PRO INVESTIGACION PARA LA REPARACION DE LA MEDULA ESPINAL)

Transcripción

1 Estimados Sr; La Asociación Pro Investigación para la Reparación de la Lesión Medular, es una asociación benéfica sin ánimo de lucro. Representamos a un colectivo de lesionados medulares cuyos objetivos son la financiación de proyectos de investigación sobre la reparación de la medula espinal, programas de rehabilitación en pacientes con lesiones medular y o cerebral así como de dotar de medios y personal cualificado para la rehabilitación de este tipo de personas. Entre nuestros objetivos actuales se encuentra la colaboración con la FUNDACION HOSPITAL UNIVERSITARIO DE PUERTA DE HIERRO MAJADAHONDA (MADRID), ya que está desarrollando una terapia pionera para la Regeneración de la Medula Espinal, a nivel de ensayo en humanos por el Doctor D. Jesús Vaquero y su equipo. Es un proyecto muy prometedor que puede ser un logro a corto plazo sin precedentes en la regeneración de la lesión medular. Los resultados en animales han sido muy buenos, pero ahora falta ver su comportamiento en humanos. Para esto se hace necesario contar con una SALA BLANCA o GMP (Good Manufacturing Practices), donde manipular con total garantía las células y poder posteriormente aplicarlas a los pacientes. Ahora mismo el departamento de investigación del hospital no cuenta con el suficiente presupuesto para dotar de todo lo necesario el proyecto. Nos enteramos y nos hemos reunido con ellos en el HOSPITAL UNIVERSITARIO DE PUERTA DE HIERRO MAJADAHONDA, el pasado día 28 de Enero 2010, con objeto de ofrecerles nuestra colaboración (en representación de la ASOCIACION PRO INVESTIGACION PARA LA REPARACION DE LA MEDULA ESPINAL). Ayudarles a conseguir el dinero que falta para completar el proyecto aproximadamente ( ), que no se paralice el ensayo en humanos más tiempo, se ha convertido en nuestro objetivo. Una vez este la Sala GMP validada y acreditada, se iniciarían de forma inmediata los ensayos en los pacientes SI LO INTENTAMOS PODEMOS PERDER PERO SI NO ESTAMOS PERDIDOS Página 1

2 seleccionados, pues ya dispone de las correspondientes autorizaciones hace más de dos años. Tanto la Fundación para la Investigación Biomédica Hospital Universitario Puerta de Hierro Majadahonda como el Doctor D. Jesús Vaquero, han aceptado nuestra colaboración y así nos han facilitado los documentos donde se reconoce de forma oficial. Estos documentos van a continuación de este escrito. Para esto la Asociación organiza un evento deportivo denominado FREE&SPEED STYLE con la colaboración de los más reputados pilotos a nivel Nacional. El evento benéfico se realizara en el COLISEUM DE ATARFE, Atarfe (Granada), contamos con la colaboración totalmente desinteresada por parte de los mejores pilotos a nivel nacional, la Federación Nacional y Andaluza de Motociclismo, así del como el Excmo. Ayuntamiento de Atarfe. El Evento se celebrará el día 24 de Abril próximo. Para llevar a cabo el citado evento se hace necesaria la colaboración de Patrocinadores, que deseen participar con la Asociación Pro Investigación para la Reparación de la Lesión Medular a llevar a cabo el evento Estaríamos encantados que aquellas empresas, instituciones, o particulares que deseen patrocinar el evento se pusieran en contacto con nosotros, para facilitarle cuantos datos fueran necesarios y acordar la mejor fórmula posible. Consideramos que la gran repercusión mediática del evento su difusión a nivel de toda la comunidad Andaluza, puede ser una gran oportunidad para las empresas interesadas de publicitarse además de colaborar con una causa benéfica. SI LO INTENTAMOS PODEMOS PERDER PERO SI NO ESTAMOS PERDIDOS Página 2

3 Aquellas personas, empresas o instituciones que estén interesadas en colaborar con el proyecto pueden dirigirse a cualquiera de los colaboradores del proyecto: David Aviles Correo electrónico: davidavilesmx@yahoo.es Móvil Jose Vicente Cuines Correo electrónico: jvc@incudi.com Móvil Federic Crespo Correo electrónico: info@foundationsbs.org Teléfono: Fax: En Colaboración con: Fundación para la Investigación Biomédica Hospital Universitario Puerta de Hierro Majadahonda, y cuyo destino principal son los cultivos celulares destinados a investigaciones neurológicas y rehabilitación de lesiones medulares que está llevando a cabo Dr. Jesús Vaquero C/ Joaquín Rodrigo, 2. Peine 7. Edificio Laboratorios. 3ª planta Majadahonda (Madrid), Documentación Adjunta: CERTIFICADO DE RECONOCMIENTO DE NUESTRA COLABORACION PARA LA CAPTACION DE RECURSOS EMITIDO POR LA FUNDACIÓN PARA LA INVESTIGACION BIOMEDICA DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO DE PUERTA DE HIERRO MAJADAHONDA. BREVE EXPOSICION DEL DOCTOR D. JESUS VAQUERO, SOBRE EL PROYECTO Y NECESIDADES. SALA GMP (GRIFOLS) Y PRESUPUESTO. PUBLICACION INTERESANTE SOBRE LA TERAPIA CELULAR EN EL TRATAMIENTO DE LA PARAPLEJIA TRAUMATICA: DEL LABORATORIO A LA CLINICA. RESULTADOS EN CERDOS (INGLES). 4 de Febrero 2010 SI LO INTENTAMOS PODEMOS PERDER PERO SI NO ESTAMOS PERDIDOS Página 3

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5 1 Madrid, 1 de Febrero de 2010 D. DAVID AVILES SANCHEZ Presidente ASOCIACION PRO INVESTIGACION PARA LA REPARACION DE LA LESION MEDULAR C/ Gardenia, 1. Bajo A GRANADA Estimado amigo: Siguiendo tu sugerencia, te remito un breve resumen de la situación actual de nuestro Proyecto. En el Hospital Universitario Puerta de Hierro-Majadahonda (Madrid) hemos desarrollado en los últimos 15 años una línea de investigación que tiene como finalidad lograr recuperación funcional en pacientes con lesiones traumáticas del Sistema Nervioso, y fundamentalmente en la paraplejia de origen traumático. En los últimos años hemos obtenido buenos resultados en modelos experimentales de paraplejia (sobre mamíferos superiores) mediante tratamientos de terapia celular (trasplante de células madre adultas), lo que nos ha permitido obtener autorizaciones para aplicar estas nuevas técnicas en pacientes, mediante ensayos clínicos controlados. A la hora de poder iniciar estos tratamientos en pacientes seleccionados, es absolutamente necesario contar con una sala de cultivo celular de alta seguridad biológica (salas blancas o salas GMP ), ya que las células madre adultas que se extraen al paciente y luego se implantan en las zonas de lesión del Sistema Nervioso, tienen que cultivarse y multiplicarse durante una serie de días, con el riesgo de contaminación si no se cuenta con las instalaciones adecuadas. Las subvenciones oficiales que hemos obtenido hasta ahora para desarrollar estos estudios nos han permitido sufragar nuestras investigaciones sobre animales y nos han llevado, después de varios años de investigaciones, a conocer y seleccionar el tipo de células madre adultas más útiles para este tipo de tratamientos. Sin embargo, las subvenciones de Proyectos de Investigación, otorgadas por organismos oficiales no están dirigidas por lo general a crear e instalar este tipo de salas y la mayor parte de las veces se hace necesario recurrir a donaciones de Fundaciones y Asociaciones sin ánimo de lucro, con lo cual se han montado ya en diversos hospitales salas de este tipo, generalmente aplicadas a tratamientos hematológicos y que no permiten, precisamente por la finalidad para la que se han creado, una disponibilidad para su uso en pacientes con lesiones del Sistema Nervioso. El hecho, además, de que estos nuevos tratamientos sean actualmente considerados como de terapias avanzadas, en fase de investigación clínica, y con eficacia, por lo tanto, aún no contrastada, dificulta aún más introducir estas técnicas en los hospitales públicos, ya que los recursos asistenciales son dirigidos, generalmente, a técnicas ya consolidadas en su cartera de servicios asistenciales. La experiencia preclínica de nuestro grupo de investigación con estas nuevas técnicas de terapia celular permite actualmente que el Hospital Universitario Puerta de Hierro sea considerado centro de referencia para el inicio de ensayos clínicos de este tipo sobre lesionados medulares, existiendo ya desde hace varios meses una consulta específica en que se valoran pacientes de todo el país, susceptibles de ser tratados mediante terapia celular con células madre adultas, pero necesitamos

6 2 para ello, con urgencia, poder montar una sala de cultivos celulares específica y dotarla con su necesario equipamiento. Hemos conseguido una oferta ajustada y muy satisfactoria, teniendo en cuenta la importancia clínica y trascendencia de nuestro proyecto y la posibilidad de que sentemos las bases para desarrollar en otros hospitales estos tratamientos (generalmente las salas de este tipo tienen un coste de unos euros y se nos ha hecho una oferta de euros). La dotación para esta sala requiere además una serie de equipos cuyo coste total asciende a euros. A estos costes habría que añadir los derivados de obras, personal, etc, que podrían ser asumidos por nuestro propio hospital, si pudiéramos contar con la subvención básica necesaria para la sala y su equipamiento. En cualquier caso, es básico y acuciante poder cubrir el presupuesto inicial de euros para montar la sala de cultivo, al objeto de poder iniciar los Ensayos Clínicos en pacientes con lesión medular. Me consta que has recibido la carta de D. Jesús Cubero Herranz, Director de la Fundación para la Investigación Biomédica de nuestro hospital, respaldando la solicitud y solicitando vuestro apoyo para poder lograr nuestro objetivo. Atentamente, Dr Jesús Vaquero Crespo Catedrático de Neurocirugía Hospital Puerta de Hierro-Majadahonda C/ Joaquín Rodrigo, Majadahonda (Madrid)

7 2 otros hospitales estos tratamientos (generalmente las salas de este tipo tienen un coste de unos euros y se nos ha hecho una oferta de euros). La dotación para esta sala requiere además una serie de equipos cuyo coste total asciende a euros. A estos costes habría que añadir los derivados de obras, personal, etc, que podrían ser asumidos por nuestro propio hospital, si pudiéramos contar con la subvención básica necesaria para la sala y su equipamiento. En cualquier caso, es básico y acuciante poder cubrir el presupuesto inicial de euros para montar la sala de cultivo, al objeto de poder iniciar los Ensayos Clínicos en pacientes con lesión medular. Me consta que has recibido la carta de D. Jesús Cubero Herranz, Director de la Fundación para la Investigación Biomédica de nuestro hospital, respaldando la solicitud y solicitando vuestro apoyo para poder lograr nuestro objetivo. Atentamente, Dr Jesús Vaquero Crespo Catedrático de Neurocirugía Hospital Puerta de Hierro-Majadahonda C/ Joaquín Rodrigo, Majadahonda (Madrid)

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9 HOSPITAL PUERTA DE HIERRO OFERTA Nº (06/10/2009) Grifols Engineering, S.A.

10 1. Misterium para terapia celular - Introducción Misterium es un kit de sala blanca modular, de fácil y rápido montaje, que tiene múltiples aplicaciones dentro del ámbito de la Industria Farmacéutica, Hospitales, Laboratorios y, en general, cualquier lugar donde se requiera un recinto cerrado, aislado y de fácil limpieza. El nombre del producto, Misterium, proviene de mini sterile room. Misterium es una marca registrada y patentada por Grifols, S.A. y fabricada por Grifols Engineering. - Bases de diseño Para el diseño de las salas limpias Misterium, se tendrán en cuenta las siguientes especificaciones Sala R/h Presión Caudal Clasif. según relativa (1) impulsado diseño (2) Presala D Pa 150 m 3 /h D Presala C Pa 300 m 3 /h C Presala B Pa 300 m 3 /h B Sala de trabajo Pa 900 m 3 /h B Almacén Pa 600 m 3 /h D (1) Presión relativa respecto al exterior (2) Clasificación según Normas de Correcta Fabricación de la Unión Europea (1) Presión relativa respecto al exterior (2) Clasificación según Normas de Correcta Fabricación de la Unión Europea La altura interior de la sala principal será de 2,4 metros. - Componentes La sala modular Misterium estándar está compuesta por: a) Paneles techos y paredes, b) Suelos c) Ventanas d) Puertas e) Luminarias f) Unidad de impulsión de aire a través de filtro HEPA De climatización De filtración g) Cuadro de control eléctrico Página 2 de 10

11 - Características técnicas de los componentes - Paneles, techos y paredes El módulo está construido con paneles de tipo sandwich de espesor 60 mm fabricados por la firma Dagard. El alma es aislante de espuma rígida de poliuretano de alta densidad inyectada entre dos chapas de acero lacado al horno de color blanco de 0,6 mm. El panel viene de fábrica protegido por ambas caras con un film adhesivo transparente a retirar después del montaje. El techo es transitable. Datos técnicos paneles. Conductividad térmica: 0,023 W/m.ºC (poliuretano) Densidad media: 40 Kg/m 3 Clasificación de resistencia al fuego: M1 El sistema de unión entre paneles permite el paso de los cables eléctricos correspondientes a todos los elementos eléctricos que lo necesiten hasta el cuadro de mandos. - Puertas Las puertas quedan enrasadas por ambos lados y están fabricadas con panel sandwich de 60 mm de espesor montadas en un cerco integrado en los paneles de las paredes. Sus características principales son: Bisagras de tres ejes empotradas en el espesor de la puerta. Tiradores con puño interior y exteriores. Cierre de seguridad con llave. Junta de estanqueidad en tres lados. Color azul Ral Medidas libres de paso: ancho 83 cm, alto 2 04 m. Página 3 de 10

12 - Ventanas Las ventanas son de doble cristal enrasado en el panel fabricados en un monobloque ensamblado en fábrica y a ambos lados de las ventanas existen unos orificios para pasar cables si fuese necesario. - Luminarias Las luminarias son estancas, enrasadas con el techo y diseñadas para aplicaciones de salas blancas. - Acabados Interiormente todos los ángulos que forman los paneles van con una media caña de PVC blanco unidos a un perfil unido al panel y siliconado posteriormente. Interior y exteriormente la unión entre paneles irá siliconada. Página 4 de 10

13 - Tratamiento y climatización de aire Se prevé la instalación de una unidad de tratamiento de aire, capaz de suministrar el caudal especificado en el diseño. La climatizadora se instalará en el interior, tomando el aire desde sala anexa o falso techo convenientemente ventilada y climatizada, e impulsarán el aire a cada uno de los filtros terminales instalados en el techo de las salas. Las unidades de tratamiento de aire Misterium están compuestas de: prefiltro gravimétrico de superficie quebrada tipo G4 (según clasificación EN 779) Batería de frío (agua de refrigeración o expansión directa) con separador de gotas y bandeja de recogida de condensados. Potencia frigorífica aprox. 12 kw. ventilador centrífugo de simple aspiración con motor de rotor externo protegido por termocontacto. Variador de frecuencia. Tolva de descarga 300 mm. Construidas con perfil de aluminio de doble cámara, plafones de chapa galvanizada tipo sándwich con 20 mm de aislamiento termoacústico de fibra de vidrio. Los elementos de difusión de aire son los siguientes: cajones para filtro absoluto, cambio inferior del filtro, conexión superior, construidos en chapa de acero galvanizada, pintado interior y exteriormente con pintura epoxy color blanco RAL 9002, con chapa deflectora interior. Filtros absolutos Camfil Megalam MDA H14 según norma EN1822, eficacia 99,995% MPPS. - Cuadro eléctrico Se suministrará un cuadro eléctrico con las siguientes características generales: Alimentación trifásica 380V + Neutro + Tierra. Interruptor general para seccional la alimentación. Interruptor general magnetotérmico y diferencial. Magnetotérmicos para cada derivación individual. Interruptores para la puesta en marcha de la iluminación y de los grupos de filtración de la sala. Página 5 de 10

14 Pasamateriales doble ventilado: Esclusa doble para el paso de productos entre distintas salas sin variación de presión y temperatura. Incorpora cámara intermedia aislante, canto redondeado en su interior para facilitar la limpieza, equipo con indicador luminoso con pilotos rojos y verdes para indicar la apertura o cierre de las puertas y sistema eléctrico para apertura y bloqueo de las puertas, las cuales a su vez están provistas de junta de estanqueidad. Espesor de la chapa 1,5 mm. Acabado vibrado fino. Incluye dos cámaras de 600x600x600. Incorpora dos tolvas de ventilación, 4 lámparas germicidas empotradas, filtro protección para los cristales de las puertas (lámina adhesiva), marco perimetral y ventiladores y filtros absolutos H14. - Accesorios Lavamanos en acero inoxidable mando con pedales... unidad Secamanos Saniflow E-88C... unidad Interfono de membrana... unidad Banco cubrezapatos... 2 unidades Pasamateriales doble ventilado... 2 unidades Página 6 de 10

15 2. Valoración económica Paneles, suelo, techo, ventanas, puertas y luminarias Tratamiento de aire Producción de frío... No incluido Instalación eléctrica Transporte y montaje Accesorios Performance Qualification - Validación TOTAL I.V.A. 16% incluido Validez de la Oferta: 90 días El Centro deberá disponer de corriente eléctrica trifásica 380V/50Hz para la alimentación eléctrica de Misterium. Este presupuesto incluye: a.- todo lo descrito en oferta b.- puntos de conexión en Misterium preparados para conectarlos a las líneas generales de electricidad y agua del Centro Este presupuesto no incluye: a.- Conductos de extracción hacia exterior b.- Instalación contra incendios c.- Acometida eléctrica d.- Instalación de desagües y suministro de agua sanitaria hasta puntos de uso e.- Obra civil Página 7 de 10

16 3. Referencias instalaciones Clínica La Salud (Valencia) Hospital Xeral Calde (Lugo) Hospital de Langreo (Asturias) Hospital Vila da Feira (Portugal) Laboratorios Grifols, S.A. (Barcelona) Clínica CIMA (Barcelona) Hospital de Terrassa (Barcelona) Instituto Valenciano de Oncología (Valencia) Hospital de Monterrey (Mexico) Hospital Virgen de la Macarena (Sevilla) Centro de Transfusiones y Banco de Tejidos (Barcelona) Hospital Valle de Hebron, CTBT (Barcelona) Hospital Teresa Herrera (La Coruña) Laboratorios Liconsa (Guadalajara) Hospital de Orense Hospital Sant Joan de Déu (Barcelona) Instituto Portugués de Oncologia (Oporto) Hospital Puerta del Mar (Cádiz) Hospital del Sagrado Corazón (Barcelona) Hospital de Legnago (Italia) Farmacia Gayoso (Madrid) Hospital Barlovento Algarvio (Portugal) Hospital Punta de Europa (Algeciras) Hospital Observatorio (Mexico) Hospital de Vicenza (Italia) Hospital Infanta Elena (Huelva) Página 8 de 10

17 Hospital de Llerena (Badajoz) Hospital Comarcal del Bierzo (Ponferrada) Hospital de Faro (Portugal) Hospital de Llerena (Badajoz) Hospital de Aviano (Italia) Hospital de Mollet (Barcelona) Clínica Tres Torres (Barcelona) Universidad de Siena (Italia) Hospital de Santa María (Lleida) Laboratorios León Farma (León) Hospital Gregorio Marañón (Madrid) Hospital de Treviso (Italia) Hospital Valle de Hebron, Servicio de Farmacia (Barcelona) Hospital Villa Salus (Italia) Hospital Sao Joao (Oporto, Portugal) Hospital Santa María (Lisboa, Portugal) Hospital de Jerez de la Frontera (Cádiz) Clínica Dexeus (Barcelona) Hospital de Granollers (Barcelona) Hospital de Alcoy (Alicante) Hospital Universidad de Coimbra (Portugal) Consorcio Hospitalario Parc Taulí (Sabadell) Hospital San Agustín (Linares) Hospital Arquitecto Marcide (Ferrol) Hospital Valle Camonica (Esine, Italia) Hospital San Javier (Guadalajara, Mexico) Clínica Universitaria de Navarra (Madrid) Hospital Severo Ochoa (Leganés) Página 9 de 10

18 Hospital de Tomelloso (Ciudad Real) Clínica San Camilo (Madrid) Complejo Hospitalario de Jaén Hospital Garcia da Orta (Portugal) Hospital de Viana do Castelo (Portugal) Banc de Sang i Teixits, Vall d Hebron (Barcelona) Hospital General Yagüe (Burgos) Hospital del Mar (Barcelona) Laboratorios Leti (Madrid) Hospital del Barbanza (La Coruña) Hospital de Puerto Real (Cádiz) Farmacia Vallet (Barcelona) CRTS Jerez CRTS Málaga Hospital Sant Joan (Reus) Complejo Hospitalario de Albacete Centro de cancer de mama, Vall d Hebron (Barcelona) Hospital del Sureste (Madrid) Hospital de Beja (Portugal) Hospital de Alcorcón Clínica USP Marbella Hospital del Tajo (Aranjuez) Hospital ABC (Mexico) Hospital de Guadalajara Hospital Virxen da Xunqueira (La Coruña) Institut Català d Oncologia (Barcelona) Hospital de Nadro (Mexico) Página 10 de 10

19 J Vaquero 1 Terapia celular en el tratamiento de la paraplejia traumática: Del laboratorio a la clínica J. Vaquero 1 y M. Zurita 2 1 Catedrático de Neurocirugía de la Universidad Autónoma de Madrid y Director de la Cátedra FUNDACION MAPFRE-UAM para Investigación en Daño Cerebral. 2 Investigadora Instituto de Salud Carlos III. Unidad de Investigación en Neurociencias, Hospital Universitario Puerta de Hierro, Madrid. 1. Introducción Los recientes descubrimientos acerca de las propiedades biológicas de las células madre mesenquimales adultas, obtenidas del estroma de la médula ósea, ofrecen nuevas perspectivas para el tratamiento de enfermedades neurológicas, hasta ahora consideradas incurables. Tras las primeras descripciones de que estas células pueden ser transformadas in vitro en células de aspecto neuronal, mediante la adición al medio de cultivo de agentes químicos específicos (Woodbury y col., 2000; Mezey y Chandross, 2000; Sánchez-Ramos y col., 2000; Hung y col., 2002; Dezawa y col., 2004; Hermann y col., 2004; Bossolasco y col., 2005) diversos grupos de investigación estudiaron la posibilidad de aplicar este hallazgo a la clínica, y concretamente al tratamiento de la paraplejia traumática. Como consecuencia de ello, se han publicado evidencias a favor de que el trasplante de células madre mesenquimales de médula ósea puede recuperar los déficits funcionales que tienen lugar tras una lesión traumática de la médula espinal (Chopp y col., 2000; Chopp y Li, 2002; Hofstetter y col., 2002; Lee y col., 2003; Ankeny y col., 2004) y aunque los primeros estudios fueron realizados sobre modelos experimentales de lesión medular incompleta, o realizando el trasplante celular de forma inmediata tras la lesión, en el año 2004 demostramos que esta forma de terapia celular puede ser también útil si se aplica a lesiones medulares completas y en situación de paraplejia crónicamente establecida (Zurita y Vaquero, 2004). En estas condiciones experimentales, el trasplante intralesional de células madre obtenidas del estroma de médula ósea, generalmente conocidas en la literatura anglosajona como BMSC ( Bone Marrow Stromal Cells ) va seguido de claros signos de recuperación neurológica, que son objetivables si se consigue mantener a los animales a largo plazo tras el trasplante, alcanzándose al año una recuperación motora prácticamente total en más del 60 % de los casos, lo que se asocia a una evidente regeneración de tejido nervioso a nivel de la zona previamente lesionada (Vaquero y col., 2006; Zurita y Vaquero, 2006).

20 J Vaquero 2 2. Características de las células madre del estroma de la médula ósea Las células madre son células indiferenciadas que mantienen la capacidad para dividirse durante toda la vida del individuo y dan origen a células que pueden llegar a ser muy diferenciadas y capaces de sustituir a las células que se pierden en los diferentes tejidos. En las últimas décadas, la posible utilidad de las células madre embrionarias para el tratamiento de diversas enfermedades ha despertado un gran optimismo, pero su empleo en clínica humana se ha visto dificultado por numerosos problemas éticos y de tipo técnico. Sin embargo, las células madre adultas han ganado un gran protagonismo según se han ido conociendo detalles acerca de su comportamiento biológico y entre ellas, las células madre mesenquimales presentes en el estroma de la médula ósea (BMSC) son las que parecen ofrecer mayor número de ventajas a la hora de ser utilizadas en protocolos de terapia celular. Se conoce hoy día que estas células pueden diferenciarse no solo hacia células de su misma línea germinal, como pueden ser condrocitos, osteoblastos o miocitos, sino también, en determinadas circunstancias, hacia células endoteliales y neuroectodérmicas (Dezawa y col., 2004; Kotobuki y col., 2004; Benayahu y col., 2007; Parr y col., 2007). Las BMSC expresan marcadores como el CD73 y el CD105, así como otros marcadores que realmente son moléculas de adhesión, como CD54, CD56, CD90 y CD106, se caracterizan por su adherencia al frasco de cultivo y se expanden fácilmente, hasta el punto de que en el curso de 3-4 semanas se pueden obtener en el laboratorio unos millones de BMSC partiendo de unos 50 millones de células mononucleadas extraidas por punción de la médula ósea. 3. Transdiferenciación neural de las células madre estromales Diversos investigadores han descrito que las BMSC pueden diferenciarse en cultivo hacia células nerviosas (neuronas y glía) y también in vivo, cuando se implantan en el cerebro o en la médula espinal de animales adultos (Chopp y col., 2000; Mezey y Chandross, 2000; Sánchez-Ramos y col., 2000; Woodbury y col., 2000; Hofstetter y col., 2002; Hung y col., 2002; Lee y col., 2003; Ankeny y col., 2004; Dezawa y col., 2004; Hermann y col., 2004; Bossolasco y col., 2005; Zurita y col., 2005 y 2007; Zurita y Vaquero, 2004 y 2006; Vaquero y col., 2006). Este hecho se conoce como "transdiferenciación" puesto que implica que una célula mesenquimal se transforma en una células de diferente origen germinal. En el año 2000, Woodbury y col. describieron que las BMSC pueden sufrir una rápida transdiferenciación a neuronas si se añaden, al medio de cultivo, determinadas sustancias químicas, conocidas como "inductores" de diferenciación neuronal (Figura 1). Sin embargo, este hallazgo levantó enorme controversia, ya que supone romper dogmas que creíamos establecidos, y se consideró por muchos autores que el cambio morfológico hacia neuronas que experimentan las BMSC tratadas por agentes químicos, no es más que el resultado de alteraciones inespecíficas del citoesqueleto (Liu y Rao, 2003; Lu y col., 2004) y que las

21 J Vaquero 3 células así generadas no son realmente neuronas, sino células mesenquimales que pierden su típica morfología y adquieren una morfología similar a la de las neuronas. Han sido muchos y contradictorios los estudios neurofisiológicos realizados en los últimos años y que han llevado a la conclusión de que con estas técnicas se obtienen células que, al menos parcialmente, muestran propiedades fisiológicas de células nerviosas, pero la posibilidad de que la inducción química de lugar a alteraciones celulares con consecuencias no bien conocidas, hizo cuestionar la posible utilidad en clínica de este tipo de transdiferenciación celular. Otra de las críticas al fenómeno de transdiferenciación de las BMSC viene dada por la posibilidad de que, cuando se trasplantan al cerebro, estas células se pueden fusionar con las neuronas propias del tejido nervioso, originando así una célula híbrida que parece una neurona, pero que realmente no lo es (Wang y col., 2002; Ying y col., 2002; Alvarez-Dolado y col., 2003; Chen y col., 2006) y cuando hace unos años nos planteamos estudiar la posible utilidad de las BMSC para regenerar la médula espinal tras una lesión traumática, creímos que debíamos resolver estas cuestiones antes de iniciar estudios experimentales sobre modelos animales de paraplejia. Para ello, en primer lugar, estudiamos los fenómenos de transdiferenciación neuronal de las BMSC utilizando agentes químicos exógenos, según el protocolo descrito previamente por Woodbury y col. (2000) y una vez que habíamos obtenido células con aspecto neuronal, procedimos a eliminar los factores químicos exógenos del medio de cultivo, manteniendo las células, aparentemente transdiferenciadas, en un medio de cultivo habitual. Nuestros hallazgos fueron que las células de aspecto neuronal, cuando dejaban de estar expuestas a los factores químicos inductores de su diferenciación neuronal, revertían, en el curso de una semana, a su aspecto mesenquimal previo, dejando de expresar los antígenos de diferenciación neuronal que habían llegado a expresar y volviendo a expresar los marcadores típicos de un fenotipo mesenquimal. Como consecuencia de ello, llegamos a la conclusión de que la obtención de neuronas a partir de BMSC utilizando sustancias químicas no podría ser útil para una aplicación clínica, no solo por la incertidumbre de posibles alteraciones constitutivas de las células nerviosas así generadas, sino porque el mantenimiento del fenotipo neuronal requiere una exposición mantenida a factores químicos exógenos (Zurita y col., en prensa). Nos planteamos entonces buscar un método de transdiferenciación biológica aprovechando la posible influencia de factores solubles elaborados por células gliales, presentes en el seno del tejido nervioso, donde las BMSC podrían ser trasplantadas. Iniciamos así un protocolo de co-cultivos, cultivando por una parte BMSC y por otra parte células de Schwann, ya que estas últimas células elaboran múltiples factores neurotróficos a los que se les atribuye las conocidas posibilidades de regeneración del Sistema Nervioso Periférico. Cuando los cultivos puros de BMSC y de células de Schwann se unían, obtuvimos una evidente transformación de las BMSC a neuronas, aunque de una forma mucho más lenta de lo que ocurría cuando la transdiferenciación se hacía por medio de agentes químicos exógenos, y además, las células de apariencia neuronal así obtenidas, mantenían su fenotipo

22 J Vaquero 4 cuando se cultivaban en los medios de cultivo habituales (Zurita y col., 2007). Los estudios que realizamos por medio del microscopio confocal demostraron, además, que estas aparentes neuronas tenían canales iónicos de calcio regulados por voltaje, de forma mucho más concluyente que las células de apariencia neuronal obtenidas por medio de inductores químicos. Sin embargo, en nuestros co-cultivos se podían ver estrechos contactos entre BMSC y células de Schwann, por lo que no podíamos descartar que, al menos en parte, se estuvieran produciendo fenómenos de fusión celular. Para resolver esta cuestión realizamos co-cultivos con sistemas de doble cámara, cultivando por una parte células de Schwann, o bien astrocitos adultos, y por otra parte BMSC. Ambos tipos celulares estaban separados por membranas de policarbonato, con poros de un diámetro determinado. Con estos sistemas, usando poros de un tamaño de 0.4 micras, que impedían el contacto entre las células que estaban siendo cultivadas a uno y otro lado de la membrana, pudimos demostrar que se producía una evidente transdiferenciación neuronal de las BMSC, como consecuencia de los factores solubles que les aportaban las células gliales y que podían difundir a través de los poros de las membranas de policarbonato (Figura 2). La lógica conclusión de estos estudios fue que las BMSC podrían ser transplantadas en el Sistema Nervioso sin necesidad de una manipulación previa, in vitro, para lograr su transformación hacia células nerviosas, puesto que, teóricamente, los factores neurotróficos propios del microambiente donde iban a ser trasplantadas, podrían inducir in situ su transdiferenciación neural. 4. Trasplante celular para el tratamiento de la paraplejia traumática En los últimos años, diversos estudios experimentales han señalado la eficacia del trasplante de BMSC para reducir los déficits motores que se producen tras una lesión traumática de la médula espinal, y también se han publicado observaciones a favor de que el trasplante de estas células puede reducir las secuelas de lesiones cerebrales isquémicas o traumáticas (Chen y col., 2001; Chopp y Li, 2002; Mahmood y col., 2002 y 2004). Sin embargo, los estudios iniciales en la paraplejia traumática se habían hecho sobre modelos de lesión medular incompleta, o bien realizando el trasplante de BMSC en una fase muy precoz tras la lesión medular (Chopp y col., 2000, Hofstetter y col., 2002), circunstancias ambas que distaban mucho de las condiciones en que estas nuevas estrategias podrían ser aplicadas en clínica humana. Consecuentemente, procedimos a estudiar la eficacia de estas técnicas en lesiones medulares completas y crónicamente establecidas (Zurita y Vaquero, 2004 y 2006). Tras provocar una paraplejia completa a ratas Wistar adultas, por medio de un traumatismo directo sobre la médula espinal, se inició un tratamiento rehabilitador intensivo de los animales, al objeto de evitar las complicaciones derivadas de la paraplejia, y tras 3 meses de evolución., se procedió a la administración de 5 x 10 6 de BMSC en un volumen de 50 l, mediante técnica microquirúrgica, en la cavidad centromedular traumática. En una serie de

23 J Vaquero 5 animales control, se administró el mismo volumen de suero fisiológico, sin BMSC. Todos los animales recibieron tratamiento rehabilitador diario hasta el momento del sacrificio y fueron evaluados semanalmente mediante la escala BBB de función motora (Basso y col., 1995). Mientras que los animales con administración intramedular de suero fisiológico permanecieron totalmente parapléjicos hasta la finalización del estudio, los animales que recibieron el trasplante de BMSC iniciaron una clara recuperación funcional a partir del primer mes tras el trasplante, alcanzando, al año de seguimiento, una recuperación que parecía quedar estabilizada y que representaba aproximadamente el 70-80% de la función motora correspondiente a un animal sin lesión medular (Figura 3) Pueden verse videos acerca de la recuperación motora de estos animales en doi /j.neulet En estos estudios, y con el propósito de poder reconocer las BMSC tras su trasplante, éstas células fueron sometidas a una transfección génica, introduciéndoles en ellas el gen LacZ de E. Coli, con lo cual, la identificación inmunohistoquímica de beta-galactosidasa en el tejido receptor del trasplante, permitía asegurar que las células marcadas procedían de las BMSC trasplantadas. Con esta técnica pudimos observar que a partir de los 2 meses tras el trasplante, la cavidad centromedular comienza a rellenarse de un tejido formado por coalescencia de grupos de BMSC (Figura 4). A los 6 meses se establecen puentes tisulares que unen los bordes de la cavidad centromedular traumática y al año del trasplante, la cavidad centromedular se encuentra rellena por un tejido nervioso nuevo, formado a expensas de las BMSC, en el que se identifican neuronas adultas, astrocitos y vasos sanguíneos marcados con beta-galactosidasa y que permite el paso de axones ascendentes y descendentes (Figura 5). 5. Vías de administración de células madre para el tratamiento de lesiones medulares Una vez que pudimos confirmar la eficacia del trasplante de BMSC para regenerar el tejido medular dañado y para lograr recuperación motora de los animales parapléjicos, nos planteamos si también podría ser eficaz una administración de BMSC por vía sistémica, sobre todo teniendo en cuenta algunas publicaciones que señalaban cómo la administración intravenosa de BMSC puede revertir déficits funcionales en ratas sometidas a un traumatismo craneoencefálico (Mahmood y col., 2001). Como un primer paso, marcamos las BMSC con bisbenzimida, o bien con Indio-111, y realizamos estudios para comprobar la distribución de las células marcadas tras su administración sistémica por vía intravenosa. Los resultados que obtuvimos mostraron que tras su administración intravenosa, las BMSC marcadas colonizaban órganos de perfusión, como el bazo, hígado o riñones, pero no alcanzaban de forma significativa la zona de lesión medular (De Haro y col., 2005). Estos estudios permitieron aportar por vez primera a la literatura la utilidad del marcaje isotópico con Indio- 111 para estudiar la distribución de las BMSC tras su administración en procedimientos de

24 J Vaquero 6 terapia celular, pero nos llevaron a la conclusión de que la administración sistémica de BMSC no permite que estas células lleguen en un número significativo a las zonas de lesión traumática medular. En un estudio posterior valoramos la recuperación motora de animales parapléjicos tras la administración sistémica o intralesional de BMSC, lo que nos permitió confirmar la evidente superioridad de la administración local frente a la administración sistémica (Vaquero y col., 2006). 6. Estudios experimentales en mamíferos superiores En los últimos dos años, los buenos resultados obtenidos tras más de 150 trasplantes en roedores, han sido reproducidos en una serie de 10 cerdos adultos sometidos a lesión medular por compresión aguda (Figura 6). La paraplejia obtenida con este modelo es idéntica a la que se produce por contusión medular en roedores y se mantiene a lo largo del tiempo. A los 3 meses de la lesión, se procedió al trasplante intralesional de 50 x 10 6 de BMSC autólogas, previamente marcadas con bromouridina, obteniéndose, 3 meses después, claros signos de recuperación motora y sensitiva (Figura 7), lo que coincidía con la reaparición de los potenciales evocados somatosensoriales que habían desaparecido tras la lesión (Figura 8). En estos animales se realizaron estudios histológicos a los 3 meses del trasplante, apreciándose que la cavidad centromedular estaba ocupada por gran número de células marcadas, que coexpresaban marcadores de diferenciación neuronal y astroglial, y dispuestas entre una gran cantidad de fascículos de fibras nerviosas (Figura 9). Estudios similares, que muestran la eficacia de estas técnicas en primates, han sido publicados por otros autores, aunque en este último caso, los estudios realizados se han hecho con células derivadas de médula ósea que incluían progenitores hematopoyéticos (Deng y col., 2005 y 2006). 7. Perspectivas de aplicación clínica en pacientes Teniendo en cuenta los datos que hemos descrito, podemos señalar que, en el momento actual los resultados beneficiosos obtenidos, tras el trasplante de BMSC, en roedores con paraplejia crónica de origen traumático, han sido confirmados en cerdos adultos tipo "minipig" y también en primates. De forma paralela y como consecuencia de todos estos estudios experimentales, se está iniciando la aplicación clínica de estas nuevas formas de terapia celular en pacientes. Los primeros ensayos clínicos se han hecho utilizado células madre que incluyen BMSC y células madre hematopoyéticas y han confirmado la ausencia de efectos secundarios (Park y col., 2005; Sykova y col., 2006; Yoon y col., 2007). Recientemente, se ha presentado un estudio preliminar en una serie de pacientes parapléjicos tratados con trasplante intramedular de células madre derivadas de médula ósea, y que han sido evaluados durante un año tras el trasplante, apreciándose evidente recuperación en

25 J Vaquero 7 sensibilidad, motilidad y control de esfínteres (Geffner y col., 2007). Estos resultados preliminares parecen justificar el inicio de ensayos clínicos controlados en pacientes, al objeto de poder evaluar un número de casos que permita obtener conclusiones definitivas. En el estado actual de nuestros conocimientos sobre esta línea de investigación, es difícil encontrar argumentos acerca de las ventajas de utilizar exclusivamente BMSC para estos trasplantes, tal como ha realizado nuestro grupo y otros autores en los estudios experimentales preclínicos (Chopp y col., 2000; Hofstetter y col., 2002; Ohta y col., 2004; Zurita y Vaquero, 2004 y 2006; Bakshi y col., 2006; Vaquero y col., 2006; Himes y col., 2006; Parr y col., 2007) o bien las ventajas de utilizar, como se ha hecho en las primeras experiencias clínicas en humanos, una mezcla de BMSC y otras células mononucleares de médula ósea (Park y col., 2005; Sykova y col., 2006; Yoon y col., 2007). Teniendo en cuenta que las BMSC representan menos del 1 % de las células de la médula ósea, su empleo en protocolos de terapia celular requiere manipular estas células en instalaciones de alta seguridad biológica (cabinas GMP) para expander las células y obtener suficiente número de ellas antes de realizar el trasplante, lo que conlleva una cierta complejidad técnica. Sin embargo las BMSC tienen la ventaja de su gran especificidad para lograr una transdiferenciación en el seno del tejido huésped, su gran facilidad de expansión, teniendo en cuenta que la eficacia del trasplante parece ser dosis-dependiente, y además, su baja antigenicidad, lo que podría llevar a que en un futuro se planteara su trasplante alogénico en clínica humana. Por otra parte, es obvio que aún tenemos que adquirir un mejor conocimiento de los mecanismos por los cuales este tipo de terapia celular consigue la recuperación neurológica, tanto de animales experimentales como de los pocos pacientes en los que se ha ensayado hasta ahora. En los estudios experimentales realizados, llama la atención que la recuperación funcional de los animales se inicia antes de que se produzca una regeneración tisular capaz de rellenar completamente la cavidad centromedular traumática y exista un puente capaz de permitir el paso de axones ascendentes y descendentes (Zurita y Vaquero, 2004 y 2006; Vaquero y col., 2006). Por lo tanto, es obvio que tras el trasplante, al menos en una fase precoz, deben existir diversos procesos regenerativos, incluyendo la liberación de factores neurotróficos por las células madre trasplantadas, o la activación de mecanismos endógenos de la médula espinal, capaces de restaurar parcialmente funciones neurológicas previamente abolidas. Por último, teniendo en cuenta los resultados experimentales que sugieren la conveniencia de llevar al sitio de lesión una gran cantidad de células madre, nuestros esfuerzos deben ir encaminados a lograr la mayor supervivencia posible de las células madre, una vez trasplantadas. Recientes hallazgos experimentales muestran que las células madre derivadas de la médula ósea pueden alcanzar las zonas de lesión centromedular traumática tras ser depositadas en el espacio subaracnoideo (Ohta y col., 2004; Sateke y col., 2004; Bakshi y col., 2004 y 2006; Himes y col., 2006) (Figura 10) lo que deberá ser tenido en cuenta a la

26 J Vaquero 8 hora de aplicar estas técnicas en pacientes, por cuanto que puede ser una estrategia complementaria a la administración intralesional, aumentando su eficacia. 8. Conclusiones En los últimos años, las posibilidades de aplicar nuevas técnicas de terapia celular en el tratamiento de enfermedades neurológicas, ha abierto una nueva vía de investigación en el tratamiento de la paraplejia de origen traumático. Tras varios años de estudios experimentales, estas nuevas técnicas comienzan a aplicarse en pacientes, bajo estrictos controles éticos y metodológicos. Sin embargo, los avances en este campo, al igual que en otros nuevos, que marcan una nueva frontera en la investigación quirúrgica, requieren más que nunca la incorporación a nuestros hospitales de investigadores básicos y un decidido apoyo institucional al objeto de crear o mantener Unidades de Cirugía Experimental, que nos permitan llevar a la clínica respuestas a los múltiples retos que nos plantea la Cirugía del siglo XXI. 9. Bibliografía Alvarez-Dolado M, Pardal R, García Verdugo JM, Fike JR, Lee H, Pfeffer K, Lois C, Morrison SJ, Alvarez Buylla A: Fusion of bone-marrow derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature 425: , 2003 Ankeny DP, Mc Tigue DM, Jakeman LB: Bone marrow transplants provide tissue protection and directional guidance for axons after contusive spinal cord injury in rats. Exp Neurol 190: 17-31, 2004 Bakshi A, Barshinger AL, Swanger SA, Madhavani V, Shumsky JS, Neuhuber B, Fischer I: Lumbar puncture delivery of bone marrow stromal cells in spinal cord contusion: a novel method for minimally invasive cell transplantation. J Neurotrauma 23: 55-65, 2006 Bakshi A, Hunter C, Swanger S, Lepore A, Fischer I: Minimally invasive delivery of stem cells for spinal cord injury: advantages of the lumbar puncture techbique. J Neurosurg Spine 1: , 2004 Basso DM, Beattie MS, Brennahan JC: A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12: 1-21, 1995 Benayahu D, Akavia UD, Shur I: Differentiation of bone marrow stroma-derived mesenchymal cells. Curr Med Chem 14: , 2007 Bossolasco P, Cova L, Calzarossa C, Rimoldi SG, Borsotti C, Deliliers GL, Silani V, Soligo D, Polli E: Neuro-glial differentiation of human bone marrow stem cells in vitro. Exp Neurol 193: , 2005 Chen J, Li Y, Wang L., Lu M, Zhang X, Chopp M: Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. J Neurol Sci 189: 49-57, 2001 Chen KA, Laywell ED, Marshall G, Walton N, Zheng T, Steindler DA: Fusion of neural stem cells in culture. Exp Neurol 198: , 2006 Chopp M, Li Y: Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet Neurol 1: , 2002 Chopp M, Zhang X H, Li Y, Wang L, Chen J, Lu D, Lu M, Rosemblum M: Spinal cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cell transplantation. Neuroreport 11: , 2000

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