Manual de Técnicas y Procedimientos

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1 Manual de Técnicas y Procedimientos Año 2014 Cátedra I de Anatomía Humana Normal e Imagenología Anatomía del Desarrollo- 1

2 Índice Técnica 1 para deshidratación de embriones pequeños Menos de 10 mm CR 1 Fijación en formol neutro 2 Alcohol 50º 20 min (cuanto más pequeño, más bajo el primer alcohol) 3 Añadir unas gotas de 60º y luego poco a poco se pasa a 60º 25 min 4 70º gota a gota y luego 70º 30 min. 5 80º gota a gota y luego 80º 35 min 6 90º gota a gota y luego 90º 40 min 7 96º gota a gota y luego 96º 50 min 8 100º gota a gota y luego 100º 60 min 9 100º gota a gota y luego 100º 30 min º gota a gota y luego 100º 30 min 11 Xilol 30 min 12 Xilol 60 min 13 Xilol 30 min 14 Parafina (57º - 60º fusión) 15 Parafina II 2,5 hs. 16 Parafina III Técnica 2 para deshidratación de embriones pequeños Pasos Material Tiempo 1 Alcohol 50% 1 hora 2 Alcohol 60% 1 hora 3 Alcohol 70% 1 hora 4 Alcohol 80% 30 min 5 Alcohol 90% 30 min 6 Alcohol 100% Se puede dejar unas horas 7 3 o 4 días Butanol Sólo horas si el embrión es muy pequeño. Cambiar 3 o 4 butanoles. 8 Parafina 2 horas y 30 min. Cátedra I de Anatomía Humana Normal e Imagenología Anatomía del Desarrollo- 2

5 80º gota a gota y luego 80º 35 min 6 90º gota a gota y luego 90º 40 min 7 96º gota a gota y luego 96º 50 min 8 100º gota a gota y luego 100º 60 min 9 100º gota a gota y luego 100º 30 min 10 100º

3 Mezcla descalcificadora Embriones de más de 30 mm CR Solución Cantidad Hidrato de cloral 1 g Mezcla descalcificadora Formol 15% 60 cm 3 Acido Nítrico 5 cm 3 Alcohol 96º 40 cm 3 1 Colocar en mezcla descalcificadora hasta que se ablande la 3 a 7 días pieza 2 Bicarbonato de Sodio 5% 1 día 3 Lavado en agua y seguir luego el proceso normal Tratamiento de cabeza de feto de 144 mm CR * Practicado en el Laboratorio del Prof. Orts Llorca 1 Fijación en formol al 10%. 2 Descalcificación en solución de: ácido tricloroacético 5% formol 10% 34 días 3 Alcohol 96% 4 días 4 Butanol 1 6 días 5 Butanol 2 13 días 6 Butanol 3 7 días 7 Parafina 1 8 días 8 Parafina 2 8 días 9 Parafina 3 1 día 10 Inclusión 11 Cortes con micrótomo de deslizamiento a 15 y 10 micras Técnica de Bielchovsky para cabeza de embrión de pollo 1 Piridina 4 días 2 Agua corriente 1 día 3 Agua destilada 1 día 4 Nitrato de Plata al 3% 5 días 5 Lavado en agua destilada mientras se prepara la plata amoniacal 6 Plata amoniacal 1 día 7 Formol Neutro al 10% 1 día 8 Lavado en agua 9 Deshidratación e inclusión Cátedra I de Anatomía Humana Normal e Imagenología Anatomía del Desarrollo- 3

el Laboratorio del Prof. Orts Llorca 1 Fijación en formol al 10%.

4 Técnica 1. Descalcificación para inclusión 5 ml de formol al 40% Renovar cada 2 1 Fijación en solución de: 10 ml de Ácido Nítrico D=1,41 o 3 días de Agua destilada 2 Controlar la descalcificación con: Solución de oxalato sódico o amoniaco al 5%. A 5 ml exactos del descalcificante neutralizar con hidroxido de sodio 2N frente 3 4 a solución de fenolftaleina. A 5 ml de descalcificante añadir NaOH 2N en cantidad determinada por el procedimiento de neutralización y de ellos se toman 2 ml a los que se añade1 ml de oxalato sódico al 5% esperando 5 minutos. En tanto aparezca turbidez se sustituye el descalcificante 5 Lavar, una vez descalcificada, en agua corriente 30 minutos 6 Pasar por solución de sulfato de sodio al 5% 12 horas 7 Lavar en agua corriente 24 horas 8 Deshidratar según los siguientes parámetros 9 30º 12 hs 10 40º 12 hs 11 50º 12 hs 12 60º 12 hs 13 70º 12 hs 14 80º 24 hs 15 90º 12 hs 16 90º 12 hs (repetido) º 24 hs º 24 hs º 12 hs 20 Incluir en parafina Técnica 2. Descalcificación de embriones de más de 30 mm o fetos Sustancia Cantidad Hidrato Cloral 1 g Formula 1º variante Formol al 15% 60 ml Ácido Nítrico 5 ml Alcohol 96º 40 ml Formula 2º variante Formol al 15% 95 ml Ácido Nítrico 5 ml 1 Colocar la pieza fijada en el descalcificador controlando con aguja en las partes óseas accesibles Cambiar el líquido cada dos días 2 Lavado en sol. de bicarbonato de sodio al 5% 24 hs Nota: Lavar mucho en agua destilada para que se pierda el amarillo en los cortes de parafina (después de desparafinar). Cátedra I de Anatomía Humana Normal e Imagenología Anatomía del Desarrollo- 4

de oxalato sódico o amoniaco al 5%. A 5 ml exactos del descalcificante neutralizar con hidroxido de sodio 2N frente 3 4 a solución de fenolftaleina.

5 Técnica para quitar el aire en embriones mayores Previo a la aclaración con benxol o xilol los embriones (luego del alcohol absoluto) deben sumergirse en benzoato de metilo con 1% de celoidina. Al contener aire al embrión flota y luego de un tiempo variable se hunde en el líquido. No dejarlo demasiado porque lo reseca y pasarlo al Benzol o Xilol (menos tiempo que el normal). Soluciones. Fórmulas Preparación del formol neutro. Solución de formol oficinal puro con carbonato de magnesio a saturación o creta. Alcoholes 50º Agua destilada 48 ml 60º Agua destilada 38,4 ml 70º Agua destilada 28,8 ml 80º Agua destilada 19,2 ml 90º Agua destilada 9 ml Preparación del carbol-xilol (10% de fenol en Xilol) Fenol 10 ml Xilol Fijadores utilizados Alcohol 100º Cloroformo Ac. Acético Sos. Acido pícrico a saturación Formol al 40% Ácido Acético Fijador de Carnoy Fijador de Bouin 12 vol. 6 vol. 2 vol. 15 vol (150 ml) 4 vol (40 ml) 1 vol (10 ml) Fijador de Rossman (Optimo para el PAS) Alcohol de 90º saturado de ácido pícrico 8 vol Formol (Merck) 1.5 vol Procedimiento: Ambos componentes se enfrían en frigorífico a unos 7ºC. Se mezclan en el momento de usarlos. La fijación se inicia en frío (7ºC) durante 6 o 7 hs. Después de 12 hs a temperatura ambiente. Luego: alcohol 95º; 100º; Benzol. Cátedra I de Anatomía Humana Normal e Imagenología Anatomía del Desarrollo- 5

Fórmulas Preparación del formol neutro. Solución de formol oficinal puro con carbonato de magnesio a saturación o creta.

6 Método de Born Para determinar el espesor de las láminas de cera multiplicar el aumento del dibujo por el espesor de micras del corte. Ejemplo: 125 aumentos x 8 micras = 1000 micras = 1 mm. El aumento del dibujo o proyección se determina por la cámara con la rejilla especial o por la colación en el lugar del porta de un papel milimetrado cuando falta la primera. Hacer fabricar flejes de bronce de 0, 5, 1, 1.5 y 2 mm. Elementos necesarios: Plancha de hierro fundido. Rodillo de acero y tener gas suficiente. También cucharones para el volcado y espátulas tipo pintor de tamaño diverso. Lugar amplio. Cátedra I de Anatomía Humana Normal e Imagenología Anatomía del Desarrollo- 6

El aumento del dibujo o proyección se determina por la cámara con la rejilla especial o por la colación en el lugar del porta de un papel milimetrado cuando falta la

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