FRECUENCIA DE Streptococcus mutans Y Streptococcus sobrinus EN NIÑOS DE 4 A 6 AÑOS DE EDAD Y SU RELACIÓN CON EL ÍNDICE ceod.

Transcripción

1 UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE ODONTOLOGÍA FRECUENCIA DE Streptococcus mutans Y Streptococcus sobrinus EN NIÑOS DE 4 A 6 AÑOS DE EDAD Y SU RELACIÓN CON EL ÍNDICE ceod. MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE CIRUJANO DENTISTA JUAN LUNA ALVAREZ PROFESOR GUÍA: CARLOS PADILLA ESPINOZA TALCA-CHILE 2004

2 Dedicada a mi abuela Yolanda Brizuela Godoy y a mi madre Gloria Álvarez Brizuela, por ser las personas más importantes en mi vida y a quienes debo todo. A ellas dos, que han sido pilares fundamentales en mi formación valórica y estudiantil, por sus cuidados y entrega incondicional...por ser mis dos grandes amores. A mis compadres Pilar Álvarez y Luis Parada, por apoyarme y regalarme la alegría y la dicha de mis tres sobrinos: Mauricio, Diego y Alex. A mi familia en general, y en especialmente a mi tía Angélica Álvarez, por tener siempre la voluntad de ayudarme en momentos buenos o malos. A mis buenos amigos Gustavo Henríquez, Eric Jara y Freddy Salgado, los que me han regalado su amistad incondicional.

3 Mis agradecimientos a: Mi abuela Yolanda Brizuela y mi madre Gloria Álvarez... por ayudarme a cumplir mis sueños. Al profesor Carlos Padilla Espinoza, por su enorme disposición, compromiso con los alumnos y entrega a la investigación. A todo el personal del Laboratorio de Investigación Microbiológica de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Talca, por hacer más grata la realización de este trabajo. A la Banda Municipal de la ciudad de Cauquenes, y en especial a su Director Sr. Juan Carlos Álvarez B., por facilitar mi trabajo en dicha banda, y con ello permitir costear mis estudios sin ningún tipo de inconveniente. A la empresa Colgate, por regalar productos dentales a los niños que participaron en este estudio y por apoyar iniciativas como ésta.

4 1. INTRODUCCIÓN La cavidad bucal contiene una de las más concentradas y variadas poblaciones microbianas del organismo. Particularmente un gran número de éstos son encontrados en el dorso de la lengua, alrededor del surco gingival y en la superficie dentaria. Existen numerosas evidencias que han permitido demostrar que la placa dental es un prerrequisito indispensable para la iniciación de la caries. La caries dental es una enfermedad infecto-contagiosa con una etiología multifactorial que incluye la susceptibilidad del huésped, la dieta y los microorganismos cariogénicos. Estos últimos juegan un rol importante como agentes causales; sin cuya presencia no podría desarrollarse dicha infección. La mayor parte de los estudios epidemiológicos han demostrado que Streptococcus mutans es el más estrechamente vinculado con la caries dental (Seif, T.; et al., 1997). Se han descrito varios biotipos de Streptococcus mutans, cuya frecuencia varía según la región geográfica (Linossier, A.; et al., 1986). Dos especies de Streptococcus mutans son las más comúnmente aisladas desde muestras salivales humanas: Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus (Hirasawa. M.; Takada, K. 2001). Algunos estudios (Köhler, B.; Bjarnason, S. 1987; Lindquist, B.; Emilson, C. 1991; Babaahmady, K.; et al. 1998) han mostrado que el Streptococcus sobrinus puede ser aislado frecuentemente desde muestras de sujetos con caries grandes y desde muestras de sujetos con caries pequeñas, y sugieren que el Streptococcus sobrinus es importante en el desarrollo de la caries dental, junto con el Streptococcus mutans. Entre los factores de riesgo que se pueden analizar y evaluar con metodología científica se encuentra el análisis bacteriológico. El diagnóstico microbiológico está encaminado a evaluar el grado de infección por Streptococcus mutans con cultivos de muestras de saliva. Varios autores han visto una asociación positiva entre el recuento microbiológico y la historia clínica de caries a través del índice COPD (Gispert, A.; Ribero, L. 2000; Rojas, A.; Linossier, A. 1998; Brambilla, E.; et al. 1999; Gabris, K.; et al. 1999), otros autores han visto una relación positiva entre el recuento microbiológico y el consumo de hidratos de carbono (Fujiwara, T.; Hocino, T. 2002;

5 Zhu, M.; Takenada, S. 2001), sugiriendo que los cultivos de Streptococcus mutans potencialmente servirán no sólo como predictores de caries sino que además, como indicador del consumo de hidratos de carbono. Si bien, existen trabajos en donde se relaciona al género Streptococcus mutans con la historia de caries, medida a través del índice COPD (Moltzfeld, R.; Linossier, A. 1994), no existe evidencia del Streptococcus sobrinus en relación con el índice ceod. De esta forma se pretende elucidar la relación existente entre miembros de la especie Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus, en muestras salivales de pacientes pediátricos con un índice ceod bajo y alto, permitiendo establecer la participación de ambas bacterias cariogénicas en niños con diferentes índices ceod. En el contexto enunciado, el objetivo de este estudio es determinar la relación existente entre el Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus y su relación con la prevalencia de caries medida a través del índice ceod en niños entre 4 y 6 años de edad de la escuela Aníbal Pinto de la ciudad de Cauquenes, Chile.

6 2. HIPÓTESIS Streptococcus sobrinus en asociación con Streptococcus mutans aumentan el riesgo cariogénico en niños de entre 4 y 6 años.

7 3. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL: Determinar el recuento bacteriano de Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus en niños de entre 4 y 6 años y relacionarlos con sus respectivos índices ceod. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1. Determinar el índice ceod en 60 niños entre 4 y 6 años. 2. Estandarizar un medio de cultivo selectivo para Streptococcus sobrinus. 3. Realizar toma de muestra salival en 60 niños entre 4 y 6 años. 4. Cultivar la saliva en medios bacteriológicos selectivos para S. mutans y S. sobrinus. 5. Comparar el recuento bacteriano de S. mutans y S. sobrinus en niños con un índice ceod alto y bajo. 6. Identificar mediante procedimientos de PCR las cepas de S. mutans y S. sobrinus. 7. Analizar estadísticamente los resultados obtenidos.

8 4. REVISION BIBLIOGRAFICA Historia de la caries La leyenda del gusano es la más antigua explicación que se tiene para la caries dental, en ella se atribuía a los gusanos la destrucción del diente y el dolor de muelas. Esta teoría fue recogida en una leyenda asiria en el siglo VII a.c. La idea de que la caries la originaba un gusano fue una creencia casi universal, y tuvo vigencia hasta el siglo XIX (Liébana, J.; 1997). Lo concreto, es que en términos prácticos la caries disminuye a medida que la especie humana retrocede en el tiempo. La caries aparece entonces significativamente cuando el hombre comienza a agruparse socialmente con el consiguiente desarrollo de comunidades. En las grandes civilizaciones antiguas (Babilonia, Egipto, Grecia) junto a nuevos cambios de hábitos y esplendor cultural se produce una gran velocidad de crecimiento y expansión de la caries, situación que casi sin modificaciones se mantiene hasta nuestros días (Brown, P.; et al. 1991). En 1880 W. Miller, químico estadounidense, también titulado de Cirujano Dentista en la Universidad de Filadelfia, trabaja junto a Robert Koch, y se convierte en el primer microbiólogo dental.

9 Miller postula la teoría quimioparasitaria, en donde la producción de ácidos por los microorganismos que fermentan los carbohidratos en la boca, causarían la disolución de esmalte y provocarían la lesión inicial. Esta hipótesis la sustentó experimentalmente al aislar varios grupos de microorganismos orales que eran cariogénicos. Sus resultados experimentales indicaron que un simple grupo o especie microbiana podía ser responsable de la caries. Sin embargo, otras teorías desplazaron esta postulación por varias décadas hasta que las reiteradas evidencias experimentales sustentaron definitivamente los postulados de Miller respecto a una etiología infecciosa múltiple. Paul Keyes (1960) fue quien en forma teórica y experimental estableció sólidamente que la etiopatogenia de la caries obedece a la interacción simultánea de tres elementos o factores principales: un factor microbiano que bajo la presencia adecuada de un factor sustrato logra afectar a un factor diente o huésped. La representación esquemática de estos tres factores básicos se conoce como Triada de Keyes. La interacción simultánea (superposición de los círculos) entre los tres parámetros constituyen, según Keyes, las bases fundamentales que gatillan el mecanismo de acción determinante del desarrollo de caries (Brown, P.; et al. 1991). Etiopatogenia de la caries Desde el nacimiento del individuo la cavidad bucal se encuentra expuesta a numerosos microorganismos presentes en el medio ambiente local. Estos microorganismos comienzan a establecerse en la cavidad bucal favorecidos por las condiciones nutricionales y fisiológicos allí presentes (microflora bucal). Esta colonización compromete los tejidos blandos (mucosa oral) y los tejidos duros (dientes). La microflora bucal que coloniza la superficie dentaria recibe el nombre de Placa Bacteriana (PB). Según definición de la Organización Mundial de la Salud corresponde a: Una entidad bacteriana proliferante, enzimáticamente activa, que se adhiere firmemente a la superficie dentaria y que por su actividad bioquímica metabólica, ha sido propuesta como el agente etiológico principal en el desarrollo de caries y periodontopatías (Brown, P.; et al. 1991).

10 Esta placa bacteriana consta de una matriz extracelular compuesta de proteínas y polisacáridos (glucanos, fructanos) que son sintetizados por bacterias y favorecen el proceso carioso por constituir reservas energéticas y facilitar la congregación bacteriana (Seif, T.; et al. 1997). La formación de la placa dental es resultado de una serie de complejos procesos que involucran una variedad de componentes bacterianos y de la cavidad bucal del huésped. La formación de la película adquirida ocurre inmediatamente después de cepillarse los dientes, se depositan sobre la superficie dentaria, proteínas de origen salival y del fluido crevicular, por un proceso de absorción altamente selectivo y específico, formándose como resultado una película acelular con un alto contenido de grupos carboxilos y sulfatos que incrementan la carga negativa neta del esmalte. En el proceso de formación de la película son incorporadas a su superficie una serie de componentes de origen salival tales como enzimas Lizosimas, Peroxidasa y Amilasa, que pueden influenciar la colonización bacteriana sobre la película. Igualmente son incorporadas enzimas extracelulares de origen bacteriano e inmunoglobulinas (Seif, T.; 1997).

11 La colonización por microorganismos específicos ocurre luego de la formación de la película adquirida, ésta comienza a ser colonizada por microorganismos residentes de la cavidad bucal. Este proceso ha sido dividido en 4 etapas: Deposición: fase reversible en la que se producen interacciones de alto rango, generándose un acercamiento inicial de las bacterias a la superficie de la película. Adhesión: fase irreversible en la que se producen interacciones de corto rango, entre componentes tanto de la bacteria como del huésped. Algunos mecanismos propuestos para la adherencia son: Unión a través de Adhesinas, que son sustancias ligantes tipo lectinas, que están presentes en apéndices de la superficie bacteriana tales como las Fimbrias o Pili, especie de vellosidades que cubren a la bacteria. Otras adhesinas son los ácidos lipoteicoicos de las bacterias gram positivas. Además, algunas bacterias cuentan con la formación de Glicocalix, que es una cubierta bacteriana formada por cadenas de polisacáridos (Whitaker, C.; et al. 1996). Uniones a través de puentes de Calcio y Magnesio; unión por medio de polisacáridos extracelulares tipo Glucán y enzimas Glucosiltransferasas; unión por medio de fimbrias. Repetición de las fases 1 y 2: en esta fase la adherencia se realiza sobre una primera capa bacteriana ya establecida en la película de mecanismos de agregación. Crecimiento y Reproducción: el crecimiento y reproducción de los microorganismos adheridos a la película, permite conformar una capa confluente y madura generándose así la formación de un biofilm. El desprendimiento de células del biofilm permite la colonización de otros sitios (Seif, T.; 1997). La placa bacteriana (PB), ha sido estudiada por muchos autores y varía de acuerdo la edad de la placa y de la región dental que se analice, es decir, la PB formada luego de algunas horas presenta una composición porcentual diferente a una placa madura de varios días de formación. Así también las placas tomadas de distintas regiones suelen presentar diferencias aún bajo un mismo tiempo de formación. Por otra parte, los estudios publicados presentan diferencias debido a las técnicas empleadas, como de un individuo a otro dependiendo de la raza, localización, dieta, tipo de cultivo utilizado en el estudio, tiempo de incubación, recuento de colonias; sin embargo, todos han encontrado resultados similares destacando la gran cantidad de formas cocáceas del tipo Streptococcus, tanto a nivel de la placa bacteriana (tabla 1), donde los Estreptococos

12 facultativos están en mayor porcentaje; a nivel de la placa proximal el género Streptococcus se presenta en un quinto de la muestra, y a nivel de especies individuales el Streptococcus mutans se presenta como el segundo en cantidad de su género, sólo sobrepasado por el Streptococcus sanguis (tabla 2 y 3) (Brown, P.; et al. 1991; Whitaker, C.; et al. 1996). Tabla Nº1: Porcentaje de bacterias de la Placa Bacteriana (Brown, P.; et al. 1991). Estreptococos facultativos Difteroides facultativos Difteroides aerobios Peptoestreptococcus sp. Veillonella sp. Bacteroides sp. Fusobacterias Neisserias sp. Vibrio sp. 27% 23% 18% 13% 6% 4% 4% 3% 2% Tabla Nº2: Porcentaje de bacterias en la cara Proximal (Whitaker, C.; et al. 1996). GENERO Streptococcus sp. Bacilos Gram positivos (preferentemente Actinomyces) Bacilos Gram negativos (preferentemente Bacteroides) Neisserias sp. Veillonella sp. Fusobacterias Rothia sp. Lactobacillus sp. 22,09% 42,07% 7,97% 1,48% 13,07% 0,39% 0,40% 0,47%

13 Tabla Nº2: continuación. ESPECIES INDIVIDUALES Streptococcus mutans Streptococcus sanguis Streptococcus salivarus Streptococcus milleri Actinoyces israelí Actinomyces viscosus 2,17% 5,9% 0,67% 0,51% 16,5% 19,05% Tabla Nº3: Distribución de la Placa bacteriana en corona y saliva (Whitaker, C.; et al. 1996). BACTERIAS PLACA CORONAL SALIVA Streptococcus salivarus <0,5 20% Streptococcus mitis 15 20% Streptococcus sanguis 15 8% Streptococcus mutans 0,5 <1% Enterococcus <0,1 <0,1% Filamentos Gram positivos 42 15% Lactobacillus <0,005 <1% Veillonella 2 10% Neisseria <0,5 <1% 5? Bacteroides oralis <1 <1% Bacteroides melaninogénicus Vibrio sputorum 1? Espiroquetas <0,1 <0,1% Fusobacterium 4 <1%

14 Streptococcus mutans Son cocos Gram (+), microaerófilos dispuestos en cadenas. Poseen una pared celular y una membrana plasmática que engloba su protoplasma. Para crecer y desarrollarse necesita de medios enriquecidos y cierto ambiente de anaerobiosis (Urzúa, I.; et al. 1999). Entre los polisacáridos más importantes sintetizados destaca el dextrano, polímero de glucosa que constituye una macromolécula glucídica altamente adherente que contribuye a las características adhesivas de la placa bacteriana (Brown, P.; et al. 1991). La mayor parte de los estudios epidemiológicos han demostrado que de este grupo, el Streptococcus mutans es el más estrechamente vinculado con la caries dental. Este microorganismo no es encontrado en la cavidad bucal antes de la erupción dentaria, debido a que requiere de la presencia de tejido duro, no descamativo para su colonización (Seif,T.; et al. 1997). Del grupo mutans, la especie más predominante en el mundo es la descrita originalmente como S. mutans (serotipos c, e y f ) que se encuentran en cerca del 90% de las personas que poseen S. mutans en su microbiota, mientras las especies S. sobrinus (serotipos d y g ) aparecen menos frecuentemente(linossier, A.; 1994). Características del grupo mutans: Es acidogénico (genera ácidos) es acidófilo (se desarrolla en medio ácido)y es acidúrico (sigue elaborando ácido a Ph bajo). A partir del metabolismo de la sacarosa, producen principalmente ácido láctico, el que interviene en el proceso de desmineralización del esmalte, un estudio realizado por Garca (1990) demostró que personas que consumen comidas azucaradas y que presentan un alto recuento de Streptococcus mutans presentaban una mayor prevalencia

15 de caries. Se describe además la producción de polisacáridos extracelulares a partir de sacarosa (Whitaker, C.; et al. 1996). Posee elementos proteicos que determinan fenómenos de adhesión, agregación y coagregación, como los antígenos I y II (Grönroos, L.; 2001). Se le asocia un efecto post-ph corto (Seif, T.; et al. 1997). Esto puede definirse como el tiempo necesario para recuperar su actividad de crecimiento habitual cuando, tras estar sometidos a un ph alcalino, éste vuelve a la normalidad (Liébana, J.; 1997). Es considerado el microorganismo más rápido, en la placa, para llegar al ph crítico de desmineralización de esmalte (Seif, T.; et al. 1997). Medios de cultivo para el Streptococcus mutans Para determinar el grado de susceptibilidad de un paciente con respecto a la concentración de Streptococcus mutans, es que actualmente se realizan exámenes microbiológicos. Mundorff (1990) demostró que había correlación entre el número de Streptococcus mutans en la placa bacteriana y en la saliva. Existen muchos medios de cultivo para determinar la concentración de Streptococcus mutans en saliva, que pueden ser cuantitativo o semicuantitativos (Schaeken, MJ.; 1986),uno de los medios cuantitativos es el descrito por Westergreen y Krasse (1978), el TYCSB (tripticasa, levadura, cistina, sacarosa, bacitracina), que ha sido muy utilizado en estudios (Linossier, A.; et al. 1989; De Soet, J.; et al. 1990; Van Lauren, C.; Buijs, J. 1995; Rojas, A.; Linossier, A. 1998; Linossier, A.; Carvajal, P. 1999; Séller, K.; et al. 2001). También están otros medios cuantitativos en agar, ricos en sacarosa (MAS, TYC) y algunos semicuantitavos como el Cariescreen, Linoscreen, Dentocult. La temperatura óptima para el crecimiento del Streptococcus mutans es de 37º C y bajo condiciones anaeróbicas, a pesar de que es posible obtener su crecimiento bajo un

16 ambiente aerobio. El ph final de los medios de cultivo con sacarosa es de 4 a 4,3 (Seif, T.; et al. 1997). El medio TYCSB es altamente selectivo para el Streptococcus mutans. La presencia de bacitracina y las altas concentraciones de sacarosa le dan al medio la propiedad de selectividad para el Streptococcus mutans. Es posible obtener crecimiento de algunas especies del género Staphilococcus y algunas levaduras, que pueden ser diferenciadas por las características morfológicas de sus colonias. El agregar una pequeña cantidad de cristal violeta (0,0008 gr. por litro de medio) facilita aún más el recuento, ya que tiñe las colonias de Streptococcus mutans de color violeta y a la vez, inhibe parte de la flora acompañante. Posterior a la dilución de la muestra y una sembrada, se lleva a un sistema anaeróbico durante 48 hrs. A 37º C, lo que permite un crecimiento óptimo del Streptococcus mutans (Grönroos, L.; 2001). Cuando el cultivo de muestras de saliva en medio TYCSB da resultados menores de 1x10 5 UFC/ml (unidades formadoras de colonias por mililitro de saliva), hablamos de bajo riesgo microbiológico, resultados entre 1x10 5 y 1x10 6 UFC/ml se habla de riesgo microbiológico moderado y con resultados superiores a 1x10 6 UFC/ml hablamos de un alto riesgo microbiológico (Urzúa, I.; et al. 1999). Valores con riesgo microbiológico moderado y alto son considerados en estudios nacionales de prevalencia que presentan riesgo de producir caries (Linossier, A.; Gajardo, M. 1989; Brown, P.; et al. 1991; Moltzfeld, R.; Linossier, A. 1994; Linossier, A.; Carvajal, P. 1999). Streptococcus sobrinus Contiene los polisacáridos del grupo mutans d y g, aunque hay cepas sin estos antígenos. Habitualmente es alfa hemolítico en agar sangre y en raras ocasiones no produce hemólisis; en cualquier medio, las colonias son más lisas que las de

17 Streptococcus mutans. Es la única especie del grupo que elabora peróxido de hidrógeno, lo que permite identificar esta especie fenotípicamente. Produce glucanos solubles e insolubles, pero no fructanos, y posee dextranasa para hidrolizar los glucanos. No sintetiza polisacáridos intracelulares, pero es más acidúrico (sigue elaborando ácido a Ph bajo), que Streptococcus mutans. Al igual que éste último posee proteínas superficiales fijadoras de glucanos, y otras con carácter de adhesinas (Spa y Pag) relacionadas serológicamente con las de Streptococcus mutans, que median procesos de adhesión y agregación que no aumentan con la saliva. El porcentaje de cepas bacteriocinógenas es del 20 al 30%. Aunque también coloniza superficies duras, se encuentra en cantidades inferiores al Streptococcus mutans en las localizaciones supragingivales; sin embargo, al igual que este último, es capaz de inducir cualquier tipo de caries en superficies lisas, fosas y fisuras, interproximales y cemento, e intervenir en la progresión de las lesiones cariosas. Lo señalado para el Streptococcus mutans con respecto a la susceptibilidad a los antibióticos es válido también para esta especie. Fuera del ámbito oral, su importancia patógena es dudosa, salvo en endocarditis subagudas, e incluso en estos casos no existen estudios significativos (Liébana, J.; 1997). Medios de cultivo para el Streptococcus sobrinus Para poder identificar colonias de la especie Streptococcus sobrinus, podemos hacerlo a través de las características morfológicas de sus colonias, que tiende a ser de un aspecto más liso que las colonias de la especie mutans (Liébana, J.; 1997). También es posible reconocer esta especie por medio del análisis bioquímico donde se analiza la capacidad de la especie para fermentar algunos azúcares; tales como el manitol, sorbitol, sacarosa, melibiosa, rafinosa y almidón (Linossier, A.; et al. 2003).

18 Un estudio serológico permite también identificar las colonias de Streptococcus sobrinus. Al preparar antisuero de conejos hembras inmunizadas con Streptococcus mutans (Ingbritt, serotipo c) o Streptococcus sobrinus (OMZ 176 serotipo d), según la técnica de inmunodifusión doble, descrita por Ouchterlony (Linossier, A.; et al. 2003). Resientemente se ha descrito el desarrollo de un nuevo medio selectivo para el Streptococcus sobrinus, al mostrar éste diferencias de susceptibilidad frente a los antibióticos B-lactámicos. El Streptococcus sobrinus es menos sensible que el Streptococcus mutans ante algunos antibióticos de este tipo, como el Aztreonam y la Fosfomicina, creándose de esta forma un medio, (MS-SOB), selectivo para el Streptococcus sobrinus (Hirasawa, M.; Takada, K. 2002).

19 Streptococcus sobrinus y ceod Un estudio realizado en Chile por Linossier (1986), describe que en una muestra de 30 niños de entre 9 y 10 años, el promedio ceo era de 2,75 y COP 2,21; y una frecuencia de especies de Streptococcus mutans igual a un 95% para el biotipo I y un 5% para el biotipo IV o Streptococcus sobrinus. Otra investigación realizada por Urbina (1981), demostró que el 77,5% de la población infantil (niños 2 a 14 años) del área metropolitana presentaban un promedio de caries de 2,51 para dientes temporales (ceo) y 2,26 para piezas permanentes (cop). Ellos informaron también que el grupo etáreo de 9 y 10 años tenía un promedio ceo de 3,68 y COP de 2,94. Un estudio de prevalencia de caries y de Streptococcus mutans en alumnos de odontología de la Universidad de Chile hecho por Linossier (1994), no muestra una asociación directa entre el número de caries clínicas (COPD) y radiográficas con el Streptococcus mutans, como suele apreciarse en poblaciones de niños menores. Sin embargo, sólo hay evidencia de reportes para determinar la frecuencia de los diferentes biotipos en poblaciones determinadas, o bien relacionar al género Streptococcus mutans con la prevalencia de caries.

20 5. MATERIAL Y METODO Universo investigado: Fueron seleccionados 60 pacientes de entre 4 y 6 años de edad que acuden a Kinder en la Escuela Aníbal Pinto de la ciudad de Cauquenes. A cada paciente se le determinó el estado bucal por medio del índice ceod descrito por Klein y Palmer (1937), a través de fichas clínicas (Liébana, J.; 1997). Se crearon 2 grupos comparables entre si: 30 pacientes con un índice ceod alto. 30 pacientes con un índice ceod bajo (grupo control). A cada paciente se le realizó un examen microbiológico para determinar las unidades formadoras de colonia por ml (ufc/ml) de Streptococcus mutans y de Streptococcus sobrinus, mediante siembra en medios selectivos: TYCSB y MS-SOB respectivamente. Toma muestra salival: Tanto el niño, como sus padres fueron oportunamente informados acerca del procedimiento, por lo que los responsables directos del menor debieron firmar un consentimiento informado. A los niños y a sus apoderados se les informó que el día seleccionado para la toma de la muestra salival, los menores no deberían comer, lavarse ni enjuagarse los dientes al menos 2 horas antes del examen. La muestra salival se obtuvo por estimulación de la secreción salival, utilizando un trozo de parafina sólida de 0,9 gr. durante un minuto, solicitándole al paciente que

21 vertiera la saliva dentro de un tubo de ensayo estéril, el cual fue sellado con algodón hidrofóbico. Las muestras obtenidas fueron trasladadas, para su análisis, al Laboratorio de Investigación Microbiológica de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Talca. Análisis microbiológico: Las muestras de saliva fueron homogenizadas con la ayuda de un agitador de tubos (Maxi Mix II tipo Mixer, Panel, USA S.A.) durante 30 segundos. Luego 10 µl (microlitros) de la muestra se adicionaron a 9.9 ml de agua destilada estéril (dilución 10-3 ). Esta solución fue nuevamente homogenizada por 30 segundos, de la cual se tomaron 50 µl y se sembraron en césped en placas Petri con: medio TYCSB altamente selectivo para Streptococcus mutans, y medio MS-SOB altamente selectivo para Streptococcus sobrinus. Para preparar un litro de medio TYCSB se utilizó: Agar agar 15 grs. Acetato de sodio 7.85 grs. Bicarbonato de sodio 2 grs. Cloruro de sodio 1 grs. Fosfato de sodio dihidratado 2 grs. Extracto de levadura 5 grs. L cistina 0.2 grs Peptona de caseína 15 grs. Sulfato de sodio 0.1 grs. Cristal violeta grs. Bacitracina 0.1 UI Sacarosa 200 grs.

22 La mezcla de estos reactivos se disolvió en agua destilada estéril y se autoclavó (proceso de esterilización de los reactivos) a 121 C. Luego se agregaron 200 grs. de sacarosa disuelta en agua destilada estéril y se autoclavó por separado a 115 C, es decir, sacarosa al 20%. Cuando el medio se encontró alrededor de 55 C se le adicionaron 0.1 UI de bacitracina por ml de medio. Para preparar un litro de medio MS-SOB se utilizó: Medio MS 90 grs. (DIFCO, USA) Aztreonam 200 mg. (BRISTOL MYERS-SQUIBB, ENGLAND) Fosfomicina 20 mg. (LABOMED, CHILE) Bacitracina 20 UI. (SIGMA, USA) Cloruro de sodio 20 gr. (MERCK, GERMANY) El medio se preparó con agua destilada estéril y se autoclavó a 121 C por 15 minutos. Cuando el medio se encontró alrededor de 55 C se le adicionaron los antibióticos. Las concentraciones finales de los antibióticos utilizados fueron modificados y adaptados a la tolerancia de las cepas bacterianas utilizadas en este estudio (Aztreonam 50 mg y Fosfomicina 5 mg). Las placas sembradas con las muestras salivales diluidas se dispusieron en un sistema de anaerobiosis (jarras biomérieux) con un sobre generador de anaerobiosis (GENbox-bioMérieux ) y un marcador de anaerobiosis (Anaer Indicador biomérieux) y luego incubaron a 37 C por 48 horas en una estufa Pasteur (Memmert 300 GrimbH- Co.KG). Recuento de colonias: En las placas con medio TYCSB, se contaron las colonias adherentes, con superficie rugosa, de consistencia dura, con apariencia de vidrio esmerilado semejante a un grano de azúcar, y que no pudieron ser disgregadas cuando se manipularon con una pipeta

23 Pasteur, desprendiéndose completamente la colonia del medio (Brown, P.; et al. 1991; Liébana, J.; 1997). Fig.1. Fotografía de colonias S. mutans en medio TYCSB ( ). Fig.2. Fotografía de colonias S. mutans productoras de glicocálix ( ) en medio TYCSB. En las placas con medio MS-SOB, se contaron las colonias adherentes, con superficie rugosa, de consistencia dura, con apariencia de mora y que no pudieron ser disgregadas cuando se manipularon con una pipeta Pasteur, desprendiéndose completamente la colonia del medio (Brown, P.; et al. 1991; Liébana, J.; 1997). Fig.3. Fotografía de colonias S. sobrinus ( placa Petri con medio MS-SOB. ) en

24 La cantidad total de colonias para S. mutans y S. sobrinus presentes en las placas Petri respectivas, se obtuvieron utilizando el coeficiente de dilución, el cual se multiplicó por la cantidad de colonias presentes en el agar, para denominarlas unidades formadoras de colonia por ml de saliva (ufc/ml). Los pacientes se clasificaron en las siguientes categorías: Según fichas clínicas: Grupo 1: pacientes ceod alto. Grupo 2: pacientes ceod bajo. Según recuento microbiológico: Grupo bajo riesgo: < 10 5 ufc/ml de saliva. Grupo moderado riesgo: ufc/ml de saliva. Grupo alto riesgo: > ufc/ml de saliva. Criterios de exclusión: Se excluyeron de la muestra todos aquellos pacientes que hayan utilizando algún tipo de enjuagatorio bucal, que no correspondan al rango de edad establecido y que hayan consumido antibióticos en un plazo menor a 3 meses desde el momento de la toma de la muestra salival. Determinación del índice ceod: Para determinar el índice ceod se confeccionaron fichas clínicas, por un solo examinador, de todos los niños de Kinder y se seleccionaron para el estudio, de acuerdo al odontograma de cada uno. El valor del ceod se determinó de acuerdo a los siguientes criterios descritos por Klein y Palmer (1937) y que son considerados por los trabajos epidemiológicos (Brown, P.; et al. 1991): Se considera una boca normal un total de 20 piezas dentarias temporales, excluyendo los primeros molares definitivos.

25 c: N de dientes temporales con caries. e: N de dientes temporales extraídos o con indicación de extracción. o: N de dientes temporales obturados. d: Diente temporal como unidad. Las piezas dentarias temporales que presentaron caries recidivante se les consideró sólo como caries, no como obturación. Identificación Bacteriana mediante PCR Se identificaron todas las colonias bacterianas del medio MS-SOB y 3 colonias bacterianas del medio TYCSB. Así todos los cultivos de S. mutans y S. sobrinus en 2 ml. de caldo BHI fueron incubados a 37ºC en ambiente anaeróbico durante 48 horas. Posteriormente las cepas bacterianas fueron centrifugadas a rpm por 10 minutos y lavadas 2 veces con buffer fosfato salino (PBS ph 7.2). Para la obtención del DNA genómico se utilizó el kit proporcionado por biorad (USA) AquaPure Genomic DNA kit, en el cual las células bacterianas son lisadas y luego sometidas a incubación a 80ºC por 5 minutos. Posteriormente se le adicionó una solución de RNAasa y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. A continuación se le agregó una solución de lisis y se centrifuga a rpm durante 3 minutos. Se rescató el sobrenadante al cual se le adiciona 300ul de isopropanol, se mezcló suavemente y se vuelvió a centrifugar a rpm durante 3 minutos. El sedimento se resuspendió en 300ul de etanol al 70%, se mezcló suavemente y se centrifugó a rpm durante 1 minuto. Finalmente se adicionó 50 ul de solución de hidratación y se incubó a 65ºC durante 5 minutos. El tubo con el DNA se mantuvo a 4º hasta la realización del PCR.

26 Las secuencias de los primers utilizados en este estudio son los siguientes: S. mutans 5 - ACTACACTTTCGGGTGGCTTGG 5 - CAGTATAAGCGCCAGTTTCATC S. sobrinus 5 - GATAACTACCTGACAGCTGACT 5 - AAGCTGCCTTAAGGTAATCACT Cada mezcla de PCR consistió en buffer Tris HCl 10 mm ph 8.3, 1.5 mm de MgCl2, 50 mm KCl, 200uM de cada deoxinucleótido (datp, dttp, dgtp y dctp Omega Biotek,USA), 1 um de los primers (GTFB-F, GTFB-R, y GTFI-R) y 2 Uds de Taq DNA polymerase (Gen Lab, USA). El PCR fue realizado en 30 ciclos termales en un termocilador (Termo Hybaid, USA), cada ciclo consistió en una denaturación a 94ºC por 4 minutos, anillamientos a 51ºC por 1 minuto y extensión a 72ºC por 2 minutos y una extensión final a 72ºC por 5 minutos. Los productos de la PCR fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa al 1% y teñidos en bromuro de etidio y fotografiados bajo luz ultravioleta.

27 ,75 kh 0,5 kh Fig.4. Identificación mediante PCR de S. mutans y S. sobrinus aislados de muestras salivales. Identificación. Línea 1 DNA ladder 1 KB; línea 2, 3, 4 y 5 S. sobrinus; línea 6, 7, 8, y 9 S. mutans; línea 10 DNA ladder 1 Kb. Aspectos éticos: Las muestras salivales necesarias para el estudio son de fácil obtención por parte del niño y no provocan ningún trauma de tipo físico o psicológico. El niño y sus responsables directos fueron oportunamente informados del procedimiento, de forma verbal y a través de un documento escrito, en el cual tuvieron libertad de escoger su participación. El conocimiento de los resultados obtenidos no compromete la honra ni la dignidad de las personas, sin embargo, la confidencialidad de los datos está garantizada.

28 6. RESULTADOS ESTADÍSTICOS La muestra utilizada para este estudio constó de 60 pacientes, los cuales se dividieron en partes iguales entre hombres y mujeres. El rango de edad de la muestra seleccionada fluctuó entre los 4 y 6 años de edad. Dicha información se resume en la siguiente figura: 4 años (15%) 5 Años (18%) 6 Años (67%) Fig. 5. Distribución de la muestra por edades. La población se dividió en dos grandes grupos, el primero con niños que poseían un índice ceod alto y el segundo grupo con niños que poseían un índice ceod bajo. Estos pacientes fueron sometidos a un análisis microbiológico para medir individualmente la cantidad de ufc/ml de Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus. A continuación se detallan los promedios de ceod, ufc/ml para S. mutans y S. sobrinus: Tabla Nº4. Promedios ceod, ufc/ml para S. mutans y S. sobrinus: índice ceod ceod promedio ufc/ml. S. mutans promedio ufc/ml. S. sobrinus promedio bajo 0, , ,00 alto 7, , ,67

29 En muchos estudios es necesario comparar ciertas características en dos o más grupos de sujetos. En este caso consideramos dos muestras independientes. En la primera muestra, crecimiento S. mutans, los datos de cada grupo no provenían de una distribución aproximadamente normal ni con una variabilidad semejante, por lo que resultó útil una transformación de los mismos (aplicación del logaritmo). En la segunda muestra, crecimiento S. sobrinus, y debido a la inestabilidad de los datos, fue necesaria la utilización de procedimientos no paramétricos. En el primer caso se requirió establecer y comparar el crecimiento de S. mutans en pacientes con un índice ceod alto y bajo, se hizo mediante el uso del test T de Student (procedimiento paramétrico) que entregó la existencia de una diferencia estadísticamente significativa. Normalmente en estos tipos de análisis podemos establecer una hipótesis de partida (hipótesis nula), que generalmente asume que el efecto de interés es nulo, en este caso particular la variable de interés numérica involucrada es la media de ufc/ml de S. mutans en niños con un índice ceod alto y otra de la muestra de niños con un índice ceod bajo, se comparó que en ambos grupos este parámetro sea estadísticamente similar. En términos de Hipótesis, tenemos: H 0 : La media de ufc/ ml de S. mutans es igual en ambos grupos H 1 : La media de ufc/ml de S. mutans es distinta en ambos grupos En este caso se requirió una transformación logarítmica de la base de datos (detalles en tabla Nº5), debido a la característica exponencial de los datos con los cuales se trabajó.

30 Tabla Nº5. Datos estadísticos de la muestra total con transformación logarítmica. Estadísticos de grupo LOGUFCMU GRUPO Bajo riesgo Alto riesgo N Desviación Error típ. de Media típ. la media Al aplicar la prueba T para muestras independientes (ver Tabla Nº6), el software SPSS 11.0 entregó los siguientes resultados: Tabla Nº6 Resultado entregado por SPSS 11.0 sobre las hipótesis planteadas (prueba T para crecimiento de S. mutans en pacientes con alto y bajo índice ceod) LOGUFCMSe han asumido varianzas iguale No se han asum varianzas iguale Prueba de Levene para la igualdad de varianzas F Prueba de muestras independientes Sig. Prueba T para la igualdad de medias 95% Intervalo de confianza para la DiferenciaError típ. de diferencia t gl Sig. (bilateralde mediasa diferencia Inferior Superior Como el valor p fue muy pequeño (considerando un p<0.05) es poco probable que se cumpla la hipótesis de partida y se debió rechazar. Como el valor p del Test T de Student para la igualdad de Medias correspondiente fue menor a se concluye que existe suficiente evidencia estadística para decir que la cantidad de ufc/ml de S. mutans medio de ambos grupos es diferente. Por otro lado, la tabla Nº6 refleja que el intervalo de confianza tiene una seguridad del 95% para la diferencia de ufc/ml para S. mutans, y viene dado por el intervalo ( , ) fortaleciendo el resultado anterior dado el hecho que el valor cero no pertenece al intervalo indicado, disponiendo entonces de más evidencia estadística para concluir que el número de ufc/ml de S. mutans promedio es distinto en ambas clasificaciones de niños según su índice ceod.

31 Para entregar una idea gráfica de la diferencia de ambos grupos se muestra la siguiente comparación: 1,00E+08 ufc/ml S. mutans 1,00E+06 1,00E+04 1,00E+02 bajo ceod alto ceod 1,00E Pacientes Fig. 6. ufc/ml S. mutans en niños con índice ceod alto y bajo. En segundo lugar, se necesitó comparar el crecimiento de S. sobrinus en pacientes con un índice ceod alto y bajo. Para ello no se utilizó el método anterior, debido a que un importante número de muestras no poseían ufc/ml para S. sobrinus, mayoritariamente en pacientes con índice ceod bajo. Debido a esto no fue posible cumplir con la exigencia de las pruebas o test paramétricos que obligan a que las observaciones en cada grupo provengan de una distribución aproximadamente normal con una variabilidad semejante. Al no cumplirse dicha exigencia para pruebas paramétricas, se utilizaron pruebas de carácter no-parámetrico, como el caso anterior se espera que en ambos grupos sea este parámetro estadísticamente similar.

32 En términos de Hipótesis, tenemos: H 0 : La media de ufc/ml para S. sobrinus es igual en ambos grupos H 1 : La media de ufc/ml para S. sobrinus es distinta en ambos grupos Con el fin de determinar si las muestras provenían de la misma población o de 2 poblaciones diferentes se utilizaron dos pruebas no paramétricas: la prueba de Mann- Whitney y el Test de Kolmogorov-Smirnov. Para realizar la comparación se muestra la tabla Nº7 entregada para la prueba de Mann-Whitney por el SPSS 11.0, de aquí se desprende que tenemos un valor p de 0.011, el cual es menor al valor estimado de referencia para aceptar o rechazar la prueba de hipótesis planteada que es de un p<0.05, por lo tanto, existe suficiente evidencia estadística para decir que la media de ufc/ml para S. sobrinus es distinto en ambos grupos. Tabla Nº7. Detalle de la prueba no paramétrica de Mann-Whitney para S. sobrinus en pacientes con alto y bajo índice ceod. Estadísticos de contraste U de Mann-Whitney W de Wilcoxon Z Sig. asintót. (bilateral) a. Variable de agrupación: GRUPO a UFC SOBRINUS Para reforzar este análisis se llevó a cabo un segundo test no paramétrico, el Test de Kolmogorov-Smirnov, donde nuevamente tenemos un p<0.05, reforzando rechazar la prueba de hipótesis nula a favor de la hipótesis alternativa.

33 Tabla Nº8. Detalle de la prueba no paramétrica de Kolmogorov-Smirnov par a el S. sobrinus en pacientes con bajo y alto índice ceod. Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra c N Parámetros normales a,b Media Desviación típica LOGUFCSO Diferencias más extremas Z de Kolmogorov-Smirnov Sig. asintót. (bilateral) a. b. c. Absoluta Positiva Negativa La distribución de contraste es la Normal. Se han calculado a partir de los datos. GRUPO = Bajo riesgo Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra c N Parámetros normales a,b Media Desviación típica LOGUFCSO Diferencias más extremas Z de Kolmogorov-Smirnov Sig. asintót. (bilateral) a. b. c. Absoluta Positiva Negativa La distribución de contraste es la Normal. Se han calculado a partir de los datos. GRUPO = Alto riesgo El uso de la prueba de Mann-Whitney constituye una alternativa no paramétrica a la prueba t de Student equivalente al análisis de varianza de un factor en el caso de dos muestras.

34 Para entregar una idea gráfica de la diferencia de ambos grupos se muestra la siguiente comparación: 5,0E+05 4,5E+05 ufc/ml S. sobrinus 4,0E+05 3,5E+05 3,0E+05 2,5E+05 2,0E+05 1,5E+05 1,0E+05 5,0E+04 bajo ceod alto ceod 0,0E Pacientes Fig.7. ufc/ml S. sobrinus en niños con índice ceod alto y bajo. Generalidades de las muestras Del total de la muestra, 20 de ellos (33,3%) presentaron ufc/ml para S. sobrinus, siendo 14 (23,3%) niños catalogados con un alto índice ceod y los 6 restantes (10%) correspondieron al grupo de bajo índice ceod. Para ambas comparaciones resultó estadísticamente significativa la diferencia entre los dos grupos, en otras palabras es relevante el hecho de que pacientes con un mayor número de ufc/ml de S. mutans y S.sobrinus se relaciona directamente con un mayor índice ceod. Además se observó que existe una mayor asociación S. mutans/s.sobrinus en niños pertenecientes al grupo con un índice ceod alto. Los siguientes esquemas muestran estas diferencias:

35 ufc/ml 9,0E+05 8,0E+05 7,0E+05 6,0E+05 5,0E+05 4,0E+05 3,0E+05 2,0E+05 1,0E+05 0,0E+00 bajo ceod alto ceod ufc/ml S. mutans ufc/ml S. sobrinus Fig.8. ufc/ml S. mutans y S. sobrinus promedio en niños con un índice ceod alto y bajo. Tabla Nº9. Muestra los niños que desarrollaron sólo S.mutans y aquellos que desarrollaron S.mutans+ S. sobrinus; en los grupos: índice ceod bajo, índice ceod alto y en la población total. Pctes. S. mutans/s. sobrinus % Pctes. sólo S. mutans % Total niños bajo ceod alto ceod 14 46, ,4 30 Total Muestra 20 33, ,7 60

36 Número de pacientes bajo ceod alto ceod S. mutans + S. sobrinus Sólo S. mutans 5 0 Fig.9. Desarrollo sólo de S.mutans y S.mutans+ S. sobrinus, en el grupo con índice ceod bajo y ceod alto. Número de pacientes S. mutans + S. sobrinus S. mutans 0 Fig.10. Desarrollo de S.mutans+ S. sobrinus y sólo de S.mutans, en la población total estudiada.

37 Tabla Nº10. Muestra los niños que desarrollaron sólo S.mutans y aquellos que desarrollaron S.mutans+ S. sobrinus, y el promedio ceod respectivo. Nº niños % total promedio ceod S. mutans 40 66,7 3,02 S. mutans + S. sobrinus 20 33,3 6,1 Número de pacientes S. mutans prom. ceod S. mutans + S. sobrinus prom.ceod 0 Fig.11. Niños que desarrollaron sólo S.mutans, aquellos que desarrollaron S.mutans+ S. sobrinus; y el promedio del índice ceod respectivo.

38 7. DISCUSIÓN De acuerdo a los resultados obtenidos en esta investigación, se demostró que la presencia de S. sobrinus es menos frecuente que S. mutans lo que concuerda con los trabajos realizados por otros autores (Keene, H.; et al. 1977; Cazabat, M.; et al. 1981; Linossier, A.; et al. 1987; Linossier, A.; 1994). Es importante destacar que el medio MS-SOB, preparado a partir de los descubrimientos realizados por Hirasawa (2002), y la modificación que se le realizó a las concentraciones de aztreonam y fosfomicina, lo transforman en una buena opción para estudiar S. sobrinus, considerando que en el medio TYCSB no se pueden observar las diferencias existentes entre las colonias de S.mutans y S. sobrinus. Esto último fue confirmado de modo específico al utilizar la técnica de PCR como herramienta discriminatoria entre ambas especies bacterianas. Es importante precisar que debido a la menor presencia de sacarosa en el medio MS- SOB, se hace difícil determinar la presencia de colonias productoras de glicocálix. Esto último no sería importante si se considera que tanto S. mutans como S. sobrinus fueron detectados mediante PCR a través de la amplificación de genes que codifican sus respectivas enzimas glucosiltransferasas, responsables de la biosíntesis de glicocálix, aceptándose de antemano que ambas especies debieran sintetizar sus respectivos glicocálix. Aún cuando no correspondió a los objetivos de este trabajo, es importante resaltar que S. mutans presentó colonias con glicocálix sólo en niños con índice ceod alto. Lo anterior confirma lo descrito por Araneda (2002.) el cual describe la presencia de glicocálix como un importante mecanismo gestor de virulencia. La determinación molecular mediante PCR de S. mutans y S. sobrinus es la primera realizada en Chile, por lo que se piensa que la alta especificidad y sensibilidad de estos procedimientos aumentó el porcentaje de niños con presencia de S. sobrinus en la cavidad oral, en comparación a lo descrito por Linossier,(1987).

39 Si bien S. sobrinus no es predominante en el grupo estudiado (33%), pero en concordancia con los resultados encontrados se puede argumentar que esta bacteria juega un rol de mayor trascendencia en la cariogénesis, puesto que el mayor porcentaje se concentró en el grupo de niños con un índice ceod alto (46,6%), en comparación con el 20% encontrado en el grupo de niños con un índice ceod bajo. Este estudio que contó con herramientas de alta especificidad y sensibilidad, encontró que en su población estudiada el porcentaje de S. sobrinus fue mayor a los encontrados por Linossier (1987). Höfling (1999) encontró que los individuos analisados en su estudio que estaban colonizados por mutans y S. sobrinus en forma asociada, presentaron índices cariogénicos mayores que aquellos colonizados sólo por S. mutans, lo que concuerda con nuestras observaciones. De este trabajo también se desprende que el grupo de niños colonizados por S. mutans y S. sobrinus presentaron un índice ceod promedio mayor que aquellos niños que sólo desarrollaron S. mutans. Sería importante realizar estudios similares en poblaciones de diferentes edades para confirmar si en nuestro país S. sobrinus sólo o en asociación con S. mutans aumentan el riesgo cariogénico. Así también, la implementación de una metodología mediante PCR en la cual se pueda detectar, a partir de placa supragingival, la presencia cuali y cuantitativa de ambas especies bacterianas, puede contribuir de un modo rápido y con alta especificidad y sensibilidad a la prevención y/o tratamiento de la caries.

40 8. CONCLUSIÓN S. sobrinus es una especie no predominante en la población estudiada, y sólo se observó en un 33%. Un 46,6% de los niños con índice ceod alto presentaron S. sobrinus. Un 20% de los niños con índice ceod bajo presentó crecimiento de S. sobrinus. En 4 de las 30 muestras de S. mutans del grupo con un índice ceod alto se presentaron colonias productoras de glicocálix. En el grupo de niños con un índice ceod bajo no se presentaron colonias de S. mutans productoras de glicocálix. La metodología de PCR permite identificar con exactitud las especies S. mutans y S. sobrinus. El grupo de niños con un índice ceod alto, presentó una mayor asociación S. mutans - S. sobrinus que el grupo catalogado de índice ceod bajo. Los niños que desarrollaron S. mutans y S. sobrinus presentaron un promedio para el índice ceod mayor que aquellos que sólo desarrollaron S. mutans. El 76,6% de la población con índice ceod alto presentó un recuento microbiológico moderado y alto para S. mutans. El 60% de la población con un índice ceod bajo presentó un recuento microbiológico considerado de bajo riesgo para S. mutans.

41 9. RESUMEN Una de las enfermedades más prevalentes en el mundo es la caries dental, la que provoca destrucción a nivel oral y cuya prevalencia puede ser medida por medio de índices cariogénicos, que en el caso de la dentición primaria es el índice ceod. Actualmente es posible analizar el factor microbiológico, a través de medios selectivos como el TYCSB y el MS-SOB; además de contar con metodologías de alta especificidad como la técnica de PCR a través de la cual se logra amplificar genes propios de la especie bacteriana en estudio. El propósito de este estudio fue determinar el recuento bacteriano de S. mutans y S. sobrinus en una población infantil de 4 a 6 años de edad de la escuela Aníbal Pinto de la ciudad de Cauquenes, y relacionarlo con sus respectivos índices ceod. Para realizar este estudio se confeccionaron fichas clínicas a los menores y se clasificaron en 2 grupos de 30 niños cada uno, según el índice ceod: Grupo 1: niños con un índice ceod alto. Grupo 2: niños con un índice ceod bajo. De cada menor se obtuvo una muestra salival, la que fue procesada en el Laboratorio de Investigación Microbiológica de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Talca. El análisis microbiológico consistió en que cada muestra fue sembrada en medio TYCSB altamente selectivo para S. mutans y MS-SOB selectivo para S. sobrinus. Además como una forma de respaldar estos resultados se utilizó la técnica de PCR como herramienta discriminatoria entre ambas especies bacterianas. El análisis estadístico entregó suficiente evidencia como para concluir que el crecimiento medio de S. mutans y S. sobrinus en ambos grupos de niños es diferente. Se concluye que el grupo de niños con un índice ceod alto presentó un mayor porcentaje S. mutans y S. sobrinus asociados. Así también los niños que estaban 40