Evolución clínica y bases fisiopatológicas de la Esteatosis y Esteatohepatitis no alcohólica

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1 Evolución clínica y bases fisiopatológicas de la Esteatosis y Esteatohepatitis no alcohólica Dr. Carlos Eduardo Brodersen Doctor en Medicina Docente Autorizado en Medicina Interna de la Universidad de Buenos Aires Jefe de Unidad Gastroenterologia Hospital Durand MSc. Bioquímica Silvina Tallis Investigadora de la Universidad de Buenos Aires Laboratorio de Hipertensión Portal y Encefalopatía Hepática Docente de Fisiopatología Facultad de Farmacia y Bioquímica; Facultad de Medicina. Universidad de Buenos Aires Prof. Dr. Juan Carlos Perazzo Médico Especialista en Patología Experimental Profesor de Fisiopatología Director of Toxicology, International Master in Biomedical Science, Universidad de Buenos Aires - Freiburg University Laboratorio de Hipertensión Portal y Encefalopatía Hepática Facultad de Farmacia y Bioquímica; Facultad de Medicina. Universidad de Buenos Aires. Objetivos Reconocer al hígado como órgano blanco del síndrome metabólico y la esteatosis no alcohólica como su expresión. Describir la relación de la esteatohepatitis con la insulinorresistencia y las alteraciones metabólicas que ésta induce. Comprender la fisiopatología y la orientación diagnóstica y terapéutica. Entender los mecanismos de inflamación celular en el inicio y progresión de la esteatohepatitis no alcohólica.

2 2 Contenidos Introducción... 3 Prevalencia... 4 Prevalencia de la esteatohepatitis... 4 Clínica... 5 Historia natural... 6 Evaluación de la función y estructura hepática... 7 Diagnóstico... 7 Paneles de fibrosis avanzada y algoritmo... 8 Rol de los métodos de estratificación de fibrosis sin biopsia hepática... 8 Rol de la Biopsia hepática... 9 Aporte de la ultraestructura a la comprensión del problema Patogenia de la enfermedad progresiva y objetivos potenciales del tratamiento Stress oxidativo y peroxidación lipídica Oxidación de los ácidos grasos libres, insulinorresistencia y generación de radicales libres en el hígado graso 13 Fuente intracelular de radicales libres del oxígeno Fuentes extrahepáticas de radicales libres Stress en el retículo endoplásmico Citoquinas Las fuentes intrahepáticas en HGNA Mecanismos de la apoptosis en EHNA Mecanismos de fibrosis Rol de la esteatosis en la progresión de la enfermedad Ácidos grasos libres Los objetivos del tratamiento Referencias... 20

3 3 Introducción El Hígado Graso No Alcohólico (HGNA o NAFLD por sus siglas en inglés) es la primer causa de consulta hepatológica en el mundo occidental y además es considerado el primer signo del síndrome metabólico por lo que está estrechamente relacionado con la presencia de insulinorresistencia (IR), diabetes tipo 2 (DM2), obesidad y enfermedades cardiovasculares. La Esteatohepatitis No Alcohólica (EHNA o NASH por sus siglas en inglés) es el estadio entre la Esteatosis y la Cirrosis Hepática. El concepto más amplio de HGNA ha sido adoptado para cubrir todo el espectro de patologías hepáticas que incluyen en su desarrollo desórdenes metabólicos. La progresión del HGNA ha sido asociada con la alteración en el estilo de vida, entendido como cambios en las circunstancias socioeconómicas y su relación con los cambios en la alimentación o en su composición, la forma de vida sedentaria y el stress; sin embargo no existe evidencia sólida para validar en forma definitiva estas asociaciones. En general los estudios publicados presentan problemas metodológicos que dificultan extraer conclusiones. Existen series en las que las diferencias etarias, género y etnia no son lo suficientemente considerados y más aún existen discrepancias en la estimación de la ingesta alcohólica. Como ejemplo, se toman medidas tan disímiles como 20 g de alcohol diarios o semanales como máximo permitido. También existen publicaciones con condiciones muy diversas como series clínicas, estudios de autopsias o detección poblacional, que aportan datos de interés pero con dificultad para correlacionarlos. Desde el punto de vista de la histopatología podría decirse que la esteatohepatitis es un patrón morfológico de injuria hepática que puede verse tanto en situaciones de alcoholismo como de no alcoholismo. Este patrón es observable en otras patologías como obesidad, diabetes, toxicidad por drogas o de causa idiopática. El patrón histopatológico básico del EHNA está caracterizado por: esteatosis hepatocelular balonización inflamación lobular aguda y crónica simultánea fibrosis perisinusoidal en la zona 3 lobulillar E. Brunt y col. propusieron un score para estadificar el proceso necroinflamatorio y la fibrosis. Estudiaron 51 pacientes en la universidad de Saint Louis, EEUU y evaluaron 10 variables básicas de actividad. En ellas se estableció un criterio de leve, moderado o severo, proponiendo finalmente tres grados y cuatro estadios para la clasificación histopatológica del EHNA. En el 2009 Brunt y col. revisaron 728 biopsias de adultos y 205 de niños, con el objetivo de observar su relación con los procesos inflamatorios. Concluyeron que el aumento de la inflamación crónica se asocia con un incremento progresivo de HGNA en ambos grupos pero no encontraron asociación o correlación con los niveles de ALAT (alanino amino transferasa) o GPT (glutámico pirúvico transaminasa), autoanticuerpos y procesos inflamatorios lobulares. En el score de Brunt los procesos histopatológicos considerados de mayor severidad en HGNA no tratada pueden ser considerados como marcador de enfermedad avanzada. son: En resumen, los criterios básicos histopatológicos para el diagnóstico de EHNA esteatosis macrovacuolar, microvacuolar o mixta inflamación lobular y portal mixta linfocitos y polimorfonucleares balonización hepatocitaria (indicador de injuria hepatocítica) hialina de Mallory (en 50-70% de los casos) fibrosis con patrón predominantemante centrolobulillar (perivenular/pericelular/ perisinusoidal)

4 4 Prevalencia De acuerdo a la definición del consenso de la Asociación Americana se entiende por HGNA a la presencia de hígado graso en individuos que beben menos de 20 g de alcohol (etanol) por día, con HBsAg y RNA-HCV negativos. Por otro lado en Europa en un estudio bastante difundido llamado Dionisios el corte se efectuó con 30 g de alcohol/día. Los individuos que ingerían cantidades mayores fueron considerados como portadores de hígado graso de origen alcohólico. Entre los datos más confiables se encuentra el de A. Marcos y col. que presenta datos de 126 donantes de transplante hepático con una prevalencia de hígado graso del 20%, coincidiendo con K. Ground y col. que halló un 16-18%. Las diferencias de género y etnia son relevantes, siendo mayor la prevalencia de HGNA en: hispanos 45% sajones 33% afro-americanos 21% El estudio Dionisios mostró que la prevalencia es mayor en personas obesas (56 al 86%) respecto a personas normo o bajo peso (16 %). Con respecto al género fue 20 a 30% más frecuente en hombres que en mujeres. Es importante remarcar que los estudios ecográficos pueden ser erróneos en el 20 y el 30% de los casos. Actividades 1. El Hígado graso no alcohólico es más frecuente en (ordene de mayor a menor) a) Sajones b) Hispanos c) Obesos d) Normopeso Prevalencia de la esteatohepatitis Entre el 10 y el 25% de los individuos con esteatosis pueden presentar esteatohepatitis o EHNA, con o sin cirrosis, equivalente al 2 al 7% de una población dada (en Argentina puede representar de a pacientes). Los factores que favorecen la progresión de hígado graso o esteatosis a EHNA se relacionan con: Etnia Género Edad IR DM2 Hiperuricemia Dislipemia Hipertensión arterial Aumento de las transaminasas Actualmente se considera a la esteatosis como un predictor precoz del síndrome metabólico. En estudios de cohorte la asociación entre hígado graso y DM2 se encuentra entre el 21 y el 78%; el 27% de los casos se observaron en pacientes que mantenían niveles normales de glucemia, el 43% en los que presentaron hiperglucemia en ayunas únicamente y el 62% de los casos en los que presentaban DM2 establecida, dejando abierta la teoría que los factores genéticos estarían involucrados. La obesidad mórbida se acompaña de hasta un 80% de prevalencia de esteatosis; en obesos no mórbidos que no consumen alcohol la prevalencia es del 75%, si la circunferencia abdominal es mayor de 102 cm en el hombre y 88 cm en la mujer. T. Marcel y col. encontraron 2% de cirrosis, 30% de fibrosis, 79% de esteatosis y 81% de necroinflamación en pacientes obesos sometidos a cirugía bariátrica. La progresión de la esteatosis se establece en un 32 a 37% de los

5 5 casos aunque también es posible una regresión en el 18 a 29% de los casos si se establecen medidas de cuidado. Como conclusión epidemiológica podemos decir que en occidente entre el 16 y el 25% de la población adulta y el 10 al 19% de los niños presentan hígado graso. Estas cifras además incluyen un 2 a 3% de los pacientes que presentan EHNA, de los cuales un tercio evolucionan a cirrosis, por lo cual entre el 3 y el 8% morirán en esa condición. Clínica Los pacientes pueden presentar malestar, fatiga y dolor en el hipocondrio derecho. Son comunes los trastornos del sueño, el 25% de los pacientes presentan síndrome de fatiga crónica y se puede observar lipodistrofia dorso cervical. Siempre se debe tener presente que el hígado graso es un factor de riesgo cardiovascular siendo la obesidad el signo más frecuentemente hallado. En algunos casos se ha comprobado además la asociación con un estado protrombótico. La clave para establecer un diagnóstico seria identificar aquellos individuos que presentan IR, aun cuando no han desarrollado el síndrome metabólico, dado que en esta etapa podría frenarse el daño final en órganos como el hígado o el aparato cardiovascular. Muchos pacientes son diagnosticados cuando concurren con un aumento de transaminasas o bien por un diagnóstico ecográfico. Otros presentan hepatomegalia persistente, pero recordemos que la gran mayoría de los pacientes son subdiagnosticados. Los trastornos del sueño, como marcador de encefalopatía hepática, a veces son referidos por quienes conviven con los pacientes. Los signos de hipertensión portal y de enfermedad hepática avanzada están presentes en pacientes con hepatopatía avanzada. La IR se asocia a múltiples alteraciones de la cascada de coagulación. Está comprobado el aumento del factor VII y factores tisulares circulantes, ambos forman complejos activadores de la cascada de coagulación favoreciendo la formación de trombos. Asimismo la inhibición de los factores que favorecen la fibrinólisis aun no está claramente definida. El inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI 1) está asociado a esta resistencia y además está comprobado que aumenta la acción del Factor de Necrosis Tumoral α (TNFα), produciendo aumento de los ácidos grasos libres (AGL) y los triglicéridos. Debemos remarcar que, hasta el momento, no hay síntomas o signos que diferencien el hígado graso de la esteatohepatitis. Las anormalidades en el laboratorio se pueden presentar en el 7% de la población general sin poderse comprobar una causa viral u otras causas comunes de enfermedad hepática. Asimismo muchos pacientes con hígado graso presentan enzimas normales independientes del grado de afección hepática. La transaminasa más comúnmente alterada es la GPT o ALAT y cuando los valores superan las 300 unidades debería sospecharse seriamente otra causa de enfermedad hepática. Asimismo el índice ASAT/ALAT (ASAT: aspartato amino transferasa o TGO: glutámico oxalacético transaminasa) es menor a 1 y si existiese aumento de la FAL (fosfatasa alcalina) no sería mayor a dos veces su valor. La función de síntesis hepática rara vez se ve alterada hasta alcanzar la etapa más grave, por cuanto la síntesis de albúmina y el tiempo de protrombina son normales. La ferritina puede estar aumentada pero como reactante de fase aguda y no como alteración del metabolismo del hierro. Esto sucede siempre antes de la etapa de enfermedad grave. En sujetos diabéticos el descenso en la albuminemia debería ser una advertencia de una nefropatía más que una hepatopatía, debido a que antes de desarrollar una hepatopatía grave

6 6 este parámetro generalmente está normal. Los niveles de colesterol HDL y triglicéridos suelen estar alterados en un 60% de los casos. Si se hallasen alteraciones significativas de estos parámetros sería lógico evaluar por exclusión cualquier otra causa de hepatopatía. Actividades 2. Los datos de laboratorio sospechosos de hígado graso son: a) TGP>TGO, FAL x2, albúmina y TP normales b) TGP< TGO, FAL x3, albúmina disminuida, TP normal c) TGP>TGO, FAL normal, albúmina normal, TP disminuido d) TGP< TGO, FAL x2, albúmina normal, TP normal e) TGP>TGO, FAL x2, albúmina disminuida, TP disminuido Historia natural El hígado graso no alcohólico es una enfermedad de esta generación. Raramente había sido reconocida antes que J. Ludwig la describiera por primera vez en Desde ese momento pasó a ocupar el primer lugar en la práctica clínica, afectando casi al 30% de la población estadounidense, siendo difícil especular con alguna aproximación cuántos de estos pacientes evolucionarán a una cirrosis. El HGNA puede ser causado por muchos factores tales como: Drogas Alimentación enteral y parenteral Toxinas Algunos procedimientos quirúrgicos Sin embargo la discusión se centra en su origen asociado a la IR, identificada como la causa de mayor importancia. Se calcula que sólo en Estados Unidos aproximadamente 90 millones de personas sufren de HGNA y alrededor de 15 millones de personas presentan EHNA. La cirrosis se desarrolla en el 15 al 20% de los pacientes con EHNA. Una vez desarrollada la enfermedad, la tasa de mortalidad es similar a la de la hepatitis C asociada a cirrosis, con una mortalidad del 30 al 40% a los 10 años. La EHNA es considerada la etiología de cirrosis criptogénica más frecuente y causa de falla hepática subaguda. Puede progresar al cáncer hepatocelular y se ha demostrado que recurre luego del transplante hepático. En estudios con un seguimiento de 3,5 a 5,7 años se observó una discordancia entre pacientes con fibrosis y cirrosis hepática la cual podría deberse al plazo aún corto de seguimiento de los pacientes con fibrosis y EHNA (32 al 35%) versus los que desarrollan cirrosis (19 a 22%). En oposición, la esteatosis sola esta reportada como una enfermedad de curso benigno aunque hay estudios que demostraron un 3% de cirrosis. Utilizando ultrasonido se observó una prevalencia del 16 al 23% de HGNA en los individuos pesquisados. En el estudio Dionisios, realizado en el norte de Italia, que incluyó más de personas, la prevalencia fue del 16% en los pacientes con normopeso y del 76% en los obesos, aumentando al 46% y 95% respectivamente si ingerían 45 g de alcohol diarios o más. Este dato es interesante ya que deja claro que la obesidad es un factor determinante aún más fuerte que el alcohol.

7 7 Actividades 3. Cuál de las siguientes afirmaciones es incorrecta? a) El hígado graso no alcohólico puede ser causado por factores como drogas, alimentación enteral, toxinas, procedimientos quimioterápicos b) El 15 al 20% de los pacientes con EHNA desarrolla cirrosis c) La EHNA es causa de cáncer hepatocelular d) La EHNA es marcador de riesgo vascular e) El Hígado graso y la EHNA no recurren luego del transplante hepático Evaluación de la función y estructura hepática La ALAT aislada sería la forma más eficiente para detectar esta alteración, aunque el valor de corte a utilizar está en discusión; 43 UI podría ser un valor aceptable. La asociación con ASAT y la Gamma Glutamil Transpeptidasa (GGT) hace el cribado menos específico, no importando si el paciente es obeso o diabético. La ecografía aislada presenta defectos tales como ser operador y equipo dependiente, resultando inexacto para un screening amplio, ya que a veces los resultados son erróneos hasta en un 33 % de los pacientes. Si el hígado no está afectado en más del 33 %, no se refleja en el examen ecográfico. Considerando además que este método no puede diferenciar el hígado graso de la esteatohepatitis, y sabiendo que la esteatohepatitis representa habitualmente un tercio a la mitad de los casos diagnosticados de HGNA, podríamos estimar aproximadamente la prevalencia de esteatohepatitis entre un 5,7% hasta un 16,5 % de los casos. Diagnóstico La biopsia hepática es considerada el Gold Standard para el diagnóstico del HGNA, un score para esta enfermedad se está utilizando con éxito y aceptación entre los patólogos, a pesar que la utilidad de la biopsia también está siendo cuestionada últimamente dada la diferencia del tamaño y número de muestras, con diferencias en las evaluaciones en el mismo paciente y tomas en diferentes lugares del hígado. Todos los autores coinciden en que las muestras deben ser de al menos 2,5 cm y con un espesor de al menos 1,4 mm y eventualmente con dos pasajes de la aguja para garantizar mayor precisión y concordancia con el grado de fibrosis. Tampoco existe concordancia en el grado de fibrosis entre los observadores. Las alternativas a la biopsia hepática se siguen buscando; la ecografía, la tomografía computada, la resonancia magnética y la espectroscopía por resonancia se utilizaron para determinar el compromiso graso del hígado. Todos estos métodos son eficientes para demostrar la infiltración cuando ésta supera el 33% de depósito. La espectroscopía demostró sin embargo la posibilidad de detectar hasta un 5% de infiltración grasa. Asimismo la resonancia es más eficiente en los infiltrados focales o localizados y la tomografía computada calibrada puede ser más útil en el seguimiento longitudinal. Los métodos que combinan el metabolismo de la glucosa u otros como los fosfolípidos aún son conflictivos y experimentales como así también la llamada elastografía.

8 8 Actividades 4. Cuál De los siguientes estudios es menos eficiente para detectar infiltración grasa hepática? a) Ecografía b) TAC c) RNM d) Espectroscopía por resonancia e) Elastografía Paneles de fibrosis avanzada y algoritmo La presencia de obesidad y de DM2 son los predictores más importantes de fibrosis, la edad > 50 años es también un factor predictivo. Los modelos de predicción demostraron que un paciente menor a 45 años que no tiene obesidad o diabetes, con índice GPT/GOT < 0,8, tendrá sólo un mínimo riesgo para desarrollar fibrosis, en contraste a dos tercios en diabéticos y obesos de más de 45 años con índice GPT/GOT > 0,8, los cuales desarrollarán fibrosis en su mayoría. Recientemente la utilización del Fibrotest (constituido por Apolipoproteína A, GGT, Haptoglobina, Bilirrubina total y alfa 2 macroglobulina) también predice en forma bastante ajustada la fibrosis. La investigación también incluyó marcadores biológicos relacionados al stress oxidativo, apoptosis, inflamación y fibrogénesis. En el marco de la inflamación la relación entre el TNFα y la adiponectina parecería ser lo más prometedor, dos estudios demostraron que el TNFα ha estado persistentemente elevado en pacientes con EHNA versus los que no la poseen. Con respecto a la adiponectina los hallazgos han sido similares pero en sentido contrario. En el área de la injuria celular, también se muestran muy promisorios los marcadores de apoptosis, tales como fragmentos de CK 18 y Caspasa 3. Los productos de la matriz extracelular tales como el ácido hialurónico y la laminina pueden ser marcadores biológicos útiles. El Grupo Europeo para el Estudio de la Fibrosis Hepática diseñó un panel de detección para fibrosis hepática que incluye ácido hialurónico, colágeno IV, colágeno VI, fragmento amino terminal de procolágeno III, metaloproteasas y el inhibidor tisular de la metaloproteasa tipo 1, obteniendo un área bajo la curva para distinguir niveles de fibrosis del 90% para fibrosis severa, 82% para fibrosis moderada y 76% para no fibrosis, con una sensibilidad del 89% y valor predictivo negativo del 98%. Sin embargo, al tratarse de marcadores no rutinarios, dificultan su validación en grandes cohortes así como su uso en la práctica clínica, aunque podrían evitar potencialmente más del 82% de las biopsias. Rol de los métodos de estratificación de fibrosis sin biopsia hepática La elastografía es un nuevo método no invasivo en evaluación. Consiste en la estimación de la rigidez del tejido a una profundidad por debajo de la piel entre 25 a 65 mm, midiendo la velocidad de propagación de una onda de deformación elástica dentro del tejido. Cuanto mayor sea la rigidez que presente el tejido, mayor será la velocidad de propagación de la onda. La medición se realiza con un instrumento que actúa como sonda colocado sobre la piel, entre las costillas, a nivel del lóbulo derecho hepático. Entre noviembre del año 2002 y marzo del 2005 se realizaron 20 estudios multicéntricos y 10 unicéntricos con el objeto de establecer la validación del método para determinar el estadio de fibrosis. Respecto de la precisión en establecer el diagnóstico de cirrosis, la elastografía demostró éxito en más del 90% de los pacientes. Sin embargo aún es necesario precisar el nivel numérico que corresponde a un determinado estado de cirrosis para las distintas etiologías. Por el contrario, la capacidad de diagnosticar estadios tempranos de fibrosis fue menos contundente. La sensibilidad en estos casos se ubicó entre un 56

9 9 a 67% y la especificidad entre un 89 y 91%, para diagnosticar un estadio de fibrosis F1 versus F2, 3 y 4 en pacientes con hepatitis crónica por virus C. Respecto del uso de la elastografía para realizar un seguimiento de la enfermedad fibrótica, hasta este momento no se disponen datos obtenidos en estudios a largo plazo de biopsias pareadas. Sin embargo, basándose en la relación a la respuesta virológica a los tratamientos antivirales y la regresión de la fibrosis, los resultados de la elastografía demostraron una disminución en la rigidez del hígado en 74% de pacientes respondedores versus un 53% de no respondedores. Otros trabajos revelan similares resultados que son prometedores en cuanto al uso de la elastografía para el seguimiento a largo plazo. En un trabajo reciente Kucharczyk M, en Argentina, utilizando elastografía en 1000 pacientes detectó 20,8% con NAFLED, lo cual denota la alta prevalencia de esta patología, asociado a la imposibilidad de biopsiar a todos los pacientes. Últimamente se han publicado varios trabajos al respecto que concluyen que solo se debería biopsiar a aquellos pacientes con NAFLD y elastografías con valores mayores a 8 kpa, pudiendo evitar dicho procedimiento en un porcentaje significativo de pacientes. Las limitaciones del uso de la medición del módulo de rigidez del tejido hepático son la presencia de ascitis y la obesidad (distancia entre la piel y el hígado mayor a 25 mm). En la primera circunstancia se asume que por encima de las dificultades de medición, no cabría la necesidad de medir la fibrosis. En la segunda condición, la medición no podría obtenerse. La elastografía es un método prometedor para el diagnóstico de fibrosis avanzada o cirrosis. En cuanto a la precisión en el diagnóstico de estadios tempranos de fibrosis los resultados han sido moderados en igual manera que los marcadores séricos. Se han registrado avances en el desarrollo de marcadores séricos que correlacionan con la severidad de la fibrosis y representan una herramienta atractiva para estimar la severidad inicial y los cambios ocurridos en el tiempo. Aunque estos avances son interesantes, los biomarcadores deben ser validados en estudios transversales y longitudinales como también demostrar reproducibilidad y diferenciación entre los distintos estadios de fibrosis (leve, moderada y severa). Múltiples paneles de marcadores indirectos han incluido los tests de laboratorio utilizados para estimar la severidad de la enfermedad hepática. Para la hepatitis C, por ejemplo, se ha incorporado al panel los valores séricos de GOT, fosfatasa alcalina y recuento plaquetario, entre otros. Las limitaciones de estos modelos incluyen la imposibilidad de diferenciar estadios moderados de severos, la no clasificación del 40-60% de los pacientes, la escasa sensibilidad en relación a los efectos del tratamiento y la falta de validación en cohortes independientes. La mayoría de estos paneles sirven sólo para identificar pacientes con enfermedad mínima o leve. Rol de la Biopsia hepática La importancia clínica del monitoreo de la fibrosis hepática radica básicamente en los siguientes aspectos: 1. la morbimortalidad de diversas hepatopatias crónicas está relacionada con el estadio y progresión de la fibrosis 2. su estabilización o regresión ha sido demostrada ampliamente en el contexto del tratamiento específico de la enfermedad de base 3. la presencia de puentes de fibrosis en algunos escenarios es indicación de tratamiento (HCV) y en otros de suspensión del mismo (metotrexate en artritis reumatoidea) 4. las limitaciones implícitas de las biopsias hepáticas reiteradas en la práctica clínica cotidiana Aunque en la actualidad la biopsia hepática (BH) es el método de elección para establecer el estadio de fibrosis, los errores de muestreo, la variabilidad inter-observador, los riesgos del procedimiento y la reticencia de los pacientes son los puntos débiles de este método. Esto pone entonces al profesional en la situación dilemática de efectuar o no la práctica a su paciente. El

10 10 dolor es sin duda la complicación más frecuente tras la realización de una BH, que según algunos estudios aparece hasta en el 30% de los pacientes, siendo moderado o severo en el 3 y 1,5% respectivamente. La hemorragia es la complicación mayor más importante. La tasa de hemorragia es muy variable según las series, dependiendo de algunos factores como: cirrosis avanzada hepatitis aguda fulminante tratamiento con corticosteroides infecciones asociadas alteraciones de la coagulación administración de heparina el día previo a la biopsia insuficiencia renal crónica No existen estudios suficientemente evaluados que demuestren la disminución de las complicaciones en función de la postura tras la biopsia, la analgesia utilizada o del uso de sellado mediante sustancias como pegamento de fibrina (Tissucol ). Según la literatura se producen hemorragias significativas hasta en el 0,5% de los casos. Sin embargo es mucho más frecuente la presencia de pequeños hematomas a nivel intrahepático o subcapsular, que se detectan al realizar una ecografía de control a las 24 horas del procedimiento invasivo. En este sentido es importante determinar cuál es el significado clínico real de estos hematomas y qué porcentaje de los pacientes que lo desarrollan van a presentar síntomas que hagan sospechar dicha complicación. Estos datos son importantes para establecer si es necesaria la realización de una ecografía de control a todos los pacientes a los que se les practica un procedimiento invasivo hepático, lo que supondría un elevado costo sanitario y una sobrecarga para las unidades de ecografías. Aporte de la ultraestructura a la comprensión del problema Del estudio en EHNA y HGNA de los cambios grasos microvacuolares y de sus proteínas asociadas Perilipinas o PAT en la infancia se encontró que existen perilipinas disfuncionales que pueden resultar en alteraciones en el número y tamaño de las microvacuolas y en desregulación de la vía de la insulina. B. Straub y col. demostraron que la expresión de 3 perilipinas difería, es decir de: perilipina, adipofilina (actualmente perilipina 2) y TIP-47 (actualmente perilipina 3). Las perilipinas 2 y 3 se expresan como constitutivas de la Vitamina A en depósitos celulares en hígado, mientras que la perilipina que normalmente se encuentra en los adipocitos y en células esteroideogénicas se expresa de novo en la esteatosis en los hepatocitos. Con el incremento de la esteatosis la expresión de la perilipina 3 permanece sin cambios, mientras que existe un aumento uniforme en las otras dos, mayor en la perilipina que en la perilipina 2. La inmunohistoquímica demuestra una discreta localización en la esteatosis en los hepatocitos de la zona 3 mientras que la perilipina 2 se ubicó con distribución panacinar. Finalmente a través de la inmunofluorescencia se puede localizar a las tres perilipinas asociadas con diferentes formas de vacuolas lipídicas. Otras proteínas asociadas a los lípidos que tienen un rol en la homeostasis energética son la A y C CIDE (Cell Death-Inducing DFF-Like Effector) y son las que disminuyen la regulación de la expresión génica en el tejido hepático en pacientes con gran pérdida de peso luego de una cirugía bariátrica. La degeneración balonizante es también en algunas circunstancias una dificultad diagnóstica histopatológica. Las células balonizadas se presentan con mayor tamaño que sus vecinas, hipercromáticas, y con un material eosinófilo perinuclear conocido como los cuerpos de Mallory- Denk. El citoplasma de estas células se presenta como reticulado y se pueden individualizar, ya sea por microscopía de luz o electrónica, vacuolas citosólicas. En las mismas se puede encontrar fosfatidilcolina en su forma oxidada, es decir, son vacuolas citoplasmáticas, en el retículo endoplásmico, de contenido lipídico y que están colocalizadas con la perilipina 2. Estas han sido propuestas como una forma de protección reactiva contra la esteatohepatitis.

11 11 Finalmente, el daño en el citoesqueleto de las células balonizadas o con degeneración balonizante ha demostrado tener pérdida de la normal expresión de K8/K18 y K1899. Recientes avances han demostrado que los hepatocitos afectados muestran aclaración del citoplasma y cuerpos de Mallory-Denk agrupados rodeando a material positivo para K8/K18. Este estudio inmunohistopatológico puede realizarse para ayudar en la identificación de las más pequeñas vacuolas, mucho menores a las clásicas de los hepatocitos con degeneración balonizante (Figura 1). Figura 1 Histoquímica hepática Keratin 8/18 (K8/18) positiva por inmuno-histoquímica. Se observan hepatocitos positivos, y en el centro se observa un área negativa rodeada de material agrupado de K8/18. Esto ilustra el posible uso de esta técnica para la identificación de degeneración balonizante y cuerpos de Mallory-Denk. Stain highlights hepatocytes (Mag. 40 X). De, EM Brunt, 2011 Actividades 5. Cuál de los siguientes es menor predictor de fibrosis? a) Edad > 50 años b) TGP/TGO < 0.8 c) Obesidad d) Diabetes tipo 2 Patogenia de la enfermedad progresiva y objetivos potenciales del tratamiento La teoría de los dos HITS propuesta en 1998 postulaba que el primer paso es el desarrollo de la esteatosis como consecuencia de la existencia de resistencia a la insulina, esta esteatosis sensibilizaba al hígado para el segundo acontecimiento o HIT responsable de la inflamación y fibrosis. Los principales mediadores para este segundo acontecimiento son la peroxidación lipídica y las citoquinas. Actualmente las revisiones de este modelo se refieren a las fuentes del stress oxidativo y citoquinas, en particular el rol de la IR, los ácidos grasos libres y la inflamación del tejido adiposo. El rol del retículo endoplásmico ha aparecido en relación a la apoptosis como un factor central en el segundo HIT.

12 12 Está bien demostrado que a mayor cantidad de esteatosis mayor severidad posterior de la injuria y producción de fibrosis, por lo que la esteatosis puede ser un epifenómeno más que un verdadero primer HIT. Stress oxidativo y peroxidación lipídica Los radicales libres del Oxígeno (ROS) son los candidatos más tentadores para explicar los cambios histológicos observados en las biopsias hepáticas en pacientes con HGNA (Figura 2). La peroxidación lipídica y de la membrana mitocondrial como consecuencia de la formación de ROS: causan necrosis y apoptosis en forma directa y formación de megamitocondrias inducen la expresión de Ligandinas Fas (Fas/L) sobre los hepatocitos induciendo necrosis y muerte apoptótica activan la c-jun Kinasa (JNK), que también actúa como factor proapoptótico Los productos finales de la peroxidación de aldehídos pueden desencadenar una respuesta inmunológica y estimular la síntesis de matriz extracelular (ECM), por intermedio de las células estelares, formando incluso cuerpos de Mallory y estimulando quimiotaxis neutrófila. Esto demostraría que a mayor stress oxidativo mayor severidad de la enfermedad. Cuando estudiamos la dieta de los pacientes es evidente que aquellos más afectados consumen menos enzimas antioxidantes. Figura 2 Stress oxidativo y peroxidación lipídica ROS: radicales libres de oxígeno; Fas/L: ligandinas Fas; JNK: C-Jun N Terminal kinasa; MDA: malondialdheído; 4 HNE ox-p-colina: 4 hidroxinonenal ox P colina; MEC: matriz extracelular

13 Oxidación de los ácidos grasos libres, insulinorresistencia y generación de radicales libres en el hígado graso A pesar que en el inicio los dadores de radicales libres son las células inflamatorias, luego el propio hepatocito se convierte en dador de estos radicales libres tóxicos, como resultado de una oferta exagerada de ácidos grasos libres (AGL o FFA del inglés) hacia la mitocondria, peroxisomas y enzimas del citocromo P450. La IR, especialmente en el territorio esplácnico, produce una lipólisis incontrolada que inunda de AGL al hígado; un estudio reciente informa que casi dos tercios del componente graso del hígado provienen de esta fuente. Esta acumulación induce a su vez IR en el propio hígado a través de citoquinas induciendo una depleción en el Malonil CoA que favorece aún más la entrada al hepatocito de AGL, siendo éstos estímulos del PPAR-α que modula la trascripción de genes que involucran enzimas relacionadas a la β-oxidación en mitocondrias y peroxisomas, incluyendo los miembros de la familia CYP4A, logrando tres caminos diferentes de oxidación de los ácidos grasos dentro del mismo hepatocito. Esto es coherente con trabajos realizados in-vitro que mostraban un incremento de radicales libres en cultivos de hepatocitos tratados con exceso de ácidos grasos. 13 Fuente intracelular de radicales libres del oxígeno Muchos de los datos disponibles provenientes de trabajos realizados en modelos animales y de estudios en pacientes sugieren que la mitocondria es la fuente más importante de radicales libres de oxígeno en la EHNA. La pérdida del gen que codifica la enzima acetil CoA oxidasa en el ratón desarrolla un grosero cuadro de EHNA, a punto de partida del aumento de oxidación de AGL por parte de las mitocondrias y los microsomas. Con respecto a los estudios en pacientes, está demostrada una disfunción mitocondrial y se han reportado megamitocondrias conteniendo inclusiones lineales en la mayoría de los pacientes con EHNA. Más recientemente se ha demostrado que la cadena respiratoria mitocondrial está marcadamente deprimida en pacientes con EHNA versus controles, estos estudios se basan en el incremento de radicales libres por parte de la mitocondria quizás originados en la acción del TNFα, confirmando entonces la relación entre las citoquinas y el stress oxidativo intracelular. Por lo tanto los radicales libres de oxígeno pueden perpetuar un círculo vicioso de mayor generación de stress oxidativo, IR y transcripción genética de citoquinas debido al daño mitocondrial y a la activación de vías metabólicas intracelulares de la Proteínkinasa C (PKC), la I- Kb Kinasa (IKK) y la C-Jun N Terminal Kinasa (JNK). Fuentes extrahepáticas de radicales libres Recientes evidencias demostraron que los radicales libres (con el subsecuente stress oxidativo) pueden liberarse desde el tejido adiposo aumentando la expresión del NADPH e inhibiendo la expresión de genes antioxidantes. El mecanismo preciso del aumento de los radicales libres en la obesidad, permanece poco claro, pero la respuesta de los adipocitos a la hiperglucemia, a la activación de ácidos grasos libres y a receptores llamados Toll-Like serían la clave del proceso. La contribución de las células endoteliales y la infiltración de macrófagos en el aumento de radicales libres en el tejido adiposo tampoco es clara. Sin embargo la fuente celular del tejido adiposo actúa como donante de radicales libres y aumenta el stress oxidativo en pacientes con SM y lesión hepática por stress oxidativo (Figura 3).

14 14 Figura 3 Fuentes extrahepáticas de radicales libres JNK: C-Jun N Terminal kinasa; SOCS: supresor de la señalización de citoquinas; IKK/PKC:I Kb kinasa/ Protein kinasa C; TNF α: factor de necrosis tumoral alfa; MalCoA: malonil Co A; ROS: radicales libres de oxígeno Stress en el retículo endoplásmico El retículo endosplasmático (ER) es la organela en la cual las membranas logran un plegamiento y oligomerización adecuada. Dado que esta función es esencial en el manejo de las proteínas, es extremadamente sensible a las alteraciones de la homeostasis. El stress (falta de glucosa o nutrientes, infecciones virales, ácidos grasos libres) incrementa la síntesis de proteínas que pueden desencadenar la liberación de kinasas, liberando la síntesis de lípidos vía regulación de esteroles y la transcripción de genes proapoptóticos. La activación de las kinasas residentes en el retículo endoplásmico (IREI, PERK) activan JNK1-AP-1 y IKK-K-B-NKKB estableciendo entonces una unión entre el stress y la inflamación. El retículo endoplásmico es entonces una fuente de radicales libres, induciendo inflamación, IR y stress oxidativo, los cuales son signos típicos de EHNA, como se ha demostrado en la alteración por enfermedad alcohólica y en la obesidad, relacionando la IR y el desarrollo de diabetes. Por último se ha demostrado que los ácidos grasos saturados provocan apoptosis en los hepatocitos (Figura 4).

15 15 Figura 4 Stress en el retículo endoplásmico SREBPs: proteínas transportadoras de elementos reguladores de esteroles; VFAs: ácidos grasos volátiles; CHOP: promotor del gen DDIT3 ; TRAF2: receptor asociado al factor de necrosis tumoral 2; JNK: C Jun N terminal kinasa; IKK: I Kb kinasa; IRS-1: sustrato del receptor de insulina 1. Citoquinas Son los principales candidatos para un rol principal en la patogénesis y la progresión de EHNA. Son capaces de producir todos los signos típicos del cuadro de EHNA, juegan un rol protagónico en la resistencia hepática a la insulina y en pacientes obesos versus controles han demostrado incrementos claros de TNFα con mayor expresión del RNA mensajero de esta molécula, con aumento paralelo de los receptores en la superficie de las membranas celulares a estos mediadores. Las fuentes intrahepáticas en HGNA El cómo los hepatocitos de los pacientes que consumen dietas hipergrasas expresan aumentos francos de citoquinas intracelulares, activan los ácidos grasos, la JNK y contribuyen a la liberación de citoquinas permanece poco claro; pero parecería que todas las isoformas de JNK estarían involucradas en el desarrollo de la apoptosis y la EHNA, contribuyendo además a la IR por un efecto paracrino inhibiendo la señal intracelular de la insulina. Recientes observaciones han demostrado además que las células de Kupffer (macrófagos residentes en el tejido hepático) están activos en animales alimentados con dietas ricas en grasa, sugiriendo que estas células típicamente productoras de citoquinas juegan un rol indiscutible, siendo la liberación de las citoquinas hepatocitarias el primer estímulo. Otro interesante tema es la activación de estas células producida por las endotoxinas bacterianas en presencia de sobrecrecimiento bacteriano intestinal, tal como se ve en pacientes con motilidad alterada como en el caso de los diabéticos. Recientes estudios han demostrado que en la obesidad el tejido graso se caracteriza por una infiltración de macrófagos asociada a inflamación crónica, siendo una potencial fuente de citoquinas. Como es desconocido el estímulo para que el tejido graso en el hígado se inunde de macrófagos y libere citoquinas, este incremento se ha postulado debido a la reducción de la adiponectina, una citoquina defensiva

16 16 del tejido adiposo, la cual es activada normalmente por el PPPα (Alfa-pirrolidinopropiofenona) y la kinasa dependiente de la adenosina monofosfato, tal como ocurre en el músculo y en el hígado. A partir de su activación resulta un incremento de la oxidación de ácidos grasos libres, exportación de lípidos y reducción de la lipogénesis. La adiponectina también ha demostrado efectos antiinflamatorios, probablemente por vía de la supresión y activación del factor TNFα; se ha visto que los niveles de adiponectina están disminuidos en la obesidad, la IR y la DM 2, y podría ser la clave en la diferencia de los pacientes con hígado graso con respeto a los que padecen esteatohepatitis. Estos últimos tienen comprobada disminución de receptores celulares a la adiponectina y desarrollan los cuadros más severos de inflamación. Mecanismos de la apoptosis en EHNA La apoptosis, considerada el segundo HIT en la enfermedad, es el principal mecanismo de muerte celular en la EHNA, siendo la vía final común la vía mitocondrial, incluyendo el stress oxidativo, vía la expresión de los ligandos FAS, JNK, el stress del retículo endoplásmico, la oxidación de ácidos grasos y el aumento del TNFα activando caspasas en el citosol, tal como la caspasa 9 que inicia la cascada apoptótica. La muerte celular programada o apoptosis es una expresión fundamental de la renovación tisular y del desarrollo. Es un proceso ATP dependiente y se caracteriza morfológicamente por disminución de tamaño celular, condensación de la cromatina (picnosis) y blebs o pequeñas burbujas en la superficie celular. Cuando el proceso está adecuadamente regulado, el aclaramiento o limpieza de los cuerpos apoptóticos se limita a una celularidad específica y no está asociado con ninguna reacción tisular de tipo inflamatoria. Por el contrario, cuando la apoptosis ocurre en tejidos adultos como respuesta a un mecanismo de injuria celular, el proceso se desregula y adquiere características de proceso crónico con infiltración inflamatoria. Es así que este proceso puede ser también un disparador de la fibrosis. La apoptosis puede estar mediada por una vía extrínseca, asociada a receptores, o por una vía intrínseca asociada a la vía mitocondrial. Ambas vías convergen en una vía final común que es iniciada por el clivaje o activación de la caspasa 3. La activación de la vía de las caspasas ocurre por el clivaje de residuos de aspartato que a su vez requiere la activación de las caspasas. Esta cascada proteolítica amplifica la señal apoptótica y lleva a la rápida muerte celular. La apoptosis en el hígado está clásicamente ligada a la activación de los receptores que desencadenan la muerte celular y se encuentran en la superficie celular, e incluyen a Fas (CD95), receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1) y al factor de necrosis tumoral relacionado con la apoptosis-inductor de receptores 1 y 2 (TRAIL-R1 y -R2). La expresión de Fas/CD95 está incrementada en pacientes con hepatitis viral, hepatitis alcohólica, enfermedad biliar crónica e insuficiencia hepática aguda. De la unión del ligando con su receptor específico surge un estímulo de reclutamiento de moléculas de adaptación citoplasmáticas como la proteína Fas-asociada con dominios de activación de la muerte celular (FADD) y del TNFRSF1A asociado a la vía del dominio de muerte celular (TRADD) todo esto con la consecuencia de la activación de la caspasa 8. La caspasa 8 es la encargada de activar a la caspasa 3, comenzando así la vía final común de la activación de esta forma de muerte celular o apoptosis. Esta vía ha sido ampliamente estudiada en ratones, que al administrarles anticuerpos anti-fas desarrollaron apoptosis masiva hepática llegando rápidamente a la insuficiencia hepática fulminante. Como ya se expresó la EHNA puede llevar a HGNA, y es esta una diferencia que se extiende desde la simple estatosis o cambio graso a la injuria celular severa y a la apoptosis. La apoptosis de los hepatocitos pueden liberar factores que reclutan células inflamatorias y disparar el mecanismo de producción de colágeno tipo I por los miofibroblastos. Existen estudios en pacientes que demuestran que el grado de la apoptosis hepática puede ser evaluado por la medición en plasma de fragmentos de citoqueratina 18 (un producto de la caspasa 3) y que el uso de inhibidores de las caspasas puede mejorar la cantidad de fibrosis. La EHNA se caracteriza también por una serie de niveles elevados de citoquinas proinflamatorias como el TNFα, que promueve la IR hepática y genera la vía que va de una simple estatosis al EHNA.

17 17 Merece destacarse también que en el hígado el proceso inflamatorio es una etapa crítica en la progresión de la esteatosis a la esteatohepatitis. El incremento del infiltrado inflamatorio, mínimo en la esteatosis, es un espejo en el que se refleja el grado y extensión de la apoptosis. Mecanismos de fibrosis Muchos mecanismos involucrados en los procesos de injuria hepática, muerte celular y otros asociados con inflamación pueden llevar a la activación de células estrelladas (anteriormente llamadas células de Ito) y depósito de proteínas de la matriz extracelular como parte de una respuesta normal de adaptación. La apoptosis de las células hepáticas desencadenada por un aumento de la expresión de FAS puede promover a su vez la activación de las células estrelladas vía TNFα induciendo ligandos apoptóticos o siguiendo a la ingestión de los hepatocitos apoptóticos por las células de Kupffer y por ende la autoactivación de células estrelladas por liberación de Factor de Crecimiento Transformante beta (TGF-β). Además existen mediadores en la EHNA relacionados a la obesidad y la IR que favorecen la fibrosis. La leptina producida por los adipocitos estimula la producción de proteínas de la matriz extracelular en las células estrelladas y se ha visto que juega un rol prominente en la fibrosis hepática y en los modelos experimentales de EHNA. Los niveles de leptina circulantes liberados por el tejido adiposo se encuentran elevados en pacientes con esteatosis hepática sugiriendo un rol potencial en la fibrosis relacionada con obesidad. Estudios recientes sugieren que además de tener un efecto directo fibrogénico la leptina puede estimular la liberación de citoquinas inflamatorias por los linfocitos T-helper (LTh). La estimulación de las células estrelladas ha sido evidenciada por la acción de la angiotensina 2 y la norepinefrina, ambas secretadas por el tejido adiposo, encontrándose elevadas en el suero de pacientes obesos. Un efecto directo de la fibrogénesis en la IR es la presencia de un factor de crecimiento del tejido conectivo secretado por las células estrelladas que estarían sobreexpresados por la presencia de hiperglucemia e hiperinsulinemia. Además, el factor de crecimiento del tejido conectivo se encuentra sobre expresado en pacientes con EHNA y correlacionado con el grado de fibrosis. La disminución de adiponectina detectada en los obesos favorece el desarrollo de la fibrosis hepática. Rol de la esteatosis en la progresión de la enfermedad El rol de la esteatosis hepática en la progresión de la enfermedad como primer HIT, originalmente proviene de dos observaciones: 1. en la enfermedad la injuria hepática severa se correlaciona con esteatosis severa 2. modelos animales sugieren que los hígados grasos son más sensibles al stress oxidativo mediado por citoquinas Sin embargo la mayoría de los pacientes con EHNA presentan groseros depósitos grasos en el hígado sugiriendo que los triglicéridos per se no serían causa de daño, sino la producción por parte de las células estrelladas y hepatocitos de mediadores de inflamación y fibrosis.

18 Ácidos grasos libres Está demostrado que la oferta permanente de ácidos grasos libres activa la citotoxicidad celular relacionada al stress en el retículo endoplásmico y lisosomal mediada por las kinasas (PKC, IKK, JNK) concluyendo en apoptosis, inflamación e IR. En estudios in-vitro de cultivos de hepatocitos de pacientes con HGNA ricos en ácidos grasos saturados e insaturados, estos fueron los responsables de los efectos de la enfermedad, siendo los primeros más dañinos que los segundos. El proceso de esterificación de los ácidos grasos en triglicéridos podría ser una ruta protectiva al efecto tóxico de los lípidos. Células deficientes en la enzima que cataliza el último paso en la síntesis de triglicéridos mostraron un aumento en la sensibilidad a la apoptosis inducida por ácidos grasos. Además se observó que en el Kwashiorkor y en la β-lipoproteinemia hereditaria existe una marcada acumulación de triglicéridos (por la imposibilidad de ser excretados desde el hígado) y ausencia de ácidos grasos libres sin observarse EHNA ni cirrosis (Figura 5). Figura 5 Relación entre los ácidos grasos libres, la inflamación y la EHNA 18 JNK-AP1: C Jun N Terminal kinasa-ap1; IKK-NFαB: I Kb kinasa; TNF α: Factor de necrosis tumoral α; IL: interleuquina.

19 Los objetivos del tratamiento 19 El entendimiento de los mecanismos básicos en la progresión de la enfermedad se ha acumulado en los últimos años en forma exponencial. Basados en las consideraciones anteriormente expuestas las direcciones del tratamiento serían: 1. Contrarrestar el incremento de los ácidos grasos libres 2. Anular o disminuir el stress oxidativo 3. Disminuir con chaperones moleculares el stress del retículo endoplásmico 4. Contrarrestar las citoquinas con anti TNFα, antagonistas de TLR4, antibióticos y prebióticos 5. Disminuir la fibrosis con sistemas bloqueantes de renina angiotensina y α- bloqueantes simpáticos Además se podrían direccionar terapias para combatir la inflamación, apoptosis y las cascadas de señales involucradas en fibrosis, relacionadas en la patogénesis de la progresión de la EHNA hacia la esteatohepatitis, inhibiendo caspasas, JNK e IKK, necesitando aún ensayos más extendidos para lograr su aplicabilidad clínica (Tabla 1). Tabla 1 Ofertas de tratamiento basadas en principios fisiopatológicos para la enfermedad grasa no alcohólica del hígado Mecanismo Objetivo Tratamiento Síndrome metabólico Obesidad visceral Dieta Ejercicio Orlistat Cirugía bariátrica Hipertrigliceridemia/bajo colesterol HDL Hipertensión Diabetes/Insulinorresistencia Clofibrato Gemfibrozil Probucol Estatinas Enalapril Losartan Ejercicio Metformina Peroxidación lipídica Stress oxidativo Vitamina E Betaína S adenosil metionina Sobrecarga de hierro Flebotomía Sobrecrecimiento bacteriano Citoprotección Probióticos/prebióticos Ácido ursodesoxicólico Disbalance de citoquinas Incremento de citoquinas proinflamatorias Pentoxifilina Apoptosis Incremento de la apoptosis Inhibidores de las caspasas

20 20 Actividades. Claves de Respuesta 1. c) Obesos 56 al 86% b) Hispanos 45% a) Sajones 24 al 33% d) Normopeso 16% 2. a 3. e 4. d 5. b Referencias Arroyo V. Advances in the Therapy of Liver Diseases. Ars Medica 2007 Brunt E; Janney C; DiBisceglie A y col. Nonalcoholic Steatohepatitis: A proposal for grading and staging the histological lesions. Am J. Gastroenterol 1999; 94: Brunt E; Kleiner D; Wilson L; Unalp A; Behling C; Lavine J; Brent A. Neuschwander-Tetri, and the NASH Clinical Research Network. Portal Chronic Inflammation in Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD): A Histologic Marker of Advanced HGNA Clinicopathologic Correlations from the Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network. Hepatology 2009; 49: Brunt E. Non alcoholic fatty liver disease: what s new under the microscope? Gut 2011;60(8): Clinics in Livers Disease, Nonalcoholic Fatty Liver Disease, Arun J. Sanyal, 2004; 8 (3): Day C; James O. Steatohepatitis: a tale of two "hits"? Gastroenterology 1998;114:842-5 Fassio E; Schroder T. Consenso Argentino de Hepatitis C. Asociación Argentina para el estudio de las enfermedades del Hígado. 2007, Buenos Aires, Argentina Farrell G; Larter C. Nonalcoholic Fatty Liver Disease: From Steatosis to Cirrhosis. Hepatology 2006; 43 (2): S99-S112 Kucharczyk Mariana, Solari Joaquín, Tarzian Carlos, Galdame Omar, Bandi Juan Carlos, Gadano Adrián, García Mónaco Ricardo. Elastometría transicional: Medición no invasiva de la fibrosis hepática. Reporte de casos en Argentina Acta Gastroenterol Latinoam 2012; 42: Ludwing J; Viggiano TR; McGill D; Oh B. Nonalcoholic steatohepatitis: Mayo Clinic experiences with a hitherto unnamed disease. Mayo Clin Proc 1980;55: Silva M. AEEHH. Marcadores de fibrosis no invasivos: Marcadores séricos y elastografía. Unidad de Hígado y Transplante Hepático. Hospital Universitario Austral Syn W; Choi S; Diehl A. Apoptosis and Cytokines in Nonalcoholic Steatohepatiti. Clin Liver Dis 2009; 13(4):