Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Transcripción

1 Dra. Conxi Lázaro Unidad Diagnóstico Molecular Programa de Cáncer Hereditario Instituto Catalán de Oncología (ICO-IDIBELL)

2 (ICO) Es un centro público y monográfico sobre càncer 50% pacientes con cáncer en Catalunya Asistencia Tratamiento de los enfermos Investigación Básica-clínica sobre cáncer Prevención - Medidas para evitar cáncer Formación cursos especializados

3 Programa Cáncer Hereditario ICO GIRONA Hospital Universitari Dr. Josep Trueta Unidades Cáncer Familiar Manresa y Vic ICO L HOSPITALET Hospital Duran i Reynals Hospital Universitari de Bellvitge Igualada Martorell Sant Boi de Llobregat Sant Pere de Ribes Viladecans Vilafranca del Penedès Blanes Calella Figueres Olot Palamós Santa Caterina, Girona Vic ICO BADALONA Hospital Universitari Germans Trias i Pujol Badalona Sta. Coloma de Gramenet 50% pacientes con cáncer en Cataluña

4 Cáncer... Hanahan and Weinberg, 2011 Factores Ambientales Factores Genéticos... una enfermedad compleja y multifactorial

5 Hereditary Cancer Syndromes Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014 Nagy et al., Oncogene 2004 d'oncologia

6 Qué es el diagnóstico genético? Para qué sirve? A quién beneficia? 85 CM d. 50 Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014 CM d Mut BRCA2 39 a WT WT WT 54 a CM dx a 50 a 49 a 28 a 22 a 26 a 24 a 18 a 21 a 17 a 11 a 8 a WT Mut BRCA2

7 Hereditary Cancer Program Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014 Main Goal Identify at risk patients and families to provide: Early Diagnosis (presymptomatic, sometimes prognosis) Prevention Strategies Treatment Options Reproductive Options Improve knowledge of mutational spectrum genotype-phenotype correlations, mutation-driven therapies

8 Consejo Genético Cirugía Ginecología Gastroenterología Oncología Patología > Familias pacientes portadores, alto riesgo, seguimiento intensivo pacientes no portadores, riesgo y seguimiento poblacional > Individuos Diagnóstico Genético 423 portadores APC 763 portadores MMR 1008 portadores BRCA 380 NF1 y otros síndromes minoritarios

9 ICO-IMPPC Programa Conjunto en Cáncer Hereditario Cáncer Hereditario Genes analizados Técnicas utilizadas % mutationes detectadas % tipos de mutación Tiempo medio del estudio genético Cáncer Colorrectal Hereditario (P) APC MUTYH MLPA Secuenciación Sanger Cáncer Colorrectal Hereditario (NP) MLH1 MSH2 MSH6 PMS2 MLPA MSI, IHQ Secuenciación Sanger Cáncer de Mama y Ovario Hereditario BRCA1 BRCA2 TP53 PALB2 MLPA CSCE Secuenciación Sanger Otros Síndromes de Cáncer NF1 NF2 SPRED1 SMARCB1 MLPA/qPCR Secuenciación Sanger MMPD ~90% ~50% ~20% ~90-95% 5% largas deleciones 95% mut. puntuales 5% largas deleciones 95% mut. puntuales 5% largas deleciones 95% mut. puntuales 2-4 m 2-4 m 2-4 m 5% largas deleciones 95% mut. puntuales 2-4 m (casos nomosaicos)

10 Secuenciación Sanger Sanger: Labor intensiva Elevado consumo tiempo Productos Costosos Complejidad técnica

11 Nuevas Plataformas de Secuenciación Masiva (NGS) Características: Tecnología de Secuenciación Masiva en Paralelo Gran capacidad, obtención millones secuencias Precio muy bajo / base Limitaciones: Lecturas cortas ( bp, 400 bp Roche) Menor Precisión: al menos 10 veces menos preciso que Sanger Ficheros de datos e imágenes del orden de terabytes: importante infraestructura computacional y de análisis e interpretación de resultados

12 Se puede utilizar hoy las nuevas plataformas de Next Generation Sequencing en el seno de laboratorios de diagnóstico genético rutinario?

13 Medicina siglo XXI: Uso tencologías NGS Labor intensiva Elevado consumo tiempo Productos Costosos Simplificar y armonizar Calidad Complejidad técnica

14 Secuenciación Sanger vs NGS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014 Sanger: Paciente 1 E1 E2 E3 E4 E5 E6 Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4 30 amplificaciones x 2 secuencias (F/R) = 60 reacciones de secuenciación Paciente 5 NGS: Paciente 1 E1 E2 E3 E4 E5 E6 Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4 1 única reacción de secuenciación Paciente 5

15 Plataformas NGS escala pequeña-media

16 Cáncer de mama y ovario hereditario (CMOH) Batch of samples MLPA SNPlex No mutation Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014 CSCE 79 fragments Balmain etal 2003 Nat Genet Suppl: 238 No shift Mutation Shift Confirmation BRCA1: 17q12, 84 kb genomic, 7.8 kb mrna, 1863 AA Sequencing Pathogenic mut. BRCA2: 13q12, 86 kb genomic, 12 kb mrna, 3418 AA Report USV Polymorphism No mutation ICO workflow for BRCA1 / BRCA2 mutational screening

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18 Podemos utilizar NGS para BRCAs y por qué utilizar NGS? CMOH BRCA1/2 CSCE / Sanger Confirmación Resultados Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014 Secuenciación Sanger CMOH BRCA1/2 NGS Confirmación Resultados Secuenciación Sanger - Disminuir costes - Disminuir tiempo entrega resultados - Optimizar recursos - Mejorar sensibilidad

19 Secuenciación NGS 1 Preparación Muestra 2 Enriquecimiento 3 Amplificación Diana Clonal 4 Inmovilización 5 Secuenciación

20 2 Enriquecimiento Diana

21 NGS para análisis mutacional genes BRCA1/BRCA2 - Generación librería de 93 amplicones - 5 multiplex PCR para cada paciente - Cubrir regiones codificantes y regiones intrónicas adyacentes de BRCA1 i BRCA2 Plex 1 Plex 2 Plex 3 Plex 4 Plex 5

22 Pasos NGS para amplicones y GS-Junior Congreso Nacional del Laboratorio Clínico Amplificación de la región codificante y regiones intrónicas adyacentes de BRCA1/2 (5 Multiplex 93 amplicones) Mezcla de las 5 Multiplex PCR de cada individuo en 1 pool Purificación del pool con AMPureXP kit Cuantificación de los pools Mixing de 7/8 individuos 2 Amplificación clonal: Química Roche 454 Before PCR After PCR 3 Inmovilización bolas enriquecidas 4 Secuenciación: Pirosecuenciación Roche GS Junior

23 Pirosecuenciación Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014 Bases (TACG) son liberadas secuencialmente a través de la PicoTiterPlate durante la carrera de secuenciación Un nucleótido complementario al DNA molde genera una señal de luz registrada por una cámara La intensidad de la señal es proporcional al número de nucleótidos incorporados Homopolymer testing BRCA HP Assay

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25 Prueba de concepto diagnóstico BRCA1/BRCA2 Validation of the NGS WORKFLOW TRAINING SET Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014 Homopolymer testing BRCA HP Assay 28 HBOC samples 23 pathogenic variants 213 other variants 14 samples Experiment 1: BRCA MASTR v1.2 (170 amplicons) Experiment 2: BRCA MASTR v2.0 (94 amplicons) Runs R1, R2, R3, R4 Runs R5, R6 VALIDATION SET Definition of a NGS WORKFLOW 15 HBOC samples 14 not previously tested 1 multi-exon duplication CURRENT WORKFLOW Sequenom CSCE Sanger sequencing Homopolymer testing BRCA HP Assay NGS WORKFLOW Experiment 3: BRCA MASTR v2.1 (93 amplicons) Runs R7, R8, R9

26 Algoritmo de análisis NGS propuesto Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

27 Prueba de concepto diagnóstico BRCA1/BRCA2 Training Set Validation Set GS Junior* +Visual review +HP Kit Congreso Nacional del Laboratorio Clínico Sanger GS Junior* +Visual review +HP Kit +Sanger TRUE TRUE FALSE FALSE Variants in low coverage Sensitivity Specificity Sensitivity=100% Specificity=100%

28 Coste-Efectividad Algoritmo Basado en NGS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico ENRIQUECIMIENTO Preparación Muestras Mplx PCR MID PCR PCR Marcaje Análisis Genescan Cuantificación Picogreen Mezcla y Purificación Cuantificación Picogreen 3 días Día 1 2h Día 2 8h Día 3 5h - AMPLIFICACIÓN CLONAL INMOVILIZACIÓN SECUENCIACIÓN 2 días (2h + O/N) (4h) 1 día (4h) - ANÁLISIS 1 día SECUENCIACIÓN SANGER: 3 días (no completos ) + TIEMPO TOTAL 10 DÍAS COSTE TOTAL Fungible: -57% Técnico

29 Resultados reales utilizando nuestro algoritmo NGS 71,9% 28,1% 56% 44% HBOC patients 540 Point Mutations 152 PAT+pPAT 85 USV 67 Negative for BRCA point mutations 388

30 Podemos utilizar NGS para BRCAs y por qué utilizar NGS? Congreso Nacional del Laboratorio Clínico Disminuir costes - Disminuir tiempo entrega resultados - Optimizar recursos

31 Genetic diagnostics of HNPCC and FAP by NGS Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (HNPCC), Lynch syndrome, is caused by germline mutations in mismatch repair genes: MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2. Familial adenomatous polyposis (FAP), the classical form is caused by germline mutations in APC gene and the attenuated one by germline mutations in MUTYH and APC genes. We have implemented a next generation sequencing (NGS) workflow to analyze point mutations in all these genes based on multiplex PCR and NGS. Multiplicom HNPCC MASTR, In five multiplex PCR reactions 82 fragments are amplified. Multiplicom FAP MASTR, is a kit for mutations detection in APC and MUTYH genes. In three multiplex PCR reactions 52 fragments are amplified. Multiplex PCR Pyrosequencing

32 Mutaciones localizadas en zonas de homopolímeros (B009 HP2) BRCA2: c.1587deltinsca BRCA2: c.5722_5723delct

33 BRCA1 c.128dela

34 BRCA1 c.3607c>t

35 BRCA1 c.1961dela, VP con AVA

36 BRCA1 c.1961dela, FP con AVA

37 BRCA1 c.1961dela, identificada usando HP assay BRCA1_HP004

38 BRCA1 c.1961dela, identificada en GS de BRCA MASTR

39 c.3331_3334delcaag, con BRCA HP assay Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

40 c.3331_3334delcaag, con GS de BRCA MASTR Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

41 NGS para la detección de grandes reordenamientos Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

42 ICO Amplicon NGS Data Analysis Congreso Nacional del Laboratorio Clínico Application to analyze reads from GS Junior (454-Roche) experiments using amplicon MASTR libraries (Multiplicom). Coverage and Variant reports will be produced. - Web page:

43 López-Doriga et al. Human Mutation 2013

44 Anticipated Results: Variant and Coverage Reports

45 Cáncer Hereditario Cáncer Colorrectal Hereditario (P) Cáncer Colorrectal Hereditario (NP) Cáncer de Mama y Ovario Hereditario Otros Síndromes de Cáncer Genes analizados APC MUTYH MLH1 MSH2 MSH6 PMS2 Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014 ICO-IMPPC Programa Conjunto en Cáncer Hereditario BRCA1 BRCA2 TP53 PALB2 NF1 NF2 SPRED1 SMARCB1 Técnicas utilizadas MLPA Secuenciación Sanger MLPA MSI, IHQ Secuenciación Sanger MLPA CSCE Secuenciación Sanger MLPA/qPCR Secuenciación Sanger MMPD % mutationes detectadas % tipos de mutación Tiempo medio del estudio genético ~90% ~50% ~20% ~90-95% 5% largas deleciones 95% mut. puntuales 5% largas deleciones 95% mut. puntuales 5% largas deleciones 95% mut. puntuales 5% largas deleciones 95% mut. puntuales 2-4 m 2-4 m 2-4 m 2-4 m (casos no-mosaicos)

46 Cancer Gene Census (13/10/2014) 522 cancer genes 483 mutated somatically ( 90%) 82 mutated in the germline ( 20%) 42mutated somatically and in the germline ( 10%)

47 Near future: hereditary cancer genes screened by NGS NF HBOC HNPCC FAP 1. Hereditary cancer risk assesment blood genomic DNA blood genomic DNA blood genomic DNA blood genomic DNA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico DNA from index individual NF1+SPRED library with MID1 BRCA1+BRCA2 library with MID2 MLH1/MSH2/MSH6/PMS2 library with MID3 APC/MYH library with MID3 3. Gene/s of interest enrichment and MID incorporation Equimolar mix of fragments of several individuals (each enriched for its corresponding gene/s, with a different MID) 4. Quantification and mixing 5. NGS and mutation reporting

48 Diagnóstico genético Cáncer Hereditario con NGS Sub-exoma de >100 genes 40 Tipos de Cánceres Hereditarios 9 Tipos de Rasopatías Facomatosis Por qué tantos genes a la vez? Heterogeneidad genética Solapamiento clínico entre diferentes entidades Nos puede ayudar a buscar genes modificadores de la severidad en cuanto a neoplasias desarrolladas? Mosaicismo

49 Diagnóstico genético para la NF1 basado en NGS Ejemplo: Niño 9 años Manifestaciones clínicas NF1 Múltiples CALM Síndrome Noonan Cara característica, estatura baja, anomalías musculares, etc. No se identificaron mutaciones en los genes responsables de Noonan: - PTPN11- NRAS - SOS1- RAF1 - KRAS - BRAF1 - MAP2K2

50 Diagnóstico genético para la NF1 basado en NGS Una mutación missense (p.lys 1436Glu ) se identificó en una región importante (GRD) de NF1 Mutaciones en el dominio GRD de NF1 se ha descrito en pacientes con características NF1- Noonan (OMIM ) (De Luca et al, Am.J.Hum:Genet; 2005)

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52 Summary of Strengths and Weaknesses of NGS-based methods for Dx Purposes Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014 STRENGTHS Simplify workflow Same methodology for various genes Reduced cost of the test (specially, if multiple genes) Reduced Turn Around Time (TAT) Higher capacity to detect mosaicism Possibility of detecting copy number changes (CNC) although depending on the methodology used and the ulterior bioinformatic analysis. Needs to be specifically validated! WEAKNESSES DNA based method, problem with mutations affecting splicing in noncanonical sequences and with deep intronic mutations Importance of determining parameters to obtain required quality for diagnosic purposes (evaluation of sensitivity and specificity is mandatory) Functional effect is not assessed, as for some mutations in RNA-based methods where both DNA and RNA levels are compared More genes studied but more USV identified. Clinical challenge due to lack of functional assays for USV interpretation!

53 Programa Cáncer Hereditario ICO Programa Conjunto ICO-IMPPC Cáncer Hereditario 2009SGR290

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57 Mejorando el diagnóstico genético Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

58 Innovación: actualización del diagnóstico genético Secuenciación por Sanger : Secuenciación de Nueva Generación (NGS) : Lectura de secuencias por Sanger GS Junior (pyroseq) Ion Torrent ( ph seq ) Lectura de secuencias por NGS Plataforma de Genética y Predisposición al Cáncer Plataforma de Genética y Predisposición al Cáncer

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60 Anticipated Results: IGV Alignments Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

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