Extracción de DNA por el Método Adaptado de Drábek.

Transcripción

1 Extracción de DNA por el Método Adaptado de Drábek. El aislamiento de DNA constituye un paso esencial para la realización de estudios de tamizaje genético, análisis de polimorfismos genéticos, estudios de caracterización genómica al igual que para estudios de epidemiología molecular. Los métodos de extracción de DNA actualmente disponibles poseen dos características que dificultan su incorporación a estudios de epidemiología molecular y al procesamiento de cientos o miles de muestras: su alto costo y la toxicidad de sus reactivos. El estandard de oro de los métodos de extracción de DNA es el de Fenol-Cloroformo-Alcohol Isoamilico (PCI). Este método emplea una enzima proteolítica para digerir el lisado celular seguido de la extracción de DNA por medio de un solvente orgánico carcinógeno (fenol). En los últimos 20 años el empleo de kits de extracción de DNA basados en columnas ha facilitado el procesamiento de muestras. No obstante, el costo de estos kits se vuelve prohibitivo conforme se incrementa el número de muestras por procesar o su volumen individual. Recientemente se ha descrito un método para la extracción de DNA genómica a partir de diversos tejidos que emplea detergentes domésticos. Dicho método constituye una alternativa práctica tanto por su bajo costo como por obviar la necesidad de enzimas proteolíticas y sustancias toxicas. Este protocolo se basa en el método desarrollado por Drábek J (Departamento de Inmunologia de la Universidad Palacky de la República Checa 1 ) y optimizado por Nasiri H (Departamento de Biotecnología Médica de la Universidad Tarbiat Modarres de Irán 2 ) y otros 3. El método ha sido adaptado y optimizado por el Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Medicina de la UASLP para la extracción de DNA a partir de diferentes fuentes de leucocitos (sangre periferica entera, concentrados leucocitarios de banco de sangre, sangre de cordón umbilical y células mononucleares aisladas por ficoll o procedentes de medios de cultivo). Notas: 1. Los reactivos empelados para la preparación de buffers de lisis y precipitación son genéricos y de grado ACS, obviando el empleo de reactivos costosos y de grado molecular. El etanol empleado puede ser también grado ACS pero no desnaturalizado. 2. Para preparar 1 litro de buffer de lisis celular agregue 10 grs de Tritón X-100 a un vaso de precipitados de 500 ml y afore a 350 ml con dh20 grado III y mezcle con el agitador magnético. Agregue grs de Sucrosa (sacarosa) grs de Cloruro de Magnesio Hexahidratado y 10 ml de Tris HCl 1M ph 7.6. Permita que se disuelvan todos los reactivos completamente. Transfiera la mezcla a un cilindro graduado y afore a 1 litro con dh20 grado III. Dispense alícuotas de 50 ml y mantengalas refrigeradas. 3. Prepare 2 litros de solución de detergente diluyendo 80 grs de detergente Foca comercial de uso doméstico. Mantenga esta preparación en agitación durante 12 horas. Permita que la solución sedimente durante 12 horas. Tome cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento y filtrelo a través de filtros de jering Luer-Lock empleando discos de 2.5 cm y poros de 5 micrones, posteriormente filtre en uidades Nalgene de 500 ml color amarillo (0.22 µm). Prepare la solución de trabajo realizando las diluciones correspondientes. La concentración de detergente empleada por los diferentes protocolos difiere siendo de 10 mg/ml para el protocolo Maxiprep y de 20 mg/ml para los protocolos Midi, Mini y Microprep. Esta diferencia obedece a que los concentrados leucocitarios poseen una menor proporción de eritrocitos en relación a las muestras de sangre entera. 4. Una vez que se ha precipitado el DNA en Etanol al 96ºGL a -20 C durante 20 minutos no se debe perturbar el sedimento ni centrifugar la muestra. La experiencia reunida durante la optimización del método ha demostrado que estos procedimientos (comunemente empleados en las modalidades publicadas del protocolo) acarrean contaminantes que afectan la calidad espectrofotométrica del DNA y su uso en PCR. 5. Las diluciones de trabajo deben prepararse en tiras microtubos de PCR de 0.2 ml. 6. Evalúe espectrofotométricamente la cantidad y calidad del DNA extraído en el Nanodrop ND-1000.

2 7. Para evaluar la integridad del DNA genómico por electroforesis se cargan 5 µl de una mezcla de 1 µl de solución nativa de DNA + 4 µl de dh 2 O grado I + 3 µl de buffer de carga (naranja O) en un gel de agarosa al 1% y se corre durante 45 minutos a 150 VDC en el sistema Gator A2 o (6 V/cm). El DNA de buena calidad deberá permanecer por encima del marcador de 4 Kb, el DNA fragmentado aparecerá como una mancha que se extiende desde el pozo hasta el frente de migración. El DNA extraido de células apoptóticas generará una escalera de 200 bp. 8. La evaluación funcional de la utilidad del DNA extraído se basa en el protocolo de amplificación de KIR2DL4 o KIR2DL1 para generar fragmentos de 1.8 o 3.6 kbp, respectivamente. Refiérase al protocolo PCR KIR correspondiente. 9. Almacene las soluciones nativas de DNA a -80 C y las alícuotas de trabajo de DNA a -20 C. Referencias: Drabek, J. and Petrek, M., A sugar, laundry detergent, and salt method for extraction of deoxyribonucleic acid from blood. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 146 (2), 37 (2002). Nasiri, H., Forouzandeh, M., Rasaee, M. J., and Rahbarizadeh, F., Modified salting-out method: high-yield, high-quality genomic DNA extraction from whole blood using laundry detergent. J Clin Lab Anal 19 (6), 229 (2005). Bahl, A. and Pfenninger, M., A rapid method of DNA isolation using laundry detergent. Nucleic Acids Res 24 (8), 1587 (1996); Kotchoni, S. O. and Gachomo, E. W., A rapid and hazardous reagent free protocol for genomic DNA extraction suitable for genetic studies in plants. Mol Biol Rep (2008).

3 Procedimiento Maxiprep (15 ml de concentrado leucocitario anticoagulado con CPDA-1): 1. Agregue 15 ml del concentrado leucocitario a un tubo cónico de 50 ml y adicione 25 ml de buffer de lisis celular, agite vigorosamente por inversión, NO UTILICE EL VORTEX! este paso rompe las células pero deja los núcleos intactos con DNA dentro. 2. Centrifugue a 3,000 G por 5 minutos y deseche el sobrenadante por decantación hacia NaOCl 0.1%. 3. Agregue buffer de lisis celular al pellet nuclear y afore a 30 ml. Mezcle vigorosamente por inversión hasta resuspender el pellet. Este paso busca eliminar los eritrocitos que quedan unidos a los nucleos que forman al pellet. 4. Centrifugue a 3,000 G por 5 minutos y descarte (deseche) nuevamente el sobrenadante por decantación. 5. Repita los pasos #3 y 4 dos veces mas hasta eliminar completamente la coloración roja del pellet nuclear. 6. Agregue 3 ml de Tris-HCl 10 mm ph 8.0 al pellet nuclear, mezcle vigorosamente hasta resuspender completamente al pellet. Este paso solo busca solubilizar el pellet nuclear. 7. Agregue 3 ml de la solución de detergente a 10 mg/ml, mezcle vigorosamente hasta resuspender completamente al pellet. En este paso se rompe la membrana nuclear para liberar al DNA de su interior. 8. Agregue 2 ml de 5M NaCl y mezcle vigorosamente hasta lograr una solución turbia. Este paso precipita las proteinas nucleares y las de membrana nuclear (histonas, factores de transcripción, polimerasas, etc.). 9. Centrifugue a 12,000 G durante 15 minutos empleando el rotor de ángulo fijo AC Este paso compacta las proteinas previamente precipitadas dejando a los ácidos nucleicos (DNA genómico, RNA y DNA mitocondrial en el sobrenadante). 10. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 ml evitando perturbar el sedimento. Descarte el primer tubo cónico con el sedimento. Esta es la solución de ácidos nucleicos extraídos que ahora serán purificados para enriquecerla de DNA y eliminar otras proteinas. 11. Agregue 35 ml de etanol al 96% a -20 C, mezcle gentilmente. Este paso precipita el DNA y RNA. 12. Retire el DNA precipitado con un microcapilar o pipeta Pasteur doblada en forma de gancho y descarte por decantación el etanol contenido en el tubo. 13. Regrese el microcapilar o pipeta Pasteur con el DNA de nuevo al tubo y agregue 10 ml de etanol al 70%, lave durante 20 segundos. Este paso busca disminuir la concentración de sales (principalmente NaCl) presentes en el DNA enriquecido. 14. Vuelva a retirar el microcapilar o pipeta Pasteur con el DNA y descarte el etanol de lavado por decantación. 15. Repita los pasos #13 y 14 dos veces mas. 16. Seque el DNA colgado de el microcapilar o pipeta Pasteur durante 15 minutos a temperatura ambiente pero dentro del Gabinete de Seguridad Biológica del laboratorio de procesamiento de muestras. 17. Resuspenda el DNA en 7 ml de Tris-HCl ph 8.0 para preparar la solución nativa de DNA genómico.

4 18. Incube la solución nativa de DNA genómico en baño de agua durante 30 minutos a 70 C. 19. Prepare una alícuota de trabajo en tubos de PCR a 100 ng/µl y cinco alicuotas de 1.5 ml en Eppendorfs de 1.8 ml. Procedimiento Midiprep (7.5 ml de sangre entera anticoagulada con EDTA o ACD): 1. Agregue 7.5 ml de sangre entera anticoagulada a un tubo cónico de 15 ml y adicione 7.5 ml de buffer de lisis celular, agite vigorosamente primero por inversión luego por vortex. 2. Centrifugue a 3,000 G por 5 minutos y descarte cuidadosamente el sobrenadante por decantación hacia NaOCl 0.1%. 3. Agregue 5 ml de buffer de lisis celular y mezcle vigorosamente primero por inversión luego por vortex hasta resuspender por completo el pellet nuclear. 4. Centrifugue a 3,000 G por 5 minutos y descarte cuidadosamente el sobrenadante por decantación. 5. Repita los pasos #3 y 4 dos veces mas hasta eliminar completamente la coloración roja del pellet. 6. Agregue 375 µl Tris-HCl 10 mm ph 8.0, mezcle vigorosamente en vortex hasta resuspender completamente al pellet nuclear. 7. Agregue 375 µl de la solución de detergente a 20 mg/ml, mezcle vigorosamente en vortex hasta resuspender completamente al pellet. 8. Agregue 250 µl de 5M NaCl y mezcle vigorosamente en vortex hasta lograr una solución turbia. Transfiera la suspensión de nucleos lisados a un microtubo de 1.5 ml. 9. Centrifugue a 16,000 G durante 10 minutos. 10. Transfiera el sobrenadante a un nuevo microtubo de 2 ml evitando perturbar el sedimento. Descarte el microtubo con el sedimento. 11. Agregue 1,000 µl de etanol al 96% a -20 C, mezcle gentilmente. 12. Retire el DNA precipitado con un microcapilar o pipeta Pasteur doblados en forma de gancho y descarte el etanol contenido en el tubo por decantación. 13. Regrese el microcapilar con el DNA de nuevo al tubo y agregue 700 µl de etanol al 70%, lave durante 20 segundos. 14. Vuelva a retirar el microcapilar con el DNA y descarte el etanol de lavado por decantación. 15. Repita los pasos #13 y 14 dos veces mas. 16. Regrese el microcapilar con el DNA al microtubo correspondiente y seque el microtubo en el thermomixer

5 a 70 ºC. Revise el microtubo cada 5 minutos hasta evidenciar la eliminación del etanol restante. 17. Resuspenda el DNA en 500 µl de Tris-HCl ph 8.0 para preparar la solución nativa de DNA genómico. 18. Incube la solución nativa de DNA genómico en el thermomixer durante 30 minutos a 70 C y 350 RPM. Procedimiento Miniprep (3 ml de sangre entera anticoagulada con EDTA o ACD): 1. Agregue 3.0 ml de sangre entera anticoagulada a un tubo cónico de 15 ml y adicione 5 ml de buffer de lisis celular, agite vigorosamente primero por inversión luego por vortex. 2. Centrifugue a 3,000 G por 5 minutos y descarte cuidadosamente el sobrenadante por decantación hacia NaOCl 0.1%. 3. Agregue 2 ml de buffer de lisis celular y mezcle vigorosamente primero por inversión luego por vortex hasta resuspender por completo el pellet nuclear. 4. Centrifugue a 3,000 G por 5 minutos y descarte cuidadosamente el sobrenadante por decantación. 5. Repita los pasos #3 y 4 dos veces mas hasta eliminar completamente la coloración roja del pellet. 6. Agregue 150 µl Tris-HCl 10 mm ph 8.0, mezcle vigorosamente en vortex hasta resuspender completamente al pellet nuclear. 7. Agregue 150 µl de la solución de detergente a 20 mg/ml, mezcle vigorosamente en vortex hasta resuspender completamente al pellet. 8. Agregue 100 µl de 5M NaCl y mezcle vigorosamente en vortex hasta lograr una solución turbia. Transfiera la suspensión de nucleos lisados a un microtubo de 1.5 ml. 9. Centrifugue a 16,000 G durante 10 minutos. 10. Transfiera el sobrenadante a un nuevo microtubo de 1.5 ml evitando perturbar el sedimento. Descarte el microtubo con el sedimento. 11. Agregue 1,000 µl de etanol al 96% a -20 C, mezcle gentilmente. 12. Retire el DNA precipitado con un microcapilar doblado en forma de gancho y descarte el etanol contenido en el tubo por decantación. 13. Regrese el microcapilar con el DNA de nuevo al tubo y agregue 0.5 ml de etanol al 70%, lave durante 20 segundos. 14. Vuelva a retirar el microcapilar con el DNA y descarte el etanol de lavado por decantación. 15. Repita los pasos #13 y 14 dos veces mas. 16. Regrese el microcapilar con el DNA al microtubo correspondiente y seque el microtubo en el thermomixer

6 a 70 ºC. Revise el microtubo cada 5 minutos hasta evidenciar la eliminación del etanol restante. 17. Resuspenda el DNA en 1,500 µl de Tris-HCl ph 8.0 para preparar la solución nativa de DNA genómico. 18. Incube la solución nativa de DNA genómico en el thermomixer durante 30 minutos a 70 C y 350 RPM. Procedimiento Microprep (750 µl de SANGRE ENTERA anticoagulada con EDTA o ACD): 1. Agregue 750 µl de sangre entera anticoagulada a un microtubo de 1.5 ml y adicione 750 µl de buffer de lisis celular, agite vigorosamente primero por inversión luego por vortex. 2. Centrifugue a 3,000 G por 5 minutos y descarte el sobrenadante por decantación hacia NaOCl 0.1%. 3. Agregue 500 µl de buffer de lisis celular y mezcle vigorosamente primero por inversión luego por vortex hasta resuspender por completo el pellet nuclear. 4. Centrifugue a 3,000 G por 5 minutos y descarte el sobrenadante por decantación. 5. Repita los pasos #3 y 4 dos veces mas hasta eliminar completamente la coloración roja del pellet. 6. Agregue 37.5 µl Tris-HCl 10 mm ph 8.0 y mezcle vigorosamente en vortex hasta resuspender completamente al pellet nuclear. 7. Adicione 37.5 µl de la solución de detergente a 20 mg/ml y mezcle vigorosamente en vortex hasta homogeneizar por completo el pellet nuclear. 8. Agregue 32.5 µl de 5M NaCl y mezcle vigorosamente en vortex hasta lograr una solución turbia. 9. Centrifugue a 16,000 G durante 10 minutos. 10. Transfiera el sobrenadante a un nuevo microtubo de 1.5 ml evitando perturbar el sedimento. Descarte el microtubo con el sedimento proteico. 11. Agregue 500 µl de etanol al 96% a -20 C, mezcle gentilmente. 12. Retire el DNA precipitado con un microcapilar doblado en forma de gancho y descarte el etanol residual. 13. Enjuague el microcapilar con el DNA en 300 µl de etanol al 70% durante 20 segundos y descarte el etanol residual. 14. Enjuague nuevamente el microcapilar con el DNA en 300 µl de etanol al 70% durante 20 segundos y descarte el etanol residual. 15. Regrese el microcapilar con el DNA al microtubo del último lavado y sequelo en el thermomixer a 70 ºC durante 10 minutos. 16. Resuspenda el DNA en 100 µl de Tris-HCl ph 8.0 para preparar la solución nativa de DNA genómico.

7 17. Incube la solución nativa de DNA genómico en el thermomixer durante 30 minutos a 70 C y 350 RPM. Procedimiento Microprep CL (750 µl de CONCENTRADO LEUCOCITARIO): 1. Agregue 750 µl de concentrado leucocitario a un microtubo de 2 ml y adicione 1.25 ml de buffer de lisis celular, agite vigorosamente primero por inversión luego por vortex. 2. Centrifugue a 3,000 G por 5 minutos y descarte el sobrenadante por decantación hacia NaOCl 0.1%. 3. Agregue 1000 µl de buffer de lisis celular y mezcle vigorosamente primero por inversión luego por vortex hasta resuspender por completo el pellet nuclear. 4. Centrifugue a 3,000 G por 5 minutos y descarte el sobrenadante por decantación. 5. Repita los pasos #3 y 4 dos veces mas hasta eliminar completamente la coloración roja del pellet. 6. Agregue 150 µl Tris-HCl 10 mm ph 8.0 y mezcle vigorosamente en vortex hasta resuspender completamente al pellet nuclear. 7. Adicione 150 µl de la solución de detergente a 10 mg/ml y mezcle vigorosamente en vortex hasta homogeneizar por completo el pellet nuclear. 8. Agregue 100 µl de 5M NaCl y mezcle vigorosamente en vortex hasta lograr una solución turbia. 9. Centrifugue a 16,000 G durante 10 minutos. 10. Transfiera el sobrenadante a un nuevo microtubo de 2 ml evitando perturbar el sedimento. Descarte el microtubo con el sedimento proteico. 11. Agregue 1.75 ml de etanol al 96% a -20 C, mezcle gentilmente. 12. Retire el DNA precipitado con un microcapilar doblado en forma de gancho y descarte el etanol residual. 13. Enjuague el microcapilar con el DNA en 500 µl de etanol al 70% durante 20 segundos y descarte el etanol residual. 14. Enjuague nuevamente el microcapilar con el DNA en 500 µl de etanol al 70% durante 20 segundos y descarte el etanol residual. 15. Regrese el microcapilar con el DNA al microtubo del último lavado y sequelo en el thermomixer a 70 ºC durante 10 minutos. 16. Resuspenda el DNA en 100 µl de Tris-HCl ph 8.0 para preparar la solución nativa de DNA genómico. 17. Incube la solución nativa de DNA genómico en el thermomixer durante 30 minutos a 70 C y 350 RPM.

8 Control de cambios: 2013, 01 de Nov. - Se corrige reduce de suspensión final del DNA de modalidad microprep a 100 µl y del midiprep a 500 µl. - Se elimina paso de incubación a -20 C durante 20 minutos en el paso de precipitación de todas las modalidades. - Se reduce volumen de etanol al 96º de modalidad midiprep de 1500 a 1000 µl.