Diseño de un nuevo test NGS para el análisis ru5nario de cáncer hereditario

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Agustín Toledo Cuenca
hace 8 años
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1 Diseño de un nuevo test NGS para el análisis ru5nario de cáncer hereditario Dr. Alberto Acedo Centro de Diagnós4co gené4co AC- Gen Reading S.L. Valladolid, 5 de marzo de 2014

2 El cáncer: datos epidemiológicos casos anuales Cáncer Hereditario 5-10% Agregación familiar 10-20% Esporádico 70%

3 El cáncer hereditario: modelo de herencia dominante Mutaciones en línea germinal Modelo Two hit Knudson

4 Cáncer de mama y ovario hereditario Riesgo CM a los 70 años población control: 7% BRCA1 CM 85% CO 39% (18%-54%) BRCA2 CM 85% CO 11% (2,1%-19%) CM 6,9% c. colon, próstata (x3) y páncreas c. próstata (x4.5) y páncreas Thompson y Easton (2001) 16% icogs (Nature, 2013)

CO 11% (2,1%-19%) CM 6,9% c. colon, próstata (x3) y páncreas c.

5 Cáncer de colon hereditario No Polipósico Síndrome Riesgo de CCR Otros cánceres (riesgo) Síndrome de Lynch 70-85% Lynch et al. Cancer 2004; 100: MMR=mismatch repair; FAP=familial adenomatous polyposis; AFAP=aienuated familial adenomatous polyposis; HBCC=hereditary breast and colorectal cancer; PJS=Peutz Jeghers syndrome; FJP=familial juvenile polyposis; CD=Cowden's disease; BRRS=Bannayan Ruvalcaba Riley syndrome. Carcionma de ovario (9%) Gástrico (19%) Tracto urinario (10%) Intes4no y vías biliares (18%) Aarnio M. et al., 1995 Polipósico Síndrome Riesgo de CCR Otros cánceres (riesgo) Poliposis Adenomatosa familiar Síndrome de Peutz- Jeghers 100% en forma clásica 60% forma atenuada Duodeno (4-12%) Estómago (0,5%) Hepatoblastoma (1,6% en niños < 5 años) Páncreas (2%) SNC: Turcot (<1%) Estómago (30%) 40% Intes4no delgado (13%) Mama (54%) Páncreas(36%) Endometrio (9%) Cérvix (<0,5%) Ovario (21%) Tesaculo (<1%) Estómago (<0,5%) Duodeno (<0,5%) Poliposis Juvenil 40% Mama (20-50%%) Tiroides (3-10%) Estómago (<0,5%) Duodeno (<0,5%) Síndrome de Cowden Poliposis asociada al gen MYH Mama (25-50%) Tirorides (3-10%) >50% Duodeno (4%)

polyposis; CD=Cowden's disease; BRRS=Bannayan Ruvalcaba Riley syndrome. Carcionma de ovario (9%) Gástrico (19%) Tracto urinario (10%) Intes4no y vías biliares (18%) Aarnio M. et al.

6 HC- Gen Test Genes y SNPs incluidos GENES BreastSeq OvaSeq ColonSeq PancSeq BRCA1 BRCA2 ATM BARD1 BRIP1 FAM175A MRE11A NBN RAD50 RAD51D RAD51C XRCC2 89SNP PALB2 STK11 CHEK2 PTEN TP53 CDH1 MUTYH MLH1 MSH2 MSH6 EPCAM PMS2 APC BMPR1A SMAD4 AXIN2 BLM ENG KIT MLH3 MSH3 PDGFRA PIK3CA PMS1 SCG5 Targeted Sequencing - Regiones exónicas de interés - Mejor cobertura y más homogénea - Menos variantes detectadas (falsos posi5vos y nega5vos) - Comparación rápida con bases de datos - Mul5plexado de las muestras - Reducción de costes

MSH3 PDGFRA PIK3CA PMS1 SCG5 Targeted Sequencing - Regiones exónicas de interés - Mejor cobertura y más homogénea - Menos

9 Comprobación del diseño con Human Genome Browser

11 Workflow: Secuenciación con Haloplex Extracción DNA librería Template Secuenciación Análisis Pureza: OD 260/289 1,8-2 Integridad Comprobación

12 Preparación de librería con Haloplex librería Paso 1: Diges5ón de DNA genómico 225ng en 45 ul (5ng/ul) (+/- 1) 8 reacciones de diges4ón independientes Paso 2: Hibridazión y barcoding No juntar las reacciones de diges4ón, añadir una a una en la solución de hibridación Barcode Paso 3: Captura de DNA Bio4nina + bolas de estreptavidina Paso 4: Ligación Paso 5: Amplificación y Purificación

juntar las reacciones de diges4ón, añadir una a una en la solución de hibridación Barcode Paso

13 Preparación de librería con Haloplex. Punto de control 1 Evaluación de las 8 reacciones de diges5ón Sólo de la muestra control

14 Preparación de librería con Haloplex. Punto de control 2 Validación y cuan5ficación de cada librería generada Adapter- dimer - 10% pmol/l 500pM 100pM 15pM Haloplex adaptador 3 específico

cada librería generada Adapter- dimer - 10% 31.

15 Datos reales de secuenciación 1: ISP ac5vas

16 Datos reales de secuenciación 2: Estadís5cas de lecturas

17 Datos reales de secuenciación 3: Longitud de lecturas

18 Datos reales de secuenciación 4: calidad de lecturas

19 Alineamiento contra genoma de referencia

20 Llamada de variantes: Target o covered? Target Regions Covered

21 Aplicación HC- Gen test en cáncer de colon Tendencia y distribución municipal del cáncer colorrectal en el área de salud de León % 41%

22 Caso 1. Síndrome de Lynch

23 Caso 1. Resultados y validación! Gen$ Cambio$en$el$ADN$ Cambio$en$el$Aminoácido$ Tipo$ mutación$ Valoración$ MLH1$ c.22_37del$ p.i8rfs*4$ frameshift$ Patogénica$

24 Caso 2. Poliposis juvenil Colon 50 55/65 Colon Pulmón 52 Colon 65 Colon Pulmón

25 Caso 2. Resultado complejo de evaluar Gen$ Cambio$en$el$ADN$ Efecto$en$la$ proteína$ Estado$ Tipo$de$ mutación$ Valoración$ BMPR1A$ c.1327c>t$ p.r443c$ Het$ Missense$ Patogénica$!

26 Caso 2. Evidencias in silico y funcionales de patogenicidad Gen$ Cambio$en$el$ADN$ Efecto$en$la$ proteína$ Estado$ Tipo$de$ mutación$ Valoración$! BMPR1A$ c.1327c>t$ p.r443c$ Het$ Missense$ Patogénica$ Resultados*de*la*predicción!In!silico!del*efecto*de*la*mutación*en*la*función*de*la*proteína*BMPR1A* Mutación* PhyloP* BLOSUM*62* SIFT* Poly*Phen2* LRT* Mutation*Taster* GERP++* c.1327c>t;p.r442c El. rango. para. los. predictores. PhyloP,. PolyPhen2,. LRT. y. Mutation. Taster. es. de. 0. a. 1,. siendo. >0,95. probablemente.patogénico.y.<0,05.probablemente.benigno..para.blosum.62,.el.rango.es.de.03.a.+3,.siendo. <.0.probablemente.patogénico..GERP++,.valores.>0.probabilidad.de.residuo.limitado.!

27 Dr. Alberto Acedo Dra. Beatriz Sobrino Dr. Eladio Velasco

28 AC- Gen Reading Life S.L. Parque Cienafico Universidad de Valladolid Edificio CTTA 2º Planta C/Paseo de Belén nº Valladolid - España Alberto Acedo PhD. acedo@acgen.es Tlf: Centro Autorizado de Diagnós5co Gené5co Premio de la Fundación Genoma España al Mejor Proyecto de Biotecnología.

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