Bacterióloga contratista

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1 Elaborado por: Miguel Angel Diaz Osório Bacteriólogo M.Sc. Fecha: 2011/06/15 1. OBJETIVO PROCESO REDES EN SALUD PUBLICA Método de ensayo para la identificación de siete serotipos de Salmonella por PCR múltiple en tiempo real a partir de cultivo Página 1 de 22 Versión Nº : 00 Código: MEN-R Fecha próxima revisión: 2013/05 Revisado por: Aprobado por: Kelly Alejandra Orozco Vargas María Elena Realpe Delgado Bacterióloga contratista Coordinadora Grupo Fecha: 2011/07/11 Microbiología Fecha: 2014/08/29 Establecer los requisitos básicos para la realización de una buena identificación de los serotipos de Salmonella por PCR múltiple en tiempo real a partir de cultivo. 2. ALCANCE Este instructivo aplica para todos los profesionales de la salud que elaboran en los laboratorios del Grupo de Microbiología. SRNL. 3. RESPONSABILIDAD Profesionales del Grupo Microbiología Red. 4. DEFINICIONES PCR en Tiempo Real (qpcr): técnica molecular que permite la detección y cuantificación de ácidos nucléicos, teniendo en cuenta la emisión de fluorescencia durante los ciclos de la reacción como indicador del producto de amplificación. Fluoróforo (reportero): molécula que emite una señal fluorescente cuando es excitada por un rayo de luz a una longitud de onda determinada. Aceptor (Quencher): molécula con capacidad para adsorber la emisión de fluorescencia de un reportero cuando se encuentran en proximidad. Sondas TaqMan: secuencia específica de nucleótidos marcada en el extremo 5 con un fluoróforo y en el extremo 3 con un aceptor. Es uno de los principales sistemas de detección de fluorescencia para la amplificación de ADN. Este tipo de sondas se hidrolizan por la actividad de una exonucleasa 5' que poseen ciertas polimerasa durante PCR. Iniciadores: secuencia corta de nucleótidos que da inicio a la síntesis (polimerización) de una hebra complementaria de ADN. Ruido de Fondo (Background): señal de fluorescencia remanente que se detecta en las reacciones donde no hay amplificación del fragmento de interés. Línea Umbral (Threshold Line): es el nivel de detección o el punto en el cual una reacción alcanza una intensidad de fluorescencia sobre el ruido de fondo. Esta línea se ubica en la fase exponencial de la curva de amplificación. 1

2 Ciclo Umbral (Ct): es el número del ciclo en el cual la fluorescencia generada en una reacción cruza la línea umbral. Esto es inversamente proporcional al logaritmo del número de copias iniciales en la muestra. También llamado Cp (Punto de corte) en la terminología de LightCycler. Objeto de Compensación de Color (OCC): es una función del programa LightCycler480 que ayuda corregir o eliminar el entrecruzamiento de la señal de fluorescencia para observar solo una señal específica en cada uno de los canales de detección. 5. CONDICIONES GENERALES Para el desarrollo de las actividades se debe cumplir con las normas de bioseguridad MNL-A y las Buenas Prácticas de Laboratorios. La placa multipozos se debe mantener siempre sobre una toalla de papel, nunca la coloque directamente sobre una superficie. Con un marcador resalte los números y letras que hay en los bordes de la placa multipozos. Cubra la placa multipozos con la lámina de plástico sellante y presiónela suavemente con el sellador. Limpie con alcohol etílico al 70% la cámara de flujo laminar, micropipetas, vortex y centrifuga, luego, coloque la placa multipozos sobre una toalla de papel, guantes, puntas blancas, amarillas y una gradilla para colocar los tubos eppendorf de 0,2ml y 1,5ml necesarios dentro de la cámara de flujo laminar y deje encendida la luz ultravioleta por 15 minutos. Deje que la IQTM Multiplex Powermix, el agua grado reactivo PCR, los iniciadores con sus respectivas sondas TaqMan y el control positivo de la mezcla a ensayar alcance la temperatura ambiente antes de utilizarlos. Trabaje sin luz blanca dentro de la cámara de flujo laminar para proteger las sondas TaqMan (evita la degradación), además, no es necesario que mantenga la master mix, los iniciadores y las sondas TaqMan en hielo, puede trabajar estos reactivos a temperatura ambiente. 6. MATERIALES Y REACTIVOS Cultivo del aislamiento de Salmonella en agar infusión cerebro corazón de horas Puntas amarillas de 100 µl Puntas blancas de 10 µl Tubos de 0,2 y 1,5 ml (Eppendorf) Placas de 96 pozos para PCR tiempo real (Roche ) 2

3 Elaborado por: Miguel Angel Diaz Osório Bacteriólogo M.Sc. Fecha: 2011/06/15 PROCESO REDES EN SALUD PUBLICA Método de ensayo para la identificación de siete serotipos de Salmonella por PCR múltiple en tiempo real a partir de cultivo Página 3 de 22 Versión Nº : 00 Código: MEN-R Fecha próxima revisión: 2013/05 Revisado por: Aprobado por: Kelly Alejandra Orozco Vargas María Elena Realpe Delgado Bacterióloga contratista Coordinadora Grupo Fecha: 2011/07/11 Microbiología Fecha: 2014/08/29 Láminas de plástico para sellar las placas multipozos de PCR tiempo real (Roche ) Gradilla para tubos de 0,2ml y 1,5 ml Guantes desechables IQTM Multiplex Powermix (BioRad ) Solución de trabajo de iniciadores y sondas TaqMan (10 µm) (Biosearch Technologies) Toallas de papel Agua grado reactivo para PCR Agua destilada estéril 7. EQUIPOS Micro centrífuga Equipo de PCR en tiempo real LightCycler 480 II (Roche). Cámara de flujo laminar-pcr Congelador a -20 C y -70 C 8. TOMA E IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA N/A 9. CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA N/A 10. DESCRICIÓN DE LA TECNICA Extracción ADN por el método de lisis cruda por ebullición Boiling Durante todo el procedimiento de extracción trabaje con guantes. 3

4 Tomar 2 colonias del cultivo en agar BHI del aislamiento de Salmonella con asa estéril y resuspéndalas en 100 μl de agua destilada estéril, mezcle en vortex por 20 segundos para preparar una suspensión homogenea. Colocar la suspensión a temperatura de 95 C por 10 minutos utilizando el programa Boiling del termociclador MJMini (BioRad CA, USA). Centrifugue a r.p.m por 5 minutos. Separe el sobrenadante sin tomar el sedimento en otro tubo de 0,2 ml y conserve la muestra a -20 C hasta su uso en la PCR. PCR múltiple en tiempo real para identificar siete serotipos de Salmonella a partir de cultivos Para identificar el serotipo en un aislamiento de Salmonella debe utilizar las mezclas de identificación (Tabla 1) en el orden que se ha establecido en el diagrama de flujo (Figura 1). En la preparación las mezclas de reacción tenga en cuenta la concentración de cada uno de los iniciadores en las mezclas de identificación (Tabla 2), la concentración de las sondas TaqMan para todas las mezclas es de 100 nm. De acuerdo con el número de aislamientos a procesar incluyendo el control positivo y negativo calcule los volúmenes de cada reactivo para la mezcla BDE según la tabla 4

5 Elaborado por: Miguel Angel Diaz Osório Bacteriólogo M.Sc. Fecha: 2011/06/15 PROCESO REDES EN SALUD PUBLICA Método de ensayo para la identificación de siete serotipos de Salmonella por PCR múltiple en tiempo real a partir de cultivo Página 5 de 22 Versión Nº : 00 Código: MEN-R Fecha próxima revisión: 2013/05 Revisado por: Aprobado por: Kelly Alejandra Orozco Vargas María Elena Realpe Delgado Bacterióloga contratista Coordinadora Grupo Fecha: 2011/07/11 Microbiología Fecha: 2014/08/29 Tabla 1. Mezclas de los iniciadores y sondas TaqMan para la identificación de siete serotipos de Salmonella Númer o Mezcla Iniciador sonda Fluoróforo Serogrupo/antígeno/ serotipo 1 BDE 2 C1C2Z10 3 TypSP 4 Ty 5 En 6 BraeNHad rfbj FAM B, D y E D.wzx CFO 560 E.wzx CFR610 inva Q 670 C1.wzx FAM C1, C2 y antígeno Z10 C2.rfbj CFO 560 flic.z10 CFR 610 inva Q 670 flic.i CFO 560 Typhimurium y fliceh CFR 610 Saintpaul fljb.1,2 FAM inva Q 670 flic.d FAM Typhi wcdb CFO 560 inva Q 670 Sdf.1 FAM Enteritidis flic.g CFR 610 inva Q 670 flic.eh CFR 610 Braenderup, Newport y flic.enx CFO 560 Hadar fljb.1,2 FAM inva Q 670 5

6 CFO 560: Cal Fluor Orange 560 CFR 610: Cal Fluor Red 610 Q 670: Quasar 670 6

7 Figura 1. Diagrama de flujo para la utilización de las mezclas de iniciadores y sondas TaqMan en la identificación de siete serotipos de Salmonella enterica Cultivo de Salmonella enterica Mezcla BDE Mezcla C 1C 2Z 10 Positivo grupo D C 1 C 2 Z 10 Mezcla TypSP Mezcla En Mezcla Ty g,m;sdf-i d;vi i;1,2 Mezcla BraeNHad e,h;e,n,x e,h;1,2 e,n,x i;e,h B Saintpaul Typhimurium Enteritidis Typhi E Negativo grupo Salmonella no grupo B, C1, C2, D, E Positivo grupo Braenderup Newport Hadar

8 Positivo Positivo Negativo Negativo Serogrupo Positivo

9 No olvide realizar el mapa donde indique la posición y orden de las muestras de ADN de aislamientos y controles que se adicionarán en la placa multi-pozos. (Figura 2) rfbj Tabla 2. Concentración de los iniciadores en las mezclas para la identificación de los siete serotipos de Salmonella Número Mezcla Concentración de los iniciadores (nm) 1 BDE 600 D.wzx 400 E.wzx 600 inva C1.wzx C 1C 2Z

10 C2.rfbj 400 flic.z inva flic.e,h TypSP 500 flic.i 500 fljb1,2 400 inva flic.d Ty 500 wcdb 400 inva Sdf En 300 flic.g 300 inva flic.e,h BraeNHad 500

11 fljb.enx 500 fljb.1,2 600 inva 300 Reactivo Tabla 3. Mezcla de reacción BDE Volumen (µl) Concentración Número de reacciones (3) Volumen (µl) Master mix 10 1X 30 rfbj 1,2 600 nm 3,6 Iniciadores D.wzx 0,8 400 nm 0,6 (c/u) E.wzx 1,2 600 nm 3,6 inva 0,4 200 nm 1,2 Sondas TaqMan (c/u) 0,2 100 nm 0,6 Agua PCR 2,2-9,6 Total Procedimiento para la PCR múltiple en tiempo real Seleccione en la placa multipozos ya sea con un punto ó línea los pozos para el control positivo, control negativo y los aislamientos a ensayar. Utilice para esto un marcador delgado. Agite en vortex por unos segundos los iniciadores, sondas TaqMan, IQTM Multiplex Powermix y el agua de PCR antes de utilizarlos, luego, centrifugue mediante un pulso para permitir que la solución baje. Dependiendo del volumen total de la mezcla de reacción a preparar, marque un tubo de 0,2ml ó 1,5ml con el nombre de la mezcla a ensayar. Prepare la mezcla de reacción agregando el respectivo volumen de los reactivos en el siguiente orden: o Agua PCR o IQTM Multiplex Powermix o Iniciadores o Sondas TaqMan Agite en vortex la mezcla de reacción por 5 segundos y centrifugue mediante un pulso. Levante cuidadosamente la lámina sellante de los pozos donde va a adicionar la mezcla de reacción y coloque 19 µl de la mezcla de reacción en cada uno los pozos de la placa,

12 iniciando por el control positivo y terminando con el control negativo, por último, adicione 1µl de agua PCR al pozo del control negativo. Cubra nuevamente los pozos con la lámina sellante utilizando una punta amarilla sin presionar fuertemente. Envuelva la placa multipozos con la toalla de papel y coloque una tapa para protegerla de la luz directa. No olvide mantener la placa multipozos sobre la toalla de papel. Encienda el equipo de tiempo real. Adicione 1 µl de ADN del control positivo y de los aislamientos a los pozos previamente marcados, realice esta operación al lado de un mechero. En este paso tenga cuidado cuando levante y cierre la lámina sellante. Asegure que los pozos están bien tapados con el sellador de la lámina y coloque la placa multipozos en la bandeja del equipo de tiempo real. Programación del equipo de tiempo real. [LightCycler 480 II] Iniciar el programa LightCycler480 software release a través del icono que se encuentra en el escritorio. Dentro del programa se debe crear un nuevo experimento haciendo clic en el ícono new experiment.

13 En la ventana new experiment de clic en la opción Apply Template y en la carpeta Templates seleccione el archivo PCR salm Run Protocol para establecer las condiciones de reacción. Nota: En la pestaña Run Protocol podrá visualizar y configurar las temperaturas y ciclos de la reacción de PCR. En la sección Subset Editor seleccione los pozos de la placa que utilizará para los controles positivo y negativo y los aislamientos que se analizarán en la PCR. Para esto tenga en cuenta el mapa realizado anteriormente. Identifique con un nombre esta placa haciendo clic en clic en.

14 Luego, en la sección Sample Editor identifique cada uno de los pozos que fueron seleccionados en el plato con el nombre respectivo de los controles y el código de los aislamientos. Guarde la configuración del nuevo experimento con la opción del icono. No olvide colocar el nombre del ensayo y la fecha. Abra la bandeja del equipo de tiempo real para cargar la placa multi-pozos, tenga cuidado de colocarla de la forma correcta y luego ciérrela. Seleccione experiment nuevamente y ubíquese en la pestaña de Data y de clíc en el icono de Star Run para dar inicio al programa de PCR en tiempo real. Luego de finalizar el programa de termociclado, el programa mostrará un mensaje de run complete. Abra de nuevo la bandeja, retire la placa multipozos y apague el equipo de tiempo real.

15 11. CONTROLES INTERNOS Los controles internos son mezclas de ADN de los siguientes serotipos: Salmonellan Typhimurium Salmonella Saintpaul Salmonella Braenderup, Salmonella Newport Salmonella Hadar Salmonella Enteritidis Salmonella Typhi 12. LIMITACIONES Solo se identifican siete de los 2579 serotipos de Salmonella existentes 13. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Lectura e interpretación de los resultados de PCR en tiempo real Diríjase a la sección Analysis para ver los resultados del ensayo utilizando la opción Abs Quant/fit points. En la ventana Create new analysis seleccione el nombre de la placa en la opción subset.

16 Seleccione la pestaña de Noise Band para observar la curva logarítmica de fluorescencia que tiene la forma característica de curva sigmoidea. La presencia o ausencia de un gen o secuencia que identifica un factor antígeno en un aislamiento se determina con el análisis de la curva de fluorescencia y la obtención del Ct (Cycler threshold) o ciclo umbral. Para esto, debe inicialmente configurar la línea umbral (threshold line) en la grafica logarítmica de fluorescencia de la siguiente forma: Seleccione los pozos de los controles y los aislamientos que va a analizar con la mezcla ensayada. Active el objeto de compensación de color haciendo clic en la opción Color Comp. Escoja el archivo PCR salm OCC 2 (CC).

17 Elija la combinación de filtros para el fluoróforo que desea analizar en la opción Filter Comb. Por defecto, siempre encontrará la combinación FAM ( ). Nota: en la combinación de filtros para el fluoróforo CFR 610 especialmente en la mezcla BDE, se debe tener cuidado de no confundir el ruido de fondo que generan los aislamientos que son positivos para el grupo D con una curva fluorescencia para el grupo E. Esto se debe a lectura cruzada -Crosstalk- que existe entre los filtros para CFO 560 y CFR 610. Configure el valor de desviación estándar para el fluoróforo seleccionado utilizando la opción Noiseband (STD) Mult y coloque el valor de desviación estándar en la celda STD Multiplier. Tenga en cuenta la tabla de desviaciones estándar para cada uno de los fluoróforos en las mezclas utilizadas (Tabla 4). Calcule el Ct con la opción Calculate. Luego de este procedimiento, verifique que la línea umbral se ubica por encima del ruido de fondo que genera el control negativo y las muestras que no amplificaron y en la zona media de la amplificación logarítmica de las curvas del control positivo y de las muestras positivas. Observe el ejemplo del Resultado de la mezcla BDE del control positivo y negativo (Anexo 1). Utilice el panel de muestras junto con la grafica logarítmica para Identificar los aislamientos que son positivos para un grupo o factor antígeno teniendo en cuenta la presencia de Ct y la curva de fluorescencia y negativos por la ausencia de Ct. Tenga en cuenta que todos los aislamientos que son Salmonella deben amplificar para el control interno de reacción gen inva.

18 14. EMISIÓN DE RESULTADOS

19 Los resultados obtenidos de cada una de las mezclas ensayadas se deben consignar en el cuaderno de registro REG-R , colocando la fecha de realización del ensayo, el grupo, los factores antigénicos identificados y la firma de quien realizó la prueba. 15. EXAMENES COMPLEMENTARIOS N/A Tabla 4. Desviaciones estándar para los fluoróforos utilizados en las mezclas de identificación Númer o Mezcla 1 BDE 2 C1C2Z10 3 TypSP 4 Ty 5 En 6 BraeNHad de siete serotipos de Salmonella Valor desviación Fluoróforo estándar (STD multiplier) FAM 57 CAL Fluor Orange CAL Fluor Red Quasar FAM 57 CAL Fluor Orange CAL Fluor Red Quasar CAL Fluor Orange CAL Fluor Red FAM 100 Quasar FAM 40 CAL Fluor Orange Quasar FAM 25 CAL Fluor Red Quasar CAL Fluor Red CAL Fluor Orange FAM 120 Quasar

20 Después de conocer el resultado de la mezcla BDE realizar la mezcla de reacción TypSP (Tabla 5) para detectar las flagelinas que definen el serotipo del aislamiento de Salmonella Reactivo Tabla 5. Mezcla de reacción TypSP Volumen (µl) Concentración Número de reacciones (3) Volumen (µl) Master mix 10 1X 30 flic.i 1,0 500 nm 3,0 Iniciadores fliceh 1,0 500 nm 3,0 (c/u) fljb.1,2 0,8 400 nm 2,4 inva 0,6 300 nm 1,8 Sondas TaqMan (c/u) 0,2 100 nm 0,6 Agua PCR 1,4-4,2 Total DOCUMENTOS DE REFERENCIA LightCycler 480 II Instrument Operator s Manual, Roche CONTROL DE REGISTROS CONTROL DE REGISTROS IDENTIFICACION ARCHIVO DE GESTION ARCHIVO CENTRAL ARCHIVO HISTÓRICO COD REG- R NOMBRE Cuaderno de registro Salmonella spp ORDENACIO N DOCUMENTA L Se ordena cronológicame nte RESPONSAB LE El profesional responsable del programa LUGAR Archivo de Salmonella spp Satélite TIEMPO DE RETENCIO N 3 años METODO UTILIZA DO Se mantiene en el archivo de gestión de Microbiol ogía hasta que pase al archivo central RESPONSAB LE Secretaria del Grupo de Microbiología TIEMP O METODO UTILIZADO 5 años Eliminación

21 18. CONTROL DE REVISION. VERSION FECHA APROBACION DESCRIPCIÓN AA MM DD Creación de documento 19. ANEXOS. Anexo 1. Resultado mezcla BDE del control positivo A B C D Fluoróforo Identifica C(t) A FAM Grupo B 20.3 B CFO560 Grupo D 19 C CFR610 Grupo E 20.7

22 Quasar670 InvA 20.8