Metaloenzimas tipo VIM detectadas en aislamientos clínicos en Pseudomonas aeruginosa en cuatro hospitales en Venezuela

Transcripción

1 Revista del Instituto Nacional de Higiene Rafael Rangel, 2008; 39 (2) Metaloenzimas tipo VIM detectadas en aislamientos clínicos en Pseudomonas aeruginosa en cuatro hospitales en Venezuela VIM- type metalloenzymes detected in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in four Venezuelan hospitals Damarys I Sánchez G 1, Daniel Marcano Z 1, Enza Spadola C 1,2, Lilia V León G 1, Daisy J Payares B 1, Carmen I Ugarte N 1,3, Nuris N Salgado M, Graciela Maggi O 3, Armando Guevara P 4, Samari Torres G 1, José A Rodríguez U 1, Ángel H Flores R 1, Betty D Tarazona G 1 RESUMEN En los últimos años se ha observado mundialmente un incremento del aislamiento de cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes a múltiples antibióticos, siendo la producción de β-lactamasas la principal causa de resistencia a los antibióticos β-lactámicos, los cuales constituyen la única opción terapéutica en muchos casos. Las metalo-βlactamasas (MBLs) son una familia de enzimas degradadoras de β-lactámicos que recientemente han emergido como determinantes de resistencia de importancia clínica y que son activas contra los carbapenem; no hidrolizan a los monobactámicos; son inhibidas por agentes quelantes de iones metálicos como el EDTA y el ácido dipicolínico; no son inhibidas por el ácido clavulánico, sulbactan ni tazobactan y presentan uno o dos iones de zinc en su sitio activo. Este reporte describe la detección de MBLs tipo VIM mediante ensayos fenotípicos y moleculares en nueve cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenems aisladas de muestras clínicas de cuatro hospitales de Venezuela. Por métodos fenotípicos se evidenció que 100% de las cepas eran productoras de MBLs, y por PCR Abstract In recent years there has been a worldwide raise in the isolation of Pseudomonas aeruginosa strains with resistance to multiple antibiotics, being β-lactamase production the main cause of resistance to β-lactamic antibiotic (which are the only therapeutic option in many cases). The MBLs are an β-lactamic- degrading enzymatic family that have emerged as clinically relevant resistance determinants and are active against carbapemens, don t hydrolise monobactams, have one or two zinc ions in its active site and are inhibited by metallic ions chelating agents such as EDTA and dipicolinic acid, but aren t inhibited by β-lactamase inhibitors such as clavulanic acid, sulbactam or tazobactam. This report describes the detection of VIM-type MBLs by phenotypic and molecular methods in 9 carbapenemsresistant Pseudomonas aeruginosa strains isolated from clinical samples of four Venezuelan hospitals. By phenotypic methods it was evidenced that 100% of the strains were MBLs producers, and by final- point PCR it was determined that all the MBLs were from the VIM family, which confer high- level resistance to the β-lactamic antibiotics (except 1 Instituto Nacional de Higiene Rafael Rangel, Caracas, Dtto. Capital. 2 Hospital Militar Dr. Carlos Arvelo, Caracas, Dtto. Capital. 3 Hospital de Niños J.M. de los Ríos, Caracas, Dtto. Capital. 4 Hospital Universitario Ruiz y Páez, Ciudad Bolívar, Edo. Bolívar. Correspondencia a Damarys I. Sánchez. Dirección: Instituto Nacional de Higiene Rafael Rangel, Dpto. de Bacteriología, Ciudad Universitaria, Los Chaguaramos. Correo electrónico: dsanchez@inhrr.gov.ve; damarys_sanchez@yahoo.com. 17

2 todas las MBLs resultaron ser de la familia VIM, las cuales confieren alto nivel de resistencia a los antibióticos β-lactámicos, con excepción del Aztreonam, único antibiótico al cual se observó sensibilidad, complicando así las opciones terapéuticas. Palabras clave: Antibióticos, Pseudomonas aeruginosa, carbapenem, metalo-β-lactamasa. Aztreonam), and because they are carried by plasmids with the ability to transfer horizontally to other bacterial families, they can be responsible for therapeutic complications in an individual or the patients collective. Key words: Antibiotics, Pseudomonas aeruginosa, Carba - pe nems, metalo-β-lactamase. INTRODUCCIÓN En los últimos años se ha observado un aumento en el aislamiento de cepas de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes en todo el mundo; los hospitales de nuestro país no escapan a esta realidad. Este hecho tiene gran relevancia al momento de la selección del tratamiento empírico en infecciones producidas por este microorganismo. P. aeruginosa es un importante patógeno oportunista en el ámbito nosocomial, que causa un amplio rango de complicaciones clínicas tales como neumonía, sepsis, meningitis, otitis externa, infecciones urinarias, entre otros, y principalmente en pacientes inmunocomprometidos y sometidos a procedimientos invasivos en unidades de cuidados intensivos. Existen reportes de casos en los cuales se han encontrado ce - pas de P. aeruginosa resistentes a múltiples antibióticos, y otros en los cuales este patógeno ha desarrollado re - sistencia intratratamiento a la terapéutica inicial (1); esto es debido a que, además de presentar resistencia intrínseca a varios antimicrobianos, frecuentemente presenta diversos mecanismos de resistencia adquirida, lo que conlleva a una clara reducción de las posibilidades terapéuticas (2). La producción de β-lactamasas es la principal causa de resistencia a los antibióticos β-lactámicos entre las bacterias Gram negativas (3). Existen dos fa - milias diferentes de β-lactamasas, no relacionadas entre si, las serino-β-lactamasas y las metalo β-lactamasas (MBLs), este último grupo es capaz de degradar todos los antibióticos β-lactámicos con excepción de los mo - no bactames, confiriéndole altos niveles de resistencia a estos aislamientos (4). Las MBLs son una familia de en - zimas degradadoras de β-lactámicos presentes en algunas especies de bacilos Gram negativos ambientales que recientemente han emergido como determinantes de resistencia de importancia clínica. Estas enzimas, que pertenecen a la clase B de la clasificación molecular de Ambler y al grupo 3 de la clasificación funcional de Bush, Jacoby y Medeiros, presentan las siguientes ca - rac terísticas: son activas contra los carbapenemos, no hi drolizan a los monobactámicos, son inhibidas por agen tes quelantes de iones metálicos como el EDTA y el ácido dipicolínico, no son inhibidas por el ácido clavulánico, sulbactan ni tazobactan, y presentan uno o dos iones de zinc en su sitio activo, los cuales se unen a moléculas de agua que intervienen en la inactivación por hidrólisis del anillo β-lactámico (5,6,7,8). La clasificación de Bush agrupa a las betalactamasas según los perfiles del sustrato y su inhibición por el ácido clavulánico, incluyendo dentro del grupo 3 las carbapenemasas tipo metalobetalactamasas (9), que proporcionan resistencia a los carbapenem; y son inhibidas por EDTA (10). La subclase B1 de la clasificación molecular de Ambler agrupa a las MBL transferibles de tipo IMP, VIM, SPM, GIM y SIM; las cuatro primeras han sido encontradas en P. aeruginosa, las IMP y las VIM son los tipos de MBLs más diseminadas. La IMP1 fue la primera MBL des crita P. aeruginosa, en cepas recuperadas de un bro te de infección nosocomial en Japón (11). Esta enzima exhibe un perfil de actividad de amplio espectro que incluye actividad contra penicilinas, cefalosporinas, ce - fa micinas, oxacefamicina y carbapenem, sólo los mo no - bactam escapan de esta acción (12). Las MBLs del tipo VIM son las más frecuentes en el continente americano y poseen variantes alélicas numeradas del 1 al 12, dentro de las cuales la más diseminada a nivel mundial es VIM-2. Estas enzimas están bien identificadas en la re - sistencia a carbapenem en P. aeruginosa y en otros no fermentadores, desde los países de Europa, y la cuenca mediterránea (Italia, Francia, Grecia, Es pa ña y Tur - quía), como en los países del extremo Le jano Oriente (Korea, Taiwán y Singapur), Estados Unidos y América. 18

3 Las MBLs tienen un amplio rango de hidrólisis de sustratos que pueden degradar prácticamente a todas las betalactamasas, excepto los monobactam (13). Este re - porte describe la detección de metalo-β-betalactamasas tipo VIM presentes en cepas aisladas en cuatro hospitales en Venezuela. MATERIALES Y MÉTODOS: Cepas: Se estudió un total de nueve cepas de origen clínico, previamente descritas como Pseudomonas aeruginosa resistentes a los β-lactámicos, incluyendo los carbapenemas, colectadas de muestras clínicas en pacientes hospitalizados. La información epidemiológica se muestra en la tabla 1. Estudio de la sensibilidad: A todas las cepas recibidas se les realizó pruebas de susceptibilidad por el método de difusión en agar descrito en el documento M2-A10 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (14), determinándose el perfil de susceptibilidad a los siguientes antimicrobianos: imipenen, meropenem, aztreonam, piperacilina/tazobactam, ceftazidima, cefepima, amikacina y ciprofloxacina, para esto se usaron dis cos comerciales (Oxoid). Como control de calidad se usaron las cepas Escherichia coli ATCC y Pseu - domonas aeruginosa ATCC 27853, y los resultados fueron interpretados utilizando los criterios del documento M100-S16 CLSI (15). Detección de MBLs: La detección de metalo β-lactamasas se realizó mediante la doble difusión con discos, utilizando discos de imipenem (IPM), meropenem (MER) y EDTA- (EDTA-SMA). Para esto se inoculó una pla ca de agar Mueller Hinton con una suspensión de la cepa problema con una turbidez equivalente al 0,5 de MacFarland, y luego se colocó el disco de EDTA-SMA en el centro de la placa y a ambos lados, a 1,5 cm de dis tancia, los discos de IPM y MER. La ampliación del halo de susceptibilidad de meropenem y/o imipenem en la proximidad del disco de EDTA-SMA indicó la presencia de una metalo β-lactamasa. Los discos de EDTA- SMA fueron preparados impregnando discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro con 10 µl de una solución que contenía 4 volúmenes de EDTA 0,5 M y 6 volúmenes de SMA 300 mg/ml (16). Como control positivo se utilizó la cepa Pseudomonas aeruginosa M7017 productora de MBL tipo IPM y como control negativo se usó la cepa de Pseudomonas aeruginosa Fav-20 hiperproductora de bomba de eflujo (provenientes del Instituto Dr. Carlos Malbran, Buenos Aires, Argentina). Identificación de genes metalo-β-lactamasa: La presencia de los genes bla VIM-like para Pseudomonas ae ru - ginosa fue analizado por la técnica de Reacción en Ca dena de la Polimerasa (PCR), amplificando un segmento de 261 pares de bases de los genes de la familia VIM, empleando secuencias especificas iniciadoras para VIM-F (ATTGGTCTATTTGACCGCCGT) y VIM-R (CTA CT CAAC GACTGAGCGGAT) según procedimientos estándar (17). Como control de extracción se ampli - ficó la secuencia de 16S ribosomal de las cepas en es tudio utilizando los iniciadores 16S-F 5 -AGGAGGT- GATCCAACCGCA y 16S-R 5 -AACTGGAG GAAG GT - GGGGAT (18). La amplificación se realizó en un ter mociclador Applied Biosystem Gene Amp PCR System El programa de PCR consistió en una desnaturalización inicial a 94 C por 5 min. y posteriormente se realizaron 30 ciclos de desnaturalización a 94 C por 30 segundos, alineación a 57 C por 30 segundos y extensión a 72 C por 30 segundos, culminando el protocolo con un paso de extensión final a 72 C por 5 mi nutos. El volumen final de la reacción fue de 50 µl. Los productos de PCR fueron analizados en gel de agarosa al 1% y teñido con bromuro de etidio, analizado con el equipo de fotodocumentación (Gel Doc XR- Che - midoc XRS BIO-RAD). RESULTADOS: Las nueve cepas procesadas e identificadas pre - viamente como Pseudomonas aeruginosa mostraron 100% de resistencia a aminoglucósidos y los siguientes β-lactámicos: ceftazidima, cefepima, imipenem y meropenem, mientras que para aztreonam 89% de las cepas fueron sensibles, encontrándose solo el 11% con resistencia a este antibiótico. Al realizar la detección de MBLs por el método de di fu sión con discos se observaron zonas de sinergia en - tre los discos de IMI - EDTA MER en todas las ce pas, de mos trando fenotípicamente la presencia de MBLs (figura 1). La amplificación por PCR de genes de la familia VIM resultó positiva en las nueve cepas procesadas, obteniéndose productos de 261 pb, lo cual indica la presencia del gene bla VIM-like. 19

4 Tabla 1 Datos epidemiológicos de aislamientos de Pseudomonas aeruginosa No. del Hospital Cuidad Paciente Tipo de muestra aislamiento (edad) Hosp. Ruiz y Páez Ciudad Bolívar, 2 años Secreción Edo. Bolívar purulenta de muslo Hosp. Ruiz y Páez Ciudad Bolívar, 10 días Secreción ótica Edo. Bolívar Hosp. J.M. de los Ríos Caracas, Dtto. Capital 1 año Punta de catéter Hosp. Militar Caracas, Dtto. Capital 35 años Orina Paciente en Unidad de Terapia Intensiva Hosp. J.M. de los Ríos Caracas, Dtto. Capital 8 años Secreción bronquial Hosp. J.M. de los Ríos Caracas, Dtto. Capital 11 años Secreción de herida Hosp. Militar Caracas, Dtto. Capital 45 años Hemocultivo Hosp. Periférico Caracas, Dtto. Capital 63 años Punta de catéter de Catia Hosp. Militar Caracas, Dtto. Capital 40 años Secreción bronquial Figura 1. Zonas de sinergia entre discos de Imipenem- EDTA/SMA Meropenem en cepas de P. aeruginosa MEM: meropenema IMI: Imipenema CAZ: Ceftazidima AZT: Aztreonam CIP: Ciprofloxacina EDTA/SMA: Ethylenediaminetetraacetic/tioglicolato de sodio DISCUSIÓN: P. aeruginosa se caracteriza por su capacidad para producir intrínsecamente enzimas degradadoras y mo di - fi cadoras de antibióticos, así como por su capacidad pa - ra captar elementos genéticos extracromosomales que codifican mecanismos de resistencia, entre los cuales se encuentran la producción de MBLs (19). Las MBLs principalmente encontradas en el continente americano son de la familia VIM, habiéndose reportado en dos hospitales de Caracas la enzima VIM-2 (20), lo cual es consistente con nuestros hallazgos. Los genes que codifican a las MBLs son transmisibles ya que están frecuentemente asociados a plásmidos que también poseen ge nes que codifican enzimas modificadoras de aminoglucósidos (21,22,23), esto explica la resistencia a β-lactámicos y aminoglucósidos encontrados en las ce pas estudiadas. Adicionalmente, P. aeruginosa puede presentar resistencia a otros grupos de antimicrobianos, incluyendo al aztreonam, lo cual puede deberse a otros mecanismos de resistencia que posea la bacteria como pérdida de porinas, hiperproducción de AmpC, producción de β-lactamasas de espectro expandido y modifi cación de las 20

5 topoisomerasas II y IV (8,24). En el con tinente americano se han detectado las MBL: IMP-1, IMP-7, IPM-16, VIM-2, VIM-7, VIM-8 y SPM-1, muchas de las cuales han sido reportadas en P. aeruginosa (25). La primera VIM-2 de Suramérica fue reportada en el año 2002 en Chile y Venezuela (20). Otro estudio realizado en nuestro país evidencia la tendencia de la resistencia a los antibióticos β-lactámicos y otros antimicrobianos en cepas de P. aeruginosa aislada en hospitales públicos y privados, resultando en una mayor resistencia en cepas nosocomiales provenientes de hospitales públicos que aquellos provenientes de hospitales privados, donde cefepime e imipenem muestran menor resistencia en los centros privados en comparación con los públicos; también se observó un aumento progresivo de la resistencia ante todos los antibióticos β-lactámicos útiles para el tratamiento de infecciones por P. aeruginosa. Esta resistencia se ha encontrada asociada con un elevado uso de antimicrobianos en los hospitales (26). P. aeruginosa es un reconocido patógeno nosocomial que ha incrementado sus niveles de resistencia, y esto se puede atribuir a una combinación de factores, tales co mo inadecuado control de infecciones nosocomiales en presencia de carbapenemasas tipo VIM, ya que es - tos genes están generalmente ubicados en integrones que contienen genes estructurales que pueden conferir re sistencia a múltiples antibióticos. La presencia de metalo-β-lactamasas en microorganismos de nuestros hospitales reviste gran importancia, ya que puede traer graves consecuencias debido a que los elementos genéticos que codifican estos determinantes de resistencia pueden ser transferidos desde P. aeruginosa a otros bacilos Gram negativos como Es - che richia coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter spp, por nombrar algunos. Este fenómeno ya ha sido reportado en Australia (8). Si esto sucede, tendremos como consecuencia la producción de infecciones nosocomiales producidas por bacilos Gram negativos multirresistentes (incluyendo resistencia al imipenem y meropenem), con la consecuente elevación de la estancia hospitalaria, mortalidad y costos. En conclusión, reportamos la presencia de genes bla VIM-like en P. aeruginosa, lo que sugiere la emergencia de este tipo de mecanismos de resistencia en Vene - zuela que le confieren alto nivel de resistencia a los antibióticos β-lactámicos, por lo cual se hace necesaria la implementación en nuestros hospitales de adecuados programas de control de infecciones nosocomiales, ya que estos genes tienen la capacidad de diseminarse ho - rizontalmente a cepas del mismo género e incluso a otras familias bacterianas, limitando las opciones terapéuticas. En nuestros laboratorios de microbiología es importante realizar de forma rutinaria la búsqueda y ca - rac terización de los mecanismos de resistencia a los antibióticos β-lactámicos de este tipo de cepas, ya que la opción terapéutica es el aztreonam, y la presencia de mecanismos de resistencia a betalactámicos como las Betalactamasas de espectro expandido, limitaría su uso y complicaría la terapéutica antimicrobiana. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Giamarellou Helen. Prescribing guidelines for severe Pseu domonas infections. Journal of Antimicrobial Che - mother. 2002; 49: Jordi V, Francesc M. Lectura interpretada del antibiograma de bacilos gramnegativos no fermentadores. Enferm Infec Microbiol Clin. 2002; 20: Jacoby GA, Munoz-Price LS. The New β-lactamases. New Engl J Med. 2005; 352: Rossolini Gian M. Acquired Metallo-β-lactamases: An In - creasing Clinical Threat. Clin Infect Dis. 2005; 41: Murphy T, Simm A, Toleman M, Jones R, Walsh T. Bio che - mical characterization of the adquired Metallo β-lactamases SPM-1 from Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 2003; 47: Toleman M, Biedenbach D, Bennett D, Jones R, Walsh T. Italian metallo β-lactamases: a national problem? Report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Programme. J Antimicrob Chemother. 2005; 55: Sader H, Castanheira M, Mendes R, Toleman M, Walsh T, Jones R. Dissemination and diversity of metalo β-lactamases in Latin America: report from the SENTRY Anti mi - crobial Surveillance Program. Int J Antimicrob Agents : Peleg A, Franklin C, Bell J, Spelmam D. Dissemination of the metallo β-lactamase gene bla IMP-4 among gramnegative pathogens in a clinical setting in Australia. Clin Infect Dis. 2005; 41: Bush K, Jacoby M, Medeiros A. A Funtional Classification Scheme for β-lactamases and Its Correlation with Mo - lecular Structure. J Antimicrob Chemother. 1995; 39:

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