La tecnología de ADN recombinante se desarrolla en tres pasos: el aislamiento del gen de interés, la clonación y expresión de dicho gen, y la

Transcripción

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2 La tecnología de ADN recombinante se desarrolla en tres pasos: el aislamiento del gen de interés, la clonación y expresión de dicho gen, y la producción a gran escala de la proteína codificada por el gen.

3 El aislamiento de un gen Se aísla la proteína de la que se quiere obtener el gen e intentar determinar por medios químicos la secuencia de aminoácidos que la componían. Este proceso se denomina secuenciación de proteínas y a diferencia de la secuenciación de ADN es técnicamente muy complicado. Si la proteína es suficientemente pequeña puede ser secuenciada en su totalidad d y esta información, ió gracias al código genético, era utilizada para sintetizar químicamente el gen.

4 Para proteínas de tamaño medio o grande lo que se hacía era secuenciar solamente una pequeña parte de la proteína y, utilizando también el código genético, fabricar una cadena de ADN de 15 ó 20 nucleótidos que era complementaria a una de las cadenas del gen o al ARNm correspondiente. Esta corta cadena de nucleótidos se marcaba radiactivamente o por fluorescencia y se utilizaba como sonda para identificar el gen completo o el ARNm completo que llevan la información para sintetizar la proteína de interés. En el caso de que hayamos localizado el ARNm tenemos que convertirlo en ADN. Este proceso se hace mediante la enzima llamada transcriptasa inversa. La cadena de ADN obtenida utilizando la información de un ARNm se llama ADN complementario o abreviadamente ADNc.

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6 Las enzimas de restricción(conocidas también como endonucleasas) tienen como función cortar las hebras de ADN. Se podría decir que son tijeras moleculares que cortan ADN. Lo hacen en forma específica. Es decir, que reconoce una secuencia particular de nucleótidos.

7 Existen 3 tipos de enzimas de restricción: Tipo I y Tipo III: Tienen actividad de restricción y modificación. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen. Necesitan ATP para moverse desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

8 Tipo II: Sólo tienen actividad de restricción. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. No necesitan ATP.

9 Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej: Eco RI E = género Escherichia co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

10 Acorde a como realizan el corte, las enzimas se pueden clasificar en: --Enzimas que generan extremos romos (No tienen bases desapareadas) --Enzimas que generan extremos cohesivos (Contienen bases desapareadas)

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14 ROMPER LAS CELULAS SEPARAR EL ADN CONCENTRAR Y FRAGMENTAR EL ADN AISLAR EL ADN AÑADIR REGULADORES DE LA EXPRESION GENICA, SI SE VA A EXPRESAR EL ADN

15 Un vector es una molécula de ADN de tamaño pequeño fácil de aislar y caracterizar, de fácil introducción en la célula anfitriona y una vez allí con capacidad de replicación autónoma

16 Pueden clasificarse según varios criterios como: *Su procedencia procariótica o eucariótica. *El tipo de molécula a partir de la que se preparan: -Plásmidos: bacterianos, levaduras o de plantas. -Virus: que infectan bacterias (bacteriófagos o solo fagos), plantas, invertebrados o vertebrados. -Cromosomas artificiales: derivados de elementos cromosómicos de fagos (pacs), de bacterias (BACs) o de levaduras (YACs). -Quimeras, es decir, moléculas formadas combinando partes de otras cuyo origen es diferente. Normalmente quimeras de plasmados y fago. *El tipo de célula anfitriona en la que el DNA recombinante resultante, se puede incorporar. *El gen de resistencia que contiene el vector para su posterior detección o selección. *El tamaño del DNA que admiten como inserto.

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18 Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente.

19 Transformación. Se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos. La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma.

20 Consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.

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22 Son moléculas de DNA de doble hebra, de pequeño tamaño y forma circular, presentes en forma libre en el citosol de muchas bacterias y de algunos eucariotas unicelulares. Son fáciles de purificar y a partir del cultivo bacteriano. Permiten la incorporación de insertos de DNA de un tamaño máximo de unas 10kb

23 El DNA del bacteriófago contiene en sus extremos secuencias de 12 nucleótidos complementarios entre si llamados sitios cos, responsables de su circulación y encapcidación ió (Proceso por el que el ácido nucleico de un virus queda recubierto en una cápsida)

24 Son vectores sintéticos, quimeras que combinan características de plásmidos y fagos para combinar las ventajas de ambos tipos de vectores

25 Características ideales de un huésped: - rápido crecimiento - no dañino o patogénico - estable en cultivo

26 Con frecuencia, las células anfitrionas son procarióticas, principalmente cepas de E-coli por ser fáciles de obtener, manipular, multiplicar li y conocer su genética.

27 La membrana plasmática muestra una permeabilidad selectiva y no admite grandes fragmentos de rdna, se acude a diversos métodos para facilitar su captación por alteración transitoria de la permeabilidad celular o introducir el rdna directamente

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31 4- La localización celular de la proteína a expresar. 5- Cuando se pretende que el gen se exprese a alto nivel, se suele escoger un plásmido de control relajado, es decir, con gran número de copias, mientras que si interesa un nivel bajo de expresión se escoge un plásmido de control estricto, con poco número de copias.

32 La construcción de un vector de expresión requiere la consideración de varios elementos con el fin de asegurar mayores niveles de producción proteica. El mismo debe poseer un promotor fuerte, ser fácilmente transferible con el fin de evaluar la producción proteica. Debe incluirse factores de terminación de la transcripción, pues éstos protegen el ARN mensajero (ARNm) de degradación exonucleotídica, extendiendo la vida media del mismo. El sitio de unión al ribosoma. La secuencia Shine-Dalgano interactúa tú con el extremo 3 del ARN ribosómico i 16 S durante el inicio de la traducción, siendo la distancia adecuada para lograr eficiencia de la traducción. Número de copias del plásmido, determinado por el origen de replicación, debido a que en algunos casos. plásmidos con elevado número de copia dan alta eficiencia de proteína expresada.

33 Un vector de expresión incluye las secuencias apropiadas para la transcripción y la traducción en la célula huésped Los vectores de expresión pueden convertir las células en fábricas de proteínas, como insulina, hormona del crecimiento, pigmentación en las plantas, etc Un vector de expresión permite que se exprese un gen extraño en una célula huésped.

34 Vectores de expresión en plantas Combinaciones de elementos genéticos 5-3 e intrones que mejoran la expresión en plantas transgénicas. Los elementos están asociados con un gen defructosa 1,6- bisfosfatasa. un gen de proteína de unión de clorofila a/b. un gen de ubiquitina un gen de nopalina sintetasa.