Marta Hergueta Redondo Dic

Transcripción

1 Perfil de expresión genética en el carcinoma no microcítico de pulmón: utilidad de las biopsias endoscópicas, correlación con la histología y predicción pronóstica en pacientes operables. FIS 04/2641 Marta Hergueta Redondo Dic

2 Objetivo principal del proyecto Metodología de trabajo de microarrays Ejemplos aplicaciones en pulmón Resultados

3 OBJETIVO PRINCIPAL Analizar los perfiles de expresión génica de carcinomas de pulmón no microcítico operables ( biopsias endobronquiales y piezas quirúrgicas) ) mediante microarrays de oligonucleótidos de genoma humano completo. Ajustar un modelo multidimensional con la información molecular obtenida de los perfiles de expresión y la información clínica para predecir niveles de TLE y supervivencia.

4 Principales alteraciones genético-moleculares p53 RB LOH 3p CPM CPNM CPM CPNM SCC ADC p53(mutación) 80% 50% RB (inactivación) % 30% K-ras (mutación) 1% 20% * 30% EGFR (sobreexpresión) 0% 60% 70% 40% HER-2/ neu (sobreexpresión) 0% 30% 25% * p16 INK4 (inactivación) 0-10% 70% P27 (inactivación) 100% 70% FHIT (delecciones) 80% 40% RASSFA1 (metilación) 100% 30-40%

5 Aplicación de la genómica funcional al cáncer Un alto porcentaje de los genes descubiertos son de función desconocida Genómica funcional: Asignar función a cada uno de los genes de un organismo y hacerlo mediante análisis sistemáticos a gran escala ARRAYS EXPRESIÓN variaciones en la expresión de miles de genes de forma simultánea CITACIONES DESDE Citaciones encontradas en MEDLINE por 'microarray' (amarillo, 396) o por 'microarray+cancer (rojo, 1325).

6 MICROARRAYS Definición Tipos Ventajas y desventajas Metodología: Diseño y fabricación de un microarray Hibridación de las muestras Procesamiento de datos

7 cdna / Oligo - microarrays Sondas de DNA inmovilizadas y ordenadas espacialmente en superficies planas (cristales). - + Sondas: oligonucleótidos Productos de PCR: cdna

8 MICROARRAYS Formato miniaturizado Impresión ordenada de cientos o miles de genes en un formato estándar que consiste en un porta convencional similar al utilizado para inmunohistoquímica.

9 SONDAS: cdna, oligos GEN 1 GEN 2 GEN 3 cdna (fragmentos de DNA de pdb ) Oligonucleótidos (fragmentos de DNA de pdb )

10 PLATAFORMAS DE ARRAYS DE cdna/oligos Arrays Oligonucleotidos Alta densidad Alta especificidad Requiere poca cantidad de muestra Perfil de expresión y alteraciones genéticas/polimorfismos Alto coste cdna Arrays Baja densidad Hibridación cruzada no puede ser determinada Requiere gran cantidad de muestra Mayoritariamente perfil de expresión Bajo coste Difícil de realizar, petición de oligos Poca flexibilidad Arrays de propia generación Alta flexibilidad

11 VENTAJAS DE LAS NUEVAS TECNOLOGÍAS : MICROARRAYS DE cdna /OLIGOS Los métodos tradicionales sólo permiten el análisis de expresión simultáneo de un número de genes reducido (1-10), insuficiente para entender un escenario biológico complejo donde la activación génica es mucho mayor. Los Microarrays permiten la integración e inmovilización, ordenada y conocida, de una alta densidad de material biológico (genoma completo)

12 Metodología Diseño y fabricación de un microarray Preparación de la muestras Hibridación Competitiva Escaneado y obtención de datos Análisis de los datos

13 Diseño y fabricación de un microarray ARRAYER Cristal Colección de genes blanco p53 K-ras RB Cada círculo contiene el cdna / oligo de un gen Siembra de ng generando spots de entre μm diámetro.

14 PREPARACION DE LAS MUESTRAS EXTRACCIÓN ARN T (ARNm 1%) mrna AAAAA TTTTTT PROMOTOR RT mrna AAAAA TTTTTT PROMOTOR RT Hibridación con poly( dt) T7P Cy3 Cy3 cdna T7P Cy5 Cy5 cdna cdna (Retrotranscripción inversa) AMPLIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS MARCAJE CON FLUOROCROMOS A A

15 Tipos de Hibridación HIBRIDACIÓN COMPETITIVA Agilent HIBRIDACIÓN NO COMPETITIVA Affymetrix

16 HIBRIDACION COMPETITIVA DE LAS MUESTRAS HIBRIDACIÓN Cy3 COMPETITIVA REFERENCIA TUMOR Cy5 ARNm Marcaje cdna -marcado

17 HIBRIDACIÓN 1) Marcaje fluorescente referencia tumoral A B C A B C 2) Hibridación 3) Cuantificación y análisis del resultado A 1,8 cm B A B C C

18 ESCANEADO DEL MICROARRAY láser 1 láser 2 Cy3 Cy5 EMISION

19 PROCESAMIENTO DE LA IMAGEN Puntos VERDES representan genes downregulados en el tumor Cy5 Cy3 Puntos AMARILLOS representan genes no modificados Puntos ROJOS representan genes sobreexpresados en el tumor

20 TRANSFORMANDO IMÁGENES EN DATOS Análisis: GenePixPro 6.0 Intensidad: nivel de expresión Muestra problema marcada con rojo (Cy5) Muestra de referencia marcada con verde(cy3) Rojo Verde = Ratio de expresión 2 = 2x sobre-expresado 0.5 = 2x downregulado

21 RATIOS DE EXPRESIÓN ARRAYS /CASOS GENES

22 COMPARACIÓN DE VARIAS MUESTRAS RESULTADOS RDC-1: (A,1) Genes Código de colores según el nivel de expresión Muestras Perfil de expresión transcripcional

23 PROCESAMIENTO DE DATOS Array Escaneado, Procesamiento imágen Normalización DNMAD Selección de genes GEPAS CLUSTERING No Supervisado Clasificación muestras Supervisado Expresión diferencial: predictor

24 PROCESAMIENTO DE DATOS Array Escaneado, Procesamiento imágen Normalización DNMAD

25 Normalización Hay muchas fuentes de error que pueden afectar seriamente a la interpretación de los resultados. Diferencias en la eficiencia de hibridación, marcaje, efectos locales, etc. La Normalización de los datos es un paso necesario antes al procesamiento y análisis. BoxPlots

26 PREPROCESADO DE DATOS Array Escaneado, Procesamiento imágen Normalización DNMAD Selección de genes GEPAS

27 Rojo/verde: ratio de expresión 2 = 2x sobre-expresado 0.5 = 2x downregulado 1. Transformación logarítmica en base 2 log rojo/verde: log ratio 1 = 2x sobre-expresado -1 = 2x downregulado 2. Quitar replicados 3. Fusionar duplicados que existan tomando como único valor resultante la media de todos ellos para cada condición. 4. Eliminar los genes de los que se disponga menos del 70% de los datos. 5. Imputar valores desconocidos utilizando los 15 registros más parecidos (KNN). 6. Filtrar aquellos registros en los que no se observa una diferencia de +/1.0 para cada condición experimental, tratándose de registros con un perfil plano. 7. Filtrar genes desconocidos

28 PROCESAMIENTO DE DATOS Array Escaneado, Procesamiento imágen Normalización DNMAD Selección de genes GEPAS CLUSTERING No Supervisado Clasificación muestras PERFIL DE EXPRESIÓN Supervisado Expresión diferencial: FIRMA MOLECULAR

29 APLICACIÓN DE MICROARRAYS EN PULMON CLASIFICACIÓN N MOLECULAR DE LOS TUMORES : DESCUBRIMIENTO DE CLASES Estudio de la existencia de nuevos subgrupos específicos definidos según su patrón de expresión. Heterogeneidad dentro de un mismo tipo tumorales PREDICCIÓN N DE CLASES (RESPUESTA A TRATAMIENTO, METASTASIS) Estudio comparativo de clases predefinidas basando en el perfil de expresión diferencial de genes previamente seleccionados: PREDICTOR Aplicado al análisis de numerosas situaciones clínicas (diagnostico, ico, selección del tratamiento)

31 48 SCC, 9 AD, 30 normales Oncogene, 2005 Down en SCC Different en SCC Up en SCC SCC-B: adhesión, invasión, metástasis SCC-A: transducción de señales Clustering supervisado 432 genes Entre SCC-A, y SCC-B no existe una correlación significativa con ningún parámetro clínico-patológico, incluyendo estadios y grado de diferenciación tumoral

32 72 muestras PNAS, 2001 CLUSTERS: Group 1: 19 casos Grado 2 Group 2: 7 casos Grado 2-3 Group 3: 9 casos Grado 3 A genes modificados con respecto a la referencia B.- Genes marcados por su implicación en AD Se definen 3 grupos de adenocarcinomas, cuyo perfil de expresión se puede correlacionar con grado de diferenciación tumoral y supervivencia

34 Cancer Res., 2002 NSCLC: 39 Lobectomías parciales o totales 2899 genes se encontraron modificados al menos 2 veces en >80% de las muestras. Análisis estadístico: firma molecular asociada a recaída (>1 año) local y/o metástasis. Perfil génico sin recidiva (15 muestras): -up Cluster A - down Cluster B y Cluster C Perfil génico recidiva local /distancia (24 muestras): - down Cluster A - up Cluster B y Cluster C

35 APLICABILIDAD EN MUESTRAS NO QUIRURGICAS Clin. Cancer Res., FNAs: únicamente de 17 se obtuvo material necesario para el análisis de expresión : 17 FNAs / 17 tej. nomal / 17 tej. Tumoral La mayoría de las FNAs muestran un perfil de expresión similar a la muestra tumoral El perfil de expresión de FNAs de NSCLC puede determinar malignidad, y podrá ser utilizado como método alternativo a la muestra quirúrgica PCA PCA

36 Perfil de expresión génica en carcinoma no microcítico de pulmón: Utilidad de las biopsias endoscópicas Correlación con la histología Predicción pronostica en pacientes operables Metodología Resultados

37 Objetivo principal PERFILES EXPRESIÓN 200 pacientes (230 muestras) 30 pacientes muestra quirúrgica vs. muestra endoscópica

38 METODOLOGÍA A SEGUIR Marcaje cdna e HIBIRIDIZACION ADQUISICION MUESTRA EXTRACCION RNA TOTAL ANALISIS SUPERVISADO ANALISIS NO SUPERVISADO Expresión diferencial entre dos o más clases Predictor de clases

39 METODOLOGÍA A SEGUIR Marcaje cdna e HIBIRIDIZACION ADQUISICION MUESTRA EXTRACCION RNA TOTAL ANALISIS SUPERVISADO ANALISIS NO SUPERVISADO Expresión diferencial entre dos o más clases Predictor de clases

40 Extracción del RNA total Cantidad Calidad

41 RNA CANTIDAD Cantidad mínima necesaria para hibridar con microarrays (Agilent( (500 ng ARN total)) Caso con T < 50% Caso con T > 50%

42 RNA CALIDAD 28 S 28 S 18 S 18 S Buena calidad Degradado MUESTRAS CONTROLES MARC P11, P12, P13, P13b, P14a, P14b,P14c, P15a, P15b M14, M12-1, M31, M77, M5

43 1 Agilent Bioanalyzer 2100 RNA CALIDAD Fluorescence S 28 S S 28S Time (seconds) Análisis de 1μl de muestra Nivel de detección: picogramos Proceso completo: 30 minutos (12 muestras) F luorescence S 4-28S Time (seconds)

44 METODOLOGÍA A SEGUIR Amplificación / marcaje e HIBIRIDIZACION ADQUISICION MUESTRA EXTRACCION RNA TOTAL ANALISIS SUPERVISADO 27 muestras Expresión diferencial entre dos o más RNA clases suficiente en 13 8 no degradadas Predictor de clases ANALISIS NO SUPERVISADO 8 muestras no degradadas 6 tenían T> 50%

45 Resultados-Hibridación

46 AGRADECIMIENTOS Hospital 12 de Octubre Hospital Severo Ochoa Grupo de Cáncer mamario y ginecológico del CNIO Banco de Tumores