Metodologías básicas del procesamiento de Proteinas

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Josefa Calderón Rojo
hace 8 años
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1 Metodologías básicas del procesamiento de Proteinas Alejandra Kun Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos-IIBCE Unidad Asociada Sección Bioquímica Facultad de Ciencias 13 de octubre 2014 Curso Introducción a la Biología II

Nucleicos-IIBCE Unidad Asociada Sección Bioquímica

2 Proteínas

5 Cada compartimiento celular está caracterizado por un RER Golgi libres grupo de proteínas específico cuya síntesis ocurre localmente

6 COOH NH 3 + C H R

8 Hay 20 aminácidos distintos y se unen formando cadenas

9 hidrófobos polares ácidos basicos

10 Aminoácido Código de tres letras Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido aspártico Asp D Cisteína Cys C Glutamina Gln Q Ácido glutámico Glu E Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptófano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Val V Código de una letra

His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina

11 Niveles de organización en la proteína

12 Puentes de hidrógeno

13 Puentes de hidrógeno ALFA HELICE

14 Puentes de hidrógeno LAMINA BETA PLEGADA

15 Cada compartimiento celular está caracterizado por un RER Golgi libres grupo de proteínas específico cuya síntesis ocurre localmente

17 Las proteínas celulares serán extraídas desde los compartimientos celulares a los que pertenecen para ser estudiadas por diferentes métodos basados en la identificación de algunos de sus parámetros específicos

ser estudiadas por diferentes métodos basados en la

18 Se aprovechan las propiedades de las proteínas en solución para separar mezclas de éstas basándose en su: Tamaño (peso) molecular; Solubilidad; Carga eléctrica; Afinidad biológica por otras moléculas.

19 1. purificación * Homogenización: rotura de membranas celulares * Liberación del contenido celular al medio

21 2. Separación - Cromatografía - Electoforesis

22 Tipos de cromatografía

24 - Electroforesis

27 -SDS detergente iónico carga elétrica - Mercaptoetanol grupos SH

30 Isoelectroenfoque (electroforesis 2D)

31 3- Inmuno-detección de proteinas Inmunoblotting

32 Inmunolocalización de proteínas in situ

33 Las técnicas de inmunomarcado ( e.g. Inmunocitoquímicas), han surgido en respuesta a la necesidad de caracterización y de localización específica de diferentes componentes tisulares y celulares. Es una herramientas de reconocimiento, basada en la interacción antígeno-anticuerpo. La formación del complejo antígeno-anticuerpo puede ser reconocida y visualizada con diferentes marcadores o sistemas de marcadores.

34 Métodos de marcaje: El objeto a ser reconocido debe tener la 1- capacidad directo: de anticuerpo unirse a específico un anticuerpo marcado o a un sistema 2- indirecto: cuyoanti-anticuerpo efector final seamarcado un anticuerpo unido a un marcador. 3- puente 4- antigeno marcado

38 Caracteristicas: 1- disponer de cantidades de anticuerpos específico del orden de 1 mg. 2- se pueden reconocer todos los antígenos deseados. 3- limitados por: a. el sistema de marcaje b. el sistema de detección.

39 Características: 1- El anti-anticuerpo se aplica en exceso, 2- reconoce la región Fc del anticuerpo específico

41 Marcadores: -Enzimas, que precipitarán sustratos específicos, de manera irreversible (MO y ME). -Fluorócromos, captan luz a una longitud de onda (exitándose) y emiten luz a una longitud de onda mayor (al desexitarse, MO). - Ferritina, en ME (12nm ø), unido a Ig. - Oro coloidal Partículas de tamaños variables (2nm a 150nm). Complejos proteicos estables, conservan actividad biológica. Para ME y MO con amplificación por precipitación de Ag (el oro cataliza la reducción del ión plata a plata metálica en presencia de un agente reductor). Unido a Ig o Proteína A.

42 - Marcadores fluorescentes, alta sensibilidad y poder de resolución, en Microscopía Confocal.

43 Tubulina Actina Lípidos polares de las membranas(oso4) Neurofilamentos csch ax Incisuras vistas por Cajal, 1928 Fibras aisladas, Sistema Nervioso Periférico.

44 Parvalbúmina en cerebro de ratón. Inmunotinción con oro 25 nm previa a la inclusión. D, dendrita inmunoreactiva.

45 Filamentos de desmina marcada usando Ultra small gold conjugado y amplificación con plata (R-GENT SE-EM, Aurion). RE marcado con COPII en criosecciones de células Hepg2 y revelado con anticonejo unido a Ultra- Small gold y amlificación de plata

46 Resumen Las proteínas pueden ser estudiadas extrayéndolas de los compartimientos celulares que integran o ser estudiadas in situ, en el mismo compartimiento. Se pueden analizar diferentes parámetros: Tamaño (peso) molecular, solubilidad, carga eléctrica, afinidad biológica por otras moléculas. Extracción: a) fraccionamiento subcelular (homogenización, centrifugación, ultracentrifugación, separación en gradientes por velocidad de sedimentación o de densidad). b) separación (cromatografía: intercambio iónico, gel filtración, afinidad, electroforesis: PM, Punto isoeléctrico). * Estudios in situ: Inmunolocalización celular o ultraestructural. La formación del complejo antígeno-anticuerpo puede ser reconocida y visualizada con diferentes marcadores o sistemas de marcadores (MO y ME).

47 Bibliografía consultada: Biología molecular de la Célula. Alberts, Bray, Lewis, Raf, Roberts, Watson. Editorial Omega, Lehninger Principios de Bioquímica. Nelson, Cox. Editorial Omega, 2000 Nature Methods, Vol. 2, Nº 12, Diciembre 2005.

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