SUERO AUTÓLOGO: EFECTOS BIOLÓGICOS

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1 SECCIÓN IV. SUERO AUTÓLOGO Capítulo 7 SUERO AUTÓLOGO: EFECTOS BIOLÓGICOS José Santiago López García, Luis Rivas Jara, María Castro Rebollo, Isabel García Lozano Los efectos del suero autólogo sobre la superficie ocular van a venir determinados por sus numerosas propiedades biológicas. El suero presenta unas características muy similares a la lágrima en cuanto a ph y osmolaridad y, al igual que ésta, contiene abundantes factores de crecimiento, factores neurotróficos y moléculas con acción antibacteriana que determinan que el tratamiento con suero autólogo tópico no sólo humidifique la superficie ocular sino que, además, aporte factores nutricionales y de crecimiento, necesarios para mantener la viabilidad celular, y componentes bactericidas que reducen el riesgo de contaminación e infección (1,2). La terapia con suero autólogo produce un efecto transitorio que persiste varias semanas después de suspender el tratamiento (3), por lo que en procesos crónicos podemos recurrir a una pauta discontinua alternando ciclos de tratamiento con suero autólogo con otros de lágrimas artificiales. La duración e intensidad de estos ciclos dependerán de la gravedad del proceso etiopatogénico responsable. En otras ocasiones, un solo ciclo de tratamiento puede ser suficiente y definitivo para la estabilización de la superficie ocular. Con todo, no se conocen cuáles son los factores más beneficiosos del suero autólogo, ni cuál debe ser la concentración óptima de éstos. Autores como Geerling et al., revisando los resultados publicados en la bibliografía, encuentran una gran variabilidad en cuanto a las acciones del suero autólogo tanto sobre los efectos clínicos subjetivos percibidos por el paciente como sobre los cambios en pruebas objetivas como el test de Schirmer, tinción con rosa de bengala o fluoresceína, tiempo de ruptura de la película lagrimal (BUT) o el aclaramiento de fluoresceína (4). Esta diversidad en los resultados puede obedecer a diferencias en el modo de preparación del suero autólogo así como a la heterogeneidad de la población estudiada, tanto por la variedad de procesos patológicos tratados como por la gravedad de los mismos, incluso dentro del mismo estudio. Los efectos específicos sobre cada patología se tratarán en los capítulos 8 y 9, pretendiendo en este capítulo hacer una valoración global de los efectos de estos preparados sobre la superficie ocular. COMPARACIÓN CON LÁGRIMAS ARTIFICIALES Aunque algunos autores no encuentran diferencias estadísticamente significativas entre el tratamiento con suero autólogo y otras terapias convencionales con lágrimas artificiales o BSS (5,6), la aplicación de suero autólogo supera ampliamente a la terapia sustitutiva con lágrimas artificiales en la mayoría de los estudios (3). En trabajos realizados en cultivos de células epiteliales, el suero autólogo preserva la integridad de las membranas celulares y aumenta los niveles de ATP intracelular, ambos considerados índices de viabilidad celular (7,8), más que lágrimas artificiales como la hidroxipropilmetilcelulosa (9). En estudios in vitro, las células epiteliales mantienen mejor su morfología y función en medios de cultivo enriquecidos con suero autólogo que en medios enriquecidos con lágrimas artificiales (4,10). De igual forma, el suero ha mostrado un mayor efecto sobre la proliferación celular que las lágrimas artificiales, incrementando la trascripción de ARN para el Factor de Crecimiento Neuronal y los receptores del Factor de Crecimiento Transformante beta (TGF-β) (11). Efectos similares del suero relativos a proliferación celular se han publicado en estudios clínicos. Schulze et al., en pacientes diabéticos con defectos epiteliales corneales tras vitrectomía, encuentran que los pacientes tratados con suero autólogo presentan un cierre del defecto epitelial más rápido (dos días de media) que los pacientes tratados con ácido hialurónico (12), mientras que Kojima et al. refieren una mejoría clínica subjetiva y en las determinaciones del BUT, tinción con rosa de bengala y tinción con fluoresceína en pacientes con ojo seco tratados con suero autólogo en comparación con lágrimas artificiales (13).

2 86 7. Suero autólogo: efectos biológicos EFECTOS CLÍNICOS En general el suero autólogo es muy bien tolerado por el paciente y la mayoría de trabajos publicados refieren una mejoría en la calidad de vida, menos molestias, mejor visión y un mayor confort y bienestar con el tratamiento (14). Estos efectos beneficiosos se producen de una forma indirecta al mejorar la estabilidad del epitelio corneal y de la lágrima, lo que favorece una adecuada interacción entre los distintos elementos que integran la superficie ocular. La variabilidad en cuanto a la preparación del suero y la heterogeneidad de los pacientes tratados en los diferentes trabajos, hace que sea difícil comparar de manera exhaustiva y directa los efectos clínicos subjetivos del suero. Autores como Tananuvat et al. no encuentran diferencias estadísticamente significativas en relación a síntomas subjetivos, como sensación de cuerpo extraño, disconfort, fotofobia y sensación de sequedad, entre el tratamiento con suero autólogo y el tratamiento con solución salina en pacientes con ojo seco (5); sin embargo, otros autores refieren que los pacientes con ojo seco tratados con suero experimentaron una mejoría de los síntomas clínicos (15), incluso en casos de ojo seco severo (13,16). Lee et al. publican que el 76,1% de los pacientes con ojo seco crónico presentó una mejoría clínica subjetiva tras el tratamiento con suero autólogo (17). Efectos similares son referidos por otros autores tras la utilización del suero autólogo en Defectos Epiteliales Persistentes (DEP) (9,18), síndrome de Sjögren (16) y queratopatía neurotrófica (19). Noble et al., en un estudio randomizado entre tratamiento con suero autólogo y terapia convencional en diversas patologías de la superficie ocular, encuentran que un 75% de los pacientes manifestaron una mejoría clínica subjetiva tras el tratamiento con suero autólogo, mientras que el 25% restante no mostró preferencia por ninguno de los tratamientos (3). En un trabajo nuestro en pacientes con aniridia observamos que la mayoría de los pacientes presentaron una mejoría subjetiva de los síntomas tras el tratamiento con suero aútologo en relación al tratamiento previo con lágrimas artificiales, mostrando una alta tasa de satisfacción que hizo que más del 65% de los pacientes prefirieran ser tratados con suero autólogo en lugar de lágrimas artificiales (20). En otro trabajo reciente, hemos encontrado cómo pacientes con síndrome de Sjögren experimentaron una mejoría clínica subjetiva de casi dos puntos en una escala de 1 a 5 utilizada para evaluar la percepción subjetiva del paciente previa y posterior al tratamiento con suero autólogo, donde 5 representaba un intenso grado de molestias y 1 la ausencia total de síntomas (resultados no publicados). EFECTOS SOBRE EL EPITELIO A nivel epitelial se producen probablemente los efectos más importantes del suero autólogo sobre la superficie ocular ya que, como vimos en el capítulo 5, contiene abundantes factores implicados en la proliferación, migración, diferenciación y viabilidad de las células epiteliales (21,22). Los pacientes con sequedad ocular presentan una disminución de determinados componentes de la lágrima que comprometen la integridad de la superficie ocular, observándose un anormal funcionamiento epitelial que se traduce en la aparición de defectos epiteliales (18,23). El tratamiento con suero autólogo aporta Fig. 1: Alteraciones epiteliales en un paciente con síndrome de Sézary. Alteraciones cutáneas de la enfermedad (A,B,C). Queratopatía asociada (D-G).

3 7. Suero autólogo: efectos biológicos 87 Fig. 2: Evolución de un Defecto Epitelial Persistente (DEP) tratado con suero autólogo al 20%. (A) Fotografías realizadas en el momento del diagnóstico. Obsérvese el nivel de hipopion (flecha). Tres días después de tratamiento con antibióticos, ciclopléjico y corticoides locales el hipopion ha desaparecido (B), iniciando la terapia con suero autólogo al 20% diluido con ácido hialurónico. La mejoría en la reepitelización del defecto es evidente tras cuatro días de tratamiento (C), continuando ésta a los 7 (D), 10 (E), 14 (F) y 18 días (G), produciéndose la resolución completa del defecto a los 25 días (H). estos factores deficitarios, incluso en una concentración mayor que la lágrima, restaurando la funcionalidad y dinamismo del epitelio y favoreciendo la interrelación entre epitelio y estroma durante la regeneración corneal tras agresiones. El suero autólogo favorece el crecimiento y trofismo celular, por lo que es especialmente útil en el manejo de patologías que cursen con defectos epiteliales (fig. 1). Varios estudios encuentran una buena respuesta a la terapia con suero autólogo en pacientes con DEP refractarios al tratamiento convencional, con una tasa de curación de un 40% en las dos primeras semanas de tratamiento y una tasa de respuesta global de un 75% (18,23). Los efectos beneficiosos de esta terapia en pacientes con DEP comienzan a notarse entre la primera y segunda semana de tratamiento, aunque la mejoría subjetiva empieza prácticamente desde el segundo día (9). Para determinar si un paciente responde o no de forma satisfactoria al tratamiento deben transcurrir al menos 3 semanas desde el inicio del mismo (24) (fig. 2). El efecto del suero autólogo sobre las células de Müller y los epitelios de la superficie ocular ha sido ampliamente estudiado en cultivos celulares, tanto de células primarias obtenidas por biopsia como en cultivos con líneas de células inmortalizadas (25). Estos cultivos nos permiten estudiar la capacidad de proliferación, diferenciación y migración de las células mediante la utilización de diferentes marcadores de proliferación como la proteína p63, así como el estudio de citoqueratinas específicas del epitelio corneal (citoqueratinas 3 y 12) o del epitelio conjuntival (citoqueratina 19) (fig. 3). La proliferación celular en cultivos puede también determinarse mediante el estudio de bioluminiscencia del ATP. El ATP está presente en todas las células metabólicamente activas y se considera un buen marcador de la viabilidad celular. La bioluminiscencia es un proceso químico complejo en el que se produce la oxidación de un sustrato de luciferina, catalizado por la enzima luciferasa, en un proceso que precisa oxígeno y energía en forma de ATP. La oxidación va a producir una molécula de oxiluciferina que al regresar a su estado normal genera luz que es medida mediante un luminómetro. La determinación de la luminosidad es proporcional a la viabilidad y actividad metabólica de las células del cultivo (26).

4 88 7. Suero autólogo: efectos biológicos Fig. 3: Cultivo de células limbares. (A) Fragmento de limbo. Las células epiteliales se separan mediante digestión con dispasa II durante 20 horas. Microfotografía de fluorescencia del mismo campo de un cultivo de células del limbo. De verde se tiñen las células que expresan en el núcleo la proteína p63α, un marcador de proliferación celular (B) y de rojo las que expresan en su citoplasma la citoqueratina 3, una citoqueratina específica del epitelio corneal y, por tanto, un marcador de diferenciación (C).(D) Imagen del mismo campo obtenida por inmunofluorescencia doble. Estos estudios han demostrado diferentes comportamientos del suero autólogo según el modo de elaboración del preparado (27). En cuanto a los efectos sobre los cultivos celulares en relación a la concentración del producto, algunos autores como Tsubota et al. no encuentran diferencias en cuanto a migración celular entre preparados de suero autólogo al 10 y al 20% (23), mientras que Harloff et al. sí refieren una relación dosis dependiente del suero autólogo sobre la proliferación y migración celular (28). Harwig et al. observan en cultivos de células humanas inmortalizadas (SV-40) que los mayores efectos sobre la proliferación celular, estimada mediante la prueba de luminiscencia de ATP, se producen con suero autólogo diluido al 12,5%, mientras que los mayores efectos sobre la migración celular, determinada mediante dispersión de colonias, se obtienen con muestras no diluidas de suero (29). En un estudio reciente en cultivos de conjuntiva y limbo, hemos observado como la adición al medio de cultivo convencional de suero autólogo al 20, 10, 5 y 2,5% favorece la proliferación, migración y diferenciación celular en comparación con los cultivos que crecen con medios convencionales y de una forma similar a la producida con la adición de suero fetal bovino (fig. 4). Al igual que otros autores, no hemos encontrado diferencias en cuanto a proliferación celular entre preparados al 20 y al Fig. 4: Imagen de contraste de fase tomada con un microscopio invertido de un cultivo de células conjuntivales creciendo en un medio de cultivo específico de células epiteliales (CnT-50, CellnTec, Berna, Suiza) (A) y el mismo medio enriquecido con suero autólogo al 2,5% (B). La adición de suero autólogo estimula la proliferación de las células epiteliales conjuntivales como puede verse en las microfotografías realizadas a los 5, 10 y 15 días, estimulando también el crecimiento de fibroblastos (células más alargadas) en el cultivo. Los cultivos se realizaron a 37 C, con una humedad del 95% y en atmósfera de CO2 del 5%.

5 7. Suero autólogo: efectos biológicos 89 Fig. 5: Cultivo de células conjuntivales. (A) Cuantificación de la proliferación total del cultivo mediante EdU obtenida por microscopía robotizada. Se aprecia que la mayor tasa de proliferación celular global se produce añadiendo suero autólogo al 10% al medio de cultivo convencional (CnT-50), aunque al estudiar la proliferación de las células epiteliales (CK-19 positivas) ésta es mayor con concentraciones de suero autólogo al 2,5% (B). Secuencia de imágenes obtenidas mediante inmunofluorescencia: de color verde se tiñen las células epiteliales que expresan la citoqueratina 19, un marcador específico de células epiteliales conjuntivales, de violeta las células que expresan el marcador de proliferación EdU y de azul todas las células del cultivo. Podemos apreciar como las células epiteliales proliferan y se diferencian más en cultivos enriquecidos con suero diluido al 2,5% (C) que al 5% (D), mientras que al 10% casi todas las células que proliferan son fibroblastos (E). 10% (28), teniendo éstos un efecto mayor que preparados más diluidos (5 y 2,5%). Comparando el grado de proliferación celular en estos cultivos, observamos como la mayor proliferación celular, determinada por inmunofluorescencia mediante la captación de un marcador de proliferación como el EdU (un análogo del Brdu que se incorpora al ADN de las células que están en fase «S» del ciclo celular), se produce con preparados diluidos al 10%; sin embargo, las células epiteliales del cultivo proliferan y se diferencian más cuando el medio se enriquece con suero diluido al 2,5%. Concentraciones mayores de suero producen sobre todo un aumento exponencial en el número de fibroblastos, a pesar de crecer en medios de cultivo específicos para células epiteliales (fig. 5). EFECTOS DEL SUERO AUTÓLOGO SOBRE LAS MUCINAS La triestratificación de la película lagrimal se conoce desde 1892 gracias a los trabajos de Terson (30), aunque es Wolff en 1946 quien establece la existencia de un estrato lipídico, una fase acuosa y una fase mucínica. En la actualidad se considera que la lágrima es un gel de mucina con una capa lipídica sobre ella, siendo la mucina más abundante en las inmediaciones de la córnea. La mucina supone menos del 0,5% del total de la lágrima. Su grosor determinado por microscopía electrónica es de 0,5 µm (31), aunque otros autores mediante interferometría encuentran valores más elevados (32,33).

6 90 7. Suero autólogo: efectos biológicos La capa mucínica de la película lagrimal procede de las células caliciformes conjuntivales y, en menor medida, de la mucina segregada por las células epiteliales y glándulas lagrimales (34,35). En cada ojo hay cerca de millón y medio de células caliciformes, siendo su concentración mayor en el fórnix, párpado inferior y la porción infero-nasal de la conjuntiva bulbar (34,36). Estas células se forman por mitosis a partir de células madre situadas en el estrato basal del epitelio conjuntival y migran hacia la superficie a la vez que maduran y almacenan mucina. Una vez en la superficie, la célula se abre y vierte su contenido mucínico a la lágrima, desprendiéndose posteriormente la célula a la cuenca lagrimal (36). La mucina liberada se hidrata con rapidez al contacto con el agua existente en la película lagrimal. Las mucinas son un grupo heterogéneo de glicoproteínas de alto peso molecular que forman parte de las secreciones mucosas del organismo. Se conocen unos 20 tipos de mucinas que se dividen en dos grupos: las mucinas transmembrana y las mucinas secretoras que, a su vez, se dividen en mucinas formadoras de gel y mucinas solubles. A nivel de la superficie ocular se expresan al menos nueve de estas mucinas: seis transmembrana (MUC1, MUC4, MUC13, MUC15, MUC16 y MUC17), dos mucinas formadoras de gel (MUC2 y MUC5AC) y una mucina soluble (MUC7) (37,38). Las mucinas transmembrana son de menor tamaño que las formadoras de gel. Se localizan principalmente en las membranas apicales de las células epiteliales formando un denso glicocálix en la interfase epitelio-lágrima, aunque también pueden encontrarse en la lágrima. Tienen un importante papel actuando como barrera física a la penetración de patógenos. Las mucinas formadoras de gel Fig. 6: Esquema representativo de la película lagrimal normal donde se pueden apreciar las distintas fases de la lágrima y la formación de los puntos secos. son de mayor tamaño y se localizan sobre el glicocálix epitelial, son las más abundantes en la capa mucínica y las responsables de las propiedades reológicas del moco (fig. 6). De todas las mucinas, las más importantes a nivel de la superficie ocular son la MUC1, MUC5AC, MUC4, MUC2 y la MUC7. La MUC1 es expresada por el epitelio corneal y conjuntival, siendo similar a la encontrada en la saliva. Esta mucina dificulta la adhesión de los microorganismos al epitelio. La MUC4 es más característica del epitelio conjuntival y aunque es una mucina transmembrana se puede encontrar en forma soluble (39). La MUC7 se expresa a nivel corneal, conjuntival y en la glándula lagrimal. Al igual que las mucinas transmembrana, parece tener un papel protector frente a bacterias, hongos y otros patógenos, estando relacionada la disminución de expresión de MUC7 con un incremento de la susceptibilidad a queratitis microbianas, sobre todo en portadores de lentes de contacto (40,41). La MUC2 se encuentra a nivel conjuntival y su expresión aumenta en casos de inflamación. La MUC5AC es característica de las células caliciformes (42) por lo que su presencia en córnea es indicativa de insuficiencia limbar. El laboratorio Bioftalmik ha comercializado recientemente un kit para detectar esta mucina mediante el análisis de expresión del transcrito del gen MUC5AC por RT- PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa en Transcripción Reversa). La PCR genera una gran cantidad de copias de ADN mediante un proceso llamado amplificación. La RT-PCR es una variante de la PCR convencional en la que se parte de ARN en lugar de ADN, siendo este ARN retrotranscrito a ADN complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa reversa y amplificando este ADNc en una PCR tradicional. El estudio se lleva a cabo realizando una simple citología de impresión mediante dos discos de acetato de celulosa de 8 mm de diámetro. El primer disco se coloca sobre la córnea y el segundo disco sobre la conjuntiva bulbar. Cada disco se aplica por ambas caras para obtener el máximo número de células. Las muestras citológicas se toman, tras instilar anestésico doble, con una pinza estéril presionando suavemente sobre los discos durante unos segundos para mejorar el rendimiento de la prueba. Posteriormente, los discos se introducen en un tubo que contiene un tampón conservante de ARN (cada kit contiene cuatro tubos, dos para muestras corneales (OD y OI) y otros dos para muestras conjuntivales) y se remiten al laboratorio para su procesamiento y análisis (fig. 7). Este

7 7. Suero autólogo: efectos biológicos 91 Fig. 7: (A) Toma de las muestras de epitelio corneal (1) y conjuntival (2). El disco de acetato de celulosa se debe aplicar en primer lugar en el centro de la córnea y después en la conjuntiva bulbar por ambas caras del disco ejerciendo una leve presión para favorecer la recolección de células. Inmediatamente después las muestras se introducen en el tubo que contiene un líquido estabilizante del RNA (B). (C) Imagen de gel representativo del análisis corneal de un individuo sano (calles 1 y 2) y un paciente con insuficiencia límbica (calles 3 y 4). Encontramos 3 tamaños de banda diferentes: 103 bp correspondiente a (MUC5AC), 171 bp a ACTB, y 122 bp correspondiente a GAPDH, estos dos últimos genes usados como controles de la reacción. En la calle 1 y 3 se indica con un círculo rojo el tamaño correspondiente al transcrito MUC5AC (103 pb). En la calle 1 no se evidencia señal por lo cual la PCR es negativa, mientras que en la calle 3 se observa la banda de amplificación por lo que el resultado de PCR es positivo. test nos permite detectar la presencia de MUC5AC en córnea, indicativa de insuficiencia limbar, y también cuantificar la cantidad de MUC5AC en conjuntiva permitiéndonos monitorizar la superficie conjuntival tras diferentes tratamientos (fig. 7). Numerosas enfermedades oculares presentan alteraciones en la expresión de mucinas. Se han encontrado niveles disminuidos de MUC5AC en pacientes con síndrome de Sjögren en relación con una disminución de células caliciformes en la citología conjuntival (43). En la queratoconjuntivitis alérgica existe una disminución de MUC5AC, mientras que en la queratoconjuntivitis vernal aumenta el número de células caliciformes y MUC5AC, normalizándose sus valores con la terapia antialérgica y antiinflamatoria (34). Los pacientes con ojo seco tienen una reducción significativa de los niveles de MUC1, MUC2, MUC4 y MUC5AC, mientras que los niveles de MUC7 (una mucina soluble) permanecen inalterados. Estos pacientes, presentan modificaciones estructurales en las cadenas de oligosacáridos de las mucinas, que podría explicar un menor efecto lubricante de éstas y una alteración de la estabilidad de la película lagrimal. El ARNm de MUC1 es un excelente test diagnóstico para el ojo seco (37). Una sobreexpresión de mucinas (sobre todo MUC1) se ha relacionado con procesos neoplásicos y enfermedades pulmonares, pudiéndose utilizar la expresión de éstas como marcadores en el diagnóstico y seguimiento de estos procesos (44-46). La función de las mucinas viene determinada en parte por sus propiedades estructurales, destacando su gran capacidad para retener agua y formar geles viscosos que sirven para lubricar la superficie ocular. Por otro lado, la mucina es muy importante en la estabilidad de la película lagrimal al disminuir la tensión superficial de la lágrima y hacer que el epitelio corneal, hidrófobo, quede recubierto por una capa glicoproteica de características hidrofílicas. Ambas propiedades facilitan el deslizamiento palpebral y la dinámica lagrimal. Además, la capa mucínica actúa como barrera defensiva frente a la invasión de agentes patógenos, atrapándolos y arrastrándolos al lago lagrimal. El correcto funcionamiento de la capa mucínica precisa una adecuada calidad y cantidad de mucina. La calidad depende no sólo de la estructura y tipo de mucinas secretadas, sino también de la apropiada hidratación de éstas. En el ojo sano, las mucinas transmembrana del glicocálix facilitan la extensión de la película lagrimal. En casos de ojo seco, la disminución del volumen lagrimal hace que las mucinas estén menos hidratadas, desarrollándose puntos de desprotección (puntos secos) en la superficie ocular que conducen a la queratinización y a la disminución de expresión de genes de mucinas en las células epiteliales (35) (fig. 6). Por otro lado, las alteraciones de la capa mucínica que se producen en ojos secos mucodeficientes, o de forma secundaria en otros tipos de ojo seco, hacen que el tratamiento con lágrimas artificiales no humidifique de forma correcta la superficie ocular. La secreción de mucinas es estimulada sobre todo por neurotransmisores parasimpáticos, como la acetilcolina y el VIP (47), aunque estudios recientes han demostrado el papel de los factores de crecimiento en el control de la secreción de mucinas (42). Sustancias como el carbacol, EGF, óxido nítrico, Factor de Necrosis Tumoral alfa (NTF α) y las interleuquinas 1 y 6 incrementan la síntesis de MUC5AC y son potenciales reguladores de la secreción y proliferación de las células caliciformes (42). Estudios in vitro han demostrado que el suero autólogo tiene un efecto directo dosis-dependiente

8 92 7. Suero autólogo: efectos biológicos sobre el aumento de la expresión del receptor MUC1 en cultivos de células conjuntivales que parece estar mediado por receptores de EGF en las células caliciformes que, por otro lado, son muy sensibles a la acción de la vitamina A (16,48,49). Nosotros hemos encontrado que la terapia con suero autólogo mejora la expresión de varias mucinas a nivel de la superficie ocular en pacientes con ojo seco. Los niveles de MUC5AC a nivel conjuntival determinados mediante RT-qPCR (del inglés reverse transcription quantitative polymerase chain reaction) o PCR cuantitativa en transcripción reversa, fueron significativamente mayores tras el tratamiento con suero autólogo, estando en relación con un aumento de células caliciformes en la citología de impresión y una mejoría en el grado de metaplasia conjuntival. A nivel corneal, el tratamiento con suero autólogo disminuyó la expresión de esta mucina en algunos pacientes con insuficiencia limbar, mejorando también el grado de metaplasia escamosa. El tratamiento con suero autólogo también mejoró la expresión de MUC1 a nivel corneal y conjuntival (fig. 8). Fig. 8: Expresión de MUC1 en muestras de citología corneal previa (A) y tras tratamiento con suero autólogo (B). El suero mejoró la expresión de MUC1 por las células epiteliales de la córnea determinada mediante anticuerpos monoclonales anti-muc1 (Sigma-Aldrich). Expresión de MUC5AC a nivel corneal (C). En OD expresión de MUC5AC en córnea antes de tratamiento confirmando insuficiencia límbica, pero después del tratamiento no se observa expresión de MUC5AC. En OI no se observa MUC5AC ni antes ni después del tratamiento. EFECTOS SOBRE LA METAPLASIA ESCAMOSA El diagnóstico de sequedad ocular en la práctica diaria se realiza mediante un sistema de graduación de datos clínicos (50); sin embargo, algunas pruebas como la citología de impresión pueden ayudar en el diagnóstico y seguimiento de estos pacientes (51). Al igual que otros epitelios húmedos, los epitelios de la superficie ocular reaccionan frente a las agresiones mediante un proceso de metaplasia escamosa, una transición patológica y reversible de las células secretoras (células caliciformes) y epiteliales con cambios morfológicos que transforman un epitelio normal estratificado no queratinizado en un epitelio queratinizado. La citología de impresión es una técnica habitual en el diagnóstico de distintas alteraciones de la superficie ocular (52,53), presentando una alta sensibilidad y especificidad (54). Es una técnica mínimamente invasiva que nos permite recoger y estudiar la capa más externa del epitelio de la superficie ocular, clasificar el grado de metaplasia y emplear técnicas histológicas, inmunohistoquímicas o de análisis molecular (55,56). La recogida de muestras se realiza en una tira de papel de filtro de acetato de celulosa (Millipore HAWP304) colocada sobre la superficie ocular tras instilar un colirio anestésico. Las muestras pueden ser obtenidas de la córnea y de la conjuntiva. Posteriormente, se fijan en etanol al 96% o formaldehido al 10%, se tiñen con ácido peryódico-schiff (PAS) y hematoxilina, se deshidratan en grados ascendentes de etanol, se aclaran con xilol, se montan en resina Entellan, se cubren con un cubreobjetos y se examinan al microscopio óptico. Mediante la citología de impresión podemos observar fácilmente las características que permiten evaluar el grado de metaplasia escamosa: el tamaño celular total, el tamaño del citoplasma y del núcleo, la forma celular, la relación núcleo-citoplasma (N:C), la tinción citoplasmática, las alteraciones nucleares y la densidad de células muco-secretoras (55,57). Hay varios sistemas para clasificar la metaplasia escamosa basados en parámetros morfológicos y morfométricos de las células epiteliales de la superficie ocular. Nosotros utilizamos una clasificación que evalúa las características de las células caliciformes conjuntivales y las células epiteliales de córnea y conjuntiva (55). Esta clasificación diferencia seis grados de metaplasia, uno de normalidad y cinco grados patológicos (tabla 1).

9 7. Suero autólogo: efectos biológicos 93 TABLA 1. Clasificación de la metaplasia escamosa Metaplasia Citología corneal Citología conjuntival Grado 0 Cél. epiteliales pequeñas ( µm 2 ) y muy juntas, con una rel. N:C de 1:2. Citoplasma eosinófilo con núcleos redondos, pequeños y sin alteraciones. Densidad de cél. caliciformes > 400 cél./mm 2, con tinción citoplasmática PAS-positivo. Las células epiteliales no-secretoras son pequeñas ( µm 2 ), íntimamente unidas y con una rel. N:C de 1:1-1:2. Grado 1 Cél. epiteliales de µm 2, muy compactas y con una rel. N:C de 1:3-1:4. Citoplasma eosinófilo con núcleos redondos, pequeños y sin alteraciones. Grado 2 Cél. epiteliales de mayor tamaño ( µm 2 ), moderadamente separadas y con una rel. N:C de 1:5-1:8. Citoplasma eosinófilo con núcleos redondos, pequeños y ocasionalmente binucleados. Grado 3 Cél. epiteliales mayores ( µm 2 ), bastante separadas y con una rel. N:C de 1:9-1:15. Citoplasma metacromático con núcleos redondos y generalmente alterados (binucleados y picnóticos). Grado 4 Cél. epiteliales grandes ( µm 2 ), aisladas y con una rel. N:C de 1:16-1:20. Citoplasma basófilo con núcleos alterados (picnóticos y anucleados). Grado 5 Cél. epiteliales muy grandes (mayor de µm 2 ), aisladas y con una rel. N:C mayor de 1:20. Citoplasma basófilo y generalmente queratinizado con núcleos muy alterados o desaparecidos. Las cél. caliciformes son menos abundantes ( cél/mm 2 ), con citoplasma PAS-positivo. Las células epiteliales no-secretoras son mayores ( µm 2 ), muy unidas y con una rel. N:C de 1:2-1:3. Cél. caliciformes más escasas ( cél/mm 2 ), con citoplasma PAS-positivo. Las células epiteliales no-secretoras son mayores ( µm 2 ), ligeramente separadas y con una rel. N:C de 1:4-1:6. Densidad de cél. caliciformes ( cél/mm 2 ), con débil tinción PAS-positiva del citoplasma. Las células epiteliales son grandes ( µm 2 ), moderadamente separadas y con una rel. N:C de 1:7-1:10. Cél. caliciformes escasas (50-10 cél/mm 2 ), alteradas y generalmente con una tinción del citoplasma PASnegativa. Las células epiteliales son muy grandes ( µm 2 ), aisladas y con una rel. N:C de 1:11-1:15. Las cél. caliciformes han desaparecido. Las células epiteliales no-secretoras son muy grandes (mayores de µm 2 ), aisladas y con una rel. N:C mayor de 1:16. El tratamiento con suero autólogo mejora de forma significativa el grado de metaplasia escamosa de los epitelios de la superficie ocular como demuestran varios estudios (3,16,18,20), aunque otros autores no encuentran diferencias estadísticamente significativas entre los pacientes tratados con suero autólogo y el grupo de pacientes tratados con solución fisiológica (5). Noble et al. refieren que el grado de metaplasia escamosa se redujo en el 50% de los casos estudiados, existiendo una mejoría significativa en el grupo tratado con suero autólogo respecto al grupo tratado con terapia convencional (3). Tsubota et al., en pacientes con síndrome de Sjögren tratados con colirio de suero autólogo durante un mes, observan una mejoría significativa en el grado de metaplasia escamosa y en la densidad de las células caliciformes (16). Alvarado et al., en pacientes con penfigoide ocular cicatricial y DEP, encuentran que el tratamiento con suero autólogo durante un mes mejoró el grado de metaplasia escamosa en el 87,5% de los pacientes. Sólo en un paciente con un grado muy avanzado de metaplasia escamosa, sin células caliciformes y un epitelio conjuntival queratinizado no se produjo mejoría alguna, mejorando en el resto de pacientes una media de entre 1 y 2 grados la metaplasia escamosa (18). En pacientes con queratopatía por aniridia, hemos observado que la metaplasia escamosa mejoró significativamente en todos los ojos tras dos meses de tratamiento con suero autólogo, si bien en los casos más graves persistieron las células caliciformes en la citología corneal (20) (figs. 9 y 10). La vitamina A parece ser el componente del suero autólogo más relacionado con la mejoría en el grado de metaplasia escamosa (16,18). Las células caliciformes son muy sensibles a la acción de la vitamina A que aumenta su número y tamaño. El efecto beneficioso sobre las células epiteliales viene determinado de una forma indirecta al estimular la producción de mucinas, sobre todo la MUC5AC, y reestablecer la fase mucínica de la película lagrimal mejorando la estabilidad de la lágrima y disminuyendo la formación de puntos secos. También el EGF parece mediar en la producción de mucinas y en la mejoría de la metaplasia escamosa que se produce en los pacientes tratados con suero autólogo.

10 94 7. Suero autólogo: efectos biológicos Fig. 9: Citología de impresión en pacientes tratados con suero autólogo. (A y B). Citología corneal. Mejoría de la metaplasia escamosa de las células epiteliales con disminución del tamaño celular, tinción eosinófila del citoplasma y disminución del número de células caliciformes (flechas) en un paciente con insuficiencia limbar grave. (C y D) Citología corneal. Disminución del tamaño celular y la relación núcleo-citoplasma tras el tratamiento con suero autólogo (D). (E y F) Citología conjuntival. Se aprecia una mejoría en la metaplasia escamosa de las células epiteliales y un aumento de las células caliciformes tras el tratamiento (F). EFECTOS SOBRE LA ESTABILIDAD DE LA PELÍCULA LAGRIMAL Fig. 10: Tamaño celular y relación núcleo citoplasma en pacientes con queratopatía por aniridia tratados con suero autólogo durante dos meses. La mejoría se produjo en todos los grados de gravedad de la enfermedad. La estabilidad de la película lagrimal puede verse amenazada por alteraciones cualitativas o cuantitativas de la lágrima o por situaciones que inducen una dinámica lagrimal inadecuada. Existe una marcada interrelación entre película lagrimal y epitelio. Por un lado el epitelio participa activamente en el mantenimiento de la estabilidad lagrimal y por otro lado, una película lagrimal adecuada es necesaria para la protección de la superficie epitelial. La característica más importante del ojo seco es la inestabilidad lagrimal que en la práctica clínica habitual se explora mediante BUT y la observación dinámica de la lágrima tras la instilación de fluoresceína (fig. 11). EFECTOS SOBRE EL TEST DE SCHIRMER Y EL TIEMPO DE RUPTURA DE LA PELÍCULA LAGRIMAL (BUT) En general el tratamiento con suero autólogo tiene pocos efectos sobre pruebas objetivas de producción de lágrima como el test de Schirmer. La mayoría de los autores no encuentran diferencias entre los valores del Schirmer y el BUT previos y posteriores al tratamiento (3,5,16,23). Kojima et al., en pacientes con ojo seco severo, refieren que el tratamiento con suero autólogo mejoró de forma significativa el BUT en comparación con lágrimas artificiales (13). En pacientes con aniridia, hemos encontrado que los niveles del BUT y Schirmer mejoraron tras dos meses de tratamiento con suero autólogo, aun-

11 7. Suero autólogo: efectos biológicos 95 Fig. 11: Estabilidad de la película lagrimal. (A) Fluorograma previo al tratamiento con suero autólogo. Se aprecia una marcada inestabilidad lagrimal con rápida ruptura de ésta tras el parpadeo. (B) Fluorograma del mismo paciente tras el tratamiento con suero autólogo. que esta mejoría sólo fue significativa en el caso del BUT (20). Resultados similares hemos obtenido en un estudio reciente en pacientes con síndrome de Sjögren tratados con suero autólogo en los que ambas pruebas mejoraron tras el tratamiento, pero sólo la mejoría del BUT presentó significación estadística (p=0,02) (resultados no publicados). El BUT es un test que mide la estabilidad de la película lagrimal, pero es inespecífico y se altera en muchos tipos de ojo seco (58). La mejoría del BUT se debe al efecto directo del suero autólogo sobre el epitelio y a que su acción sobre la producción de mucinas mejora la estabilidad lagrimal. EFECTOS SOBRE LA TINCIÓN CON ROSA DE BENGALA El rosa de bengala es un colorante vital químicamente relacionado con la fluoresceína, aunque presenta diferencias notables en cuanto a su capacidad de tinción (59). A nivel de la superficie ocular no tiñe las células sanas y sí aquellas que están muertas, degeneradas o desprovistas de la protección de mucina. Sin embargo, la captación del colorante por células sanas en cultivos celulares (60) induce a pensar que algunos componentes de la lágrima como la albúmina y la mucina pueden bloquear la captación de este colorante (61). La albúmina se liga a la molécula de rosa de bengala disminuyendo su disponibilidad y la mucina actúa como barrera a la difusión del colorante. Estos estudios demuestran que la capacidad del rosa de bengala para teñir las células viene definida, sobre todo, por el estado de protección que le brinda la película lagrimal más que por la vitalidad de las células epiteliales, lo que hace del rosa de bengala el colorante idóneo para determinar la capacidad protectora de la película lagrimal. Los efectos del suero autólogo sobre la tinción con rosa de bengala varían según los estudios consultados. Mientras algunos autores refieren una mejoría significativa en pacientes tratados con suero autólogo en relación a la terapia convencional con lágrimas artificiales (9,13,16), otros autores encuentran que esta mejoría no es significativa (3,5). Nosotros hemos observado una mejoría en la tinción con rosa de bengala en pacientes con queratopatía por aniridia y síndrome de Sjögren tratados con suero autólogo (20). Como ya hemos comentado, el suero autólogo parece tener un efecto directo sobre la expresión de mucinas, sobre todo MUC1 y MUC5AC, que sería responsable de la mejoría en la tinción con rosa de bengala que experimentan los pacientes. Por otro lado, la albúmina, una proteína muy abundante en el suero, podría contribuir a esa mejoría al disminuir la disponibilidad del colorante. Aunque químicamente la molécula de rosa de bengala es similar a la fluoresceína, en su composición hay más haluros que reducen su penetración tisular y aumenta su toxicidad. Normalmente se utiliza a una concentración del 1%, produciendo frecuentes molestias a nivel ocular que se pueden reducir mediante lavado con suero fisiológico tras la instilación, usando una concentración menor (0,5%) o utilizando previamente anestésico que no interfiere con la prueba. La intensidad de la tinción se cuantifica mediante la clasificación de Van Bijsterveld que divide la superficie ocular expuesta en tres áreas (córnea, conjuntiva bulbar lateral y conjuntiva bulbar

12 96 7. Suero autólogo: efectos biológicos medial) y según la tinción encontrada gradúa con tres cruces cada área para un total de 9 cruces. Una tinción superior a cuatro cruces se considera patológica (62). La luz aneritra intensifica la percepción de las áreas captadas por este colorante. EFECTOS SOBRE LA TINCIÓN CON FLUORESCEÍNA La fluoresceína sódica (C 20 H 10 Na 2 O 5 ) es un colorante vital fluorescente que pertenece a la familia de las xantinas. Es hidrosoluble y su color amarillo cambia a verde cuando se expone a la luz. Su máxima excitación ocurre con longitudes de onda de unos 490 nm (luz azul) y su emisión es de unos 520 nm (luz verde). La fluoresceína es el colorante vital más utilizado en la exploración de la superficie ocular, siendo ideal para poner de manifiesto procesos patológicos que cursan con ruptura de las uniones celulares y por tanto con pérdida de la función de barrera epitelial. Al contrario de lo que ocurre con el rosa de bengala, la fluoresceína se tolera muy bien por el paciente. Su máxima fluorescencia se produce con concentraciones de 0,08 g/l por lo que es aconsejable esperar entre 30 y 60 segundos tras su instilación para observar las áreas teñidas que se realzan si se observan con luz azul. En cuanto a los efectos del suero autólogo sobre la tinción con fluoresceína, la mayoría de los trabajos publicados encuentran una reducción tras el tratamiento (9,16). Kojima et al., en pacientes con ojo seco severo, observan una mejoría significativa en comparación con el grupo tratado con lágrimas artificiales con sólo dos semanas de tratamiento (13). Por el contrario, Tananuvat et al. no refieren diferencias significativas entre pacientes tratados con suero autólogo y pacientes tratados con solución salina (5). Nosotros hemos encontrado una mejoría en la tinción con fluoresceína en pacientes con queratopatía por aniridia y pacientes con síndrome de Sjögren tratados con suero autólogo (20). EFECTOS SOBRE LA SENSIBILIDAD CORNEAL Además de factores epiteliotróficos que promueven la reepitelización, el suero autólogo contiene factores neurotróficos que facilitan la regeneración de las terminaciones nerviosas corneales tras agresiones. Aunque no existen muchas referencias bibliográficas al respecto, Matsumoto et al., en pacientes con queratopatía neurotrófica, refieren que el tratamiento con suero autólogo mejora de forma significativa la sensibilidad corneal medida con el estesiómetro de Cochet-Bonnet (19). EFECTOS SOBRE LA NEOVASCULARIZACIÓN Y TRANSPARENCIA CORNEAL En general, el suero autólogo tiene escasos efectos sobre la neovascularización y la transparencia corneal, existiendo pocos estudios en la bibliografía referentes a estas acciones. En pacientes con queratopatía por aniridia hemos observado una mejoría de la neovascularización y transparencia corneal tras el tratamiento con suero autólogo, si bien ésta no resultó significativa y no ocurrió de forma homogénea dentro de los diferentes grupos en los que se distribuyeron los pacientes según la gravedad de la queratopatía (20). El efecto del suero autólogo sobre la transparencia corneal es indirecto al mejorar la estabilidad lagrimal y la viabilidad de las células del epitelio corneal, mejorando la función de barrera epitelial. En cuanto a sus efectos sobre la neovascularización, estos pueden ser indirectos, al disminuir la inflamación derivada de los defectos epiteliales y la alteración lagrimal, o directos al mejorar la función limbar aportando factores de crecimiento (fig. 12). EFECTOS BACTERICIDAS El suero autólogo tiene un importante efecto beneficioso en la prevención de enfermedades infecciosas de la superficie ocular, mejorando los sistemas de barrera y actuando directamente sobre los gérmenes o sobre sus mecanismos de invasión. Como hemos visto en los apartados anteriores, el suero autólogo mejora la estabilidad y calidad de la película lagrimal, y la integridad epitelial de la superficie ocular. La película lagrimal constituye una importante limitación a la invasión de microorganismos por un efecto de dilución y barrido mecánico de los gérmenes y sus toxinas (capítulo 5). Por otro lado, la integridad epitelial supone una importante barrera defensiva frente a la infección por agentes patógenos. El mantenimiento de las características estructurales de las células epiteliales y de sus uniones intercelulares y con la membrana basal son de vital importancia para preservar esta función de barrera, hasta el punto de que muy pocos gérmenes (gonococo, meningococo, corynebacterium diphtheriae y

13 7. Suero autólogo: efectos biológicos 97 Fig. 12: Efectos sobre la neovascularización y transparencia corneal en un paciente con queratopatía por aniridia (A) tras dos meses de tratamiento con suero autólogo (B). (C) Paciente con degeneración marginal de Terrien en el que tras un mes de tratamiento con suero autólogo se aprecia una regresión franca de la neovascularización (D). haemophilus spp) son capaces de causar infecciones de la superficie ocular con un epitelio íntegro. El resto de microorganismos precisan alteraciones de la barrera epitelial que faciliten su adherencia. Muchas bacterias expresan unas proteínas, denominadas «adhesinas», que se unen con alta afinidad a moléculas de la superficie celular del huésped. Así por ejemplo, Cándida spp. expresa unas proteínas de superficie que imitan a las integrinas, mientras que algunos virus tienen proteínas de superficie que se unen a moléculas como el heparán sulfato o el ácido siálico (63). La capa de mucina de la película lagrimal inhibe la capacidad de muchos patógenos para unirse al epitelio corneal y, como hemos comentado en un apartado anterior, el suero autólogo mejora la expresión de mucinas por las células epiteliales de la superficie ocular. Por otro lado, el suero contiene abundantes componentes que van a actuar directamente sobre los agentes patógenos o sobre sus mecanismos de invasión (4,16). La lisozima degrada los mucopéptidos de las paredes celulares bacterianas hidrolizando enlaces glucosídicos sobre todo de bacterias Gram+, actuando además como opsonina que promueve la fagocitosis por macrófagos. La lactoferrina se une a iones de hierro esenciales para la función de varias enzimas implicadas en el metabolismo bacteriano (63). Las inmunoglobulinas y los factores del complemento participan en la inmunidad humoral. Las primeras, sobre todo la IgA, tienen gran importancia al actuar

14 98 7. Suero autólogo: efectos biológicos como defensa inicial contra patógenos impidiendo que estos microorganismos atraviesen las mucosas, mientras que el complemento, a través del complejo de ataque a las membranas, es el responsable de la formación de canales hidrofílicos en las paredes celulares que provocan la muerte osmótica del agente patógeno (64). El complemento es especialmente importante frente a gérmenes Gram, siendo las bacterias Gram+ más resistentes a su acción. Por otro lado, sustancias como la α2 macroglobulina tienen acción anticolagenasa neutralizando enzimas proteolíticas como colagenasas, elastasas y proteasas producidas por algunos microorganismos para inducir la lisis de la matriz extracelular y facilitar su invasión. Agradecimientos: Queremos agradecer a los Dres. Matilde Murga y Óscar Fernández «del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas de Madrid (CNIO)» y al Dr. Carlos Paino «del Instituto de Investigación Ramón y Cajal» su dedicación e inestimable ayuda en la realización de los estudios en cultivos celulares. BIBLIOGRAFÍA 1. López-García JS, García-Lozano I, Rivas L, et al. Aplicaciones del suero autólogo en Oftalmología. Arch Soc Esp Oftalmo. 2007; 82: Lagnado R, King AJ, Donald F, et al. A protocol for low contamination risk of autologous serum drops in the management of ocular surface disorders. Br J Ophthalmol. 2004; 88: Noble BA, Loh RS, MacLennan S, Pesudovs K, Reynols A, Bridges LR, et al. Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease. Br J Ophthalmol. 2004; 88: Geerling G, Maclennan S, Hartwig D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Br J Ophthalmol. 2004; 88: Tananuvat N, Daniell M, Sullivan LJ, et al. 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15 7. Suero autólogo: efectos biológicos 99 tion and cytotoxicity. J Immunol Methods. 1993; 160: Liu L, Hartwig D, Harloff S, et al. An optimised protocol for the production of autologous serum eyedrops. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2005; 243: Harloff S, Hartwig D, Kasper K, et al. Epitheliotrophic capacity of serum eye drops from healthy donors versus serum from immunosuppressed patients with rheumatoid arthritis. Klin Monbl Augenheilkd. 2008; 225: Harwig D, Harloff S, Liu L, et al. Epitheliotrophic capacity of a growth factor preparation produced from platelet concentrates on corneal epithelial cells: a potential agent for the treatment of ocular surface defects?. Transfusion. 2004; 44: Terson A. notes sur les glandes acineuses de la conjonctive et sur les glandes lacrymales orbitopalpébrales. Arch Ophtalmol (Paris). 1892; 12: Nichols BA, Chiappino ML, Dawson CR. Demonstration of the mucous layer of the tear film by electron microscopy. 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