que entra a la columna cuando se introduce la muestra en el cromatógrafo. Línea de base. Es la parte del registro que corresponde a la fase móvil pura. Altura de pico (h). Es la distancia entre la cima del pico y la línea de base. Si el vértice es redondeado se trazan rectas tangentes a los dos puntos de inflexión de las laderas; el punto de corte de las dos rectas determina la altura del pico. Anchura de pico (w). Es la longitud del tramo de la prolongación de la línea de base, comprendida entre las intersecciones con la misma de las laderas del pico o, en su caso, de las líneas tangentes antes mencionadas. Anchura del pico en la semialtura (w/2). Es la distancia paralela a la línea de base, entre las dos laderas del pico, tomada a la mitad de la altura del pico. Área del pico (a). 38

39 Es la comprendida entre el pico y la prolongación de la línea de base. Precisamente a obtener el valor de este parámetro, en los picos del cromatograma, se dedican los dispositivos integradores. Tiempo cero o tiempo de retención del componente inerte (T0). El tiempo cero (T0), es el tiempo de retención del componente inerte. Tiempo de retención de un componente (Tr). El tiempo de retención (Tr) es el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce la mezcla y el instante en que se detecta la señal propia del componente en su máxima intensidad. Tiempo de retención corregido de un componente. Es el tiempo que transcurre entre la aparición de la señal que corresponde a un componente inerte y a la del componente considerado. Volumen de retención de un componente (Vr). Es el volumen necesario de fase móvil para transportar el soluto de un extremo a otro del sistema cromatográfico. Se define como: Vr = Tr*Fm Donde, Vr es el volumen de retención expresado como el producto del tiempo de retención de un componente (Tr) y el flujo de la fase móvil (Fm). Volumen cero o muerto (V0 o Vm). Es el volumen de eluyente que se consume sin que se detecte ningún componente. Se define igual que el volumen de retención pero el tiempo utilizado es el tiempo muerto. 39

40 T R Señal del detector T 0 h Pico a h Línea de base h 1/2 Tiempo w Factor de selectividad (α). Es la relación entre los tiempos de retención de dos componentes: Donde, α es el factor de selectividad, t Ry y t Rx son los tiempos de retención de los componentes x e y, y K x y K y son los coeficientes de distribución de los componentes. Dependiendo del valor de α se puede saber cómo será la separación: α > 2 se obtiene una mala separación ya que son necesarios periodos muy largos para realizarla. 1< α <2 se obtiene una buena separación cromatográfica. Eficiencia. Se expresa como una cantidad adimensional llamada número de platos teóricos. El término proviene de un estudio teórico en el que se trata a una columna como si estuviera constituida de numerosas, capas contiguas denominadas platos teóricos. Refleja el número de veces que el soluto se reparte entre las dos fases durante su paso a través de la columna. Cuanto mayor sea el número de platos teóricos de una columna, mayor será su eficiencia y por tanto se podrá lograr una mayor resolución. La eficiencia 40

41 de una columna puede determinarse a partir de un pico del cromatograma mediante la siguiente ecuación: Donde, N es el número de platos teóricos, L es la longitud de la columna, H es la altura de cada plato, t' R es el tiempo corregido de retención de un componente y a i es la anchura del pico cromatográfico. Si H tiene un valor pequeño, la distancia entre platos es menor y por tanto la eficiencia será mayor. Si H es grande, la columna es poco eficiente para separar ese componente ya que sus moléculas estarán muy difundidas. La velocidad de la fase móvil influye en la eficiencia del sistema cromatográfico, ya que si la velocidad es pequeña los componentes tendrán más tiempo para que se pueda realizar el equilibrio de reparto, por lo que el número de platos será mayor y la altura de los platos menor. Factor de respuesta. Los detectores dan una respuesta que es proporcional a la cantidad de sustancia (m): Respuesta = a * m El coeficiente de proporcionalidad a es característico de cada sustancia El factor de respuesta (F r ) es la inversa del coeficiente a y corresponde a la cantidad de sustancia por unidad de área. Generalmente cada componente tiene un factor de respuesta característico Resolución (R o Rs). 41

42 Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatográfico para dos componentes. Se define como: Donde Rs es la resolución, t RA y t RB son los tiempos de retención de los componentes A y B, y a A y a B son las anchuras de los picos del cromatograma de los anteriores componentes. La resolución puede observarse directamente sobre el cromatograma de picos. Se tendrá una buena resolución si los picos no se solapan, y está perfectamente delimitado cada pico, sin que coincida el final de uno con el principio del siguiente. Si Rs está próximo a 0,7 se obtendrá una mala resolución quedando los picos solapados. Si Rs esta próximo a 1,5 se obtendrán unos picos bien delimitados. Una pobre resolución es debida principalmente a: Hay demasiada muestra en la columna. La columna es corta. La fase móvil no discrimina entre los componentes. La columna es demasiado gruesa Determinación de la concentración de un compuesto. Los tres métodos principales de evaluación son: Normalización de área. Se puede utilizar en los casos en los que el cromatograma representa la muestra completa, en la que todos los componentes se han separado y que cada pico se ha resuelto completamente y el factor de respuesta es el mismo para todos los componentes. Procedimiento: 42