Represión epigenética de tumores por BRCA1

Transcripción

1 Represión epigenética de tumores por BRCA1 Elsa Cortés Montero Grado en Biología

2 Represión epigenética de tumores por BRCA1 1. Introducción Brca1 fue el primer gen que se descubrió asociado al cáncer de mama hereditario, y posteriormente se ha demostrado que su mutación predispone a sufrir cáncer de mama y de ovario. Se han encontrado mutaciones inactivantes de este gen supresor de tumores en la línea germinal en aproximadamente el 40% de familias con múltiples casos de cáncer de mama (Velkova, A. y Monteiro, A., 2011). Venkitaraman (2009) sostiene que tanto la inestabilidad de la estructura como del número cromosómico provocada por la inactivación de los genes Brca1 y Brca2 es consecuencia de las distintas funciones de los productos de dichos genes en la reparación del ADN o mitosis; explicándose muchas características de la patogénesis del cáncer y con importantes implicaciones para el tratamiento. BRCA1 está implicada en un gran número de procesos celulares, destacando la reparación del ADN dañado, la regulación de la transcripción y el control del ciclo de división celular, entre otras funciones. En este sentido, deficiencias en BRCA1 causa anomalías en los checkpoints de la fase S, de G 2 /M, del huso mitótico y en la duplicación centrosómica. Además, la inestabilidad genética causada por la deficiencia de BRCA1 provoca respuestas celulares a daño en el ADN que bloquean la proliferación e inducen la apoptosis (Figura 1). Por lo tanto, células mutantes en Brca1 no pueden proliferar en tumores maduros a menos que esta defensa celular desaparezca. (Deng, C.X., 2006) Figura 1: Modelo que ilustra las conexiones entre los checkpoints del ciclo celular, la duplicación del centrosoma, la reparación del ADN dañado, la inestabilidad genética, la respuesta al daño en el ADN, las anomalías de desarrollo y la tumorogénesis, todas ellas causadas por deficiencia en BRCA1. (Deng, C.X., 2006) 2

3 La proteína BRCA1 tiene dos dominios funcionales distintos. El dominio RING N-terminal se une a BARD1 (BRCA1-associated RING domain-1 protein) formándose un heterodímero que tiene actividad ubiquitina ligasa E3. Mutaciones sin sentido en BRCA1, que han sido asociadas a cáncer, inactivan la actividad ubiquitina ligasa. Los resultados obtenidos por Morris (2006) muestran el posible papel de la actividad ubiquitina ligasa de BRCA1 en la supresión de tumores. Por otro lado, el dominio C-terminal BRCT es esencial tanto para la regulación transcripcional como para la función de reparación de ADN con rotura en doble banda (DSBR). BRCT puede actuar como dominio de activación transcripcional al unirse a una secuencia específica del DNA, regulándose la expresión de diversos genes como p21 y GADD45, y modulando la actividad de otros factores de transcripción como p53 y ER (Lee, M.S., et al, 2010). Además, tras fosforilación por ATM, ATR, Aurora A y quinasa Cdk2, BRCA1 es capaz de localizar el sitio dañado en el ADN. Por estas razones, las mutaciones en BRCA1 se asocian con un riesgo significativamente mayor de desarrollar cáncer de mama y de ovario (Chang, S. et al, 2011). El estudio etiopatogénico realizado por Chang (2011) de las variantes de incierto significado clínico de BRCA1 brinda la oportunidad de descubrir otras funciones de esta proteína. Por esta razón, se estudió la variante R1699Q de BRCA1, calificada de riesgo moderado, que tiene un punto de mutación en el dominio BRCT (ex.18: c.5095g> A, p.r1699q), previéndose que la Arg1699 sea crítica para la formación de enlaces de hidrógeno con la DNA helicasa BACH. El mutante R1699Q no desestabiliza completamente la interacción fosfopéptido, pero puede causar la pérdida de fosfoespecificidad. R1699Q se ha asociado con la predisposición al cáncer de mama, pero el riesgo exacto es desconocido. En la investigación llevada a cabo por el equipo de Chang, se parte de que la variante R1699Q no afecta a la estabilidad genómica ni causa anomalías aparentes en el ciclo celular. Sin embargo, las células madre embrionarias R1699Q experimentan diferenciación por un aumento notable de un microrna oncogénicos, mir-155. En los seres humanos, mir-155 se transcribe a partir del gen MIR155HG (abreviado como MIR-155) que codifica para un ARN no codificante y es un sitio de inserción proviral del virus de la leucosis aviar. mir-155 está involucrado en la apoptosis y/o respuesta proliferativa y contribuye al desarrollo tumoral. En este sentido, esta investigación demuestra el papel, hasta ahora desconocido, de BRCA1 en el control epigenético de mir

4 2. Datos experimentales a) Efecto de la variante R1699Q en la supervivencia y diferenciación de las células madre embrionarias Al realizar un ensayo con células madre embrionarias de ratón para examinar la relevancia funcional de 13 variantes de BRCA1, se confirma la naturaleza deletérea de la variante R1699Q de BRCA1 al no poder contrarrestar la letalidad de células nulas para Brca1 (Figura 2b). Además, se observa una supervivencia 10 veces menor en las células que expresan R1699Q BRCA1-Brca1 ko/ko con respecto a las células con los alelos salvajes para Brca1. En este ensayo se clonan diferentes variantes del gen humano Brca1, entre ellas R1699Q, utilizando como vectores cromosomas bacterianos artificiales (BAC) (Figura 2a). El transgén BRCA1 introducido en el BAC complementaría la pérdida del gen endógeno Brca1 en las células troncales embrionarias de ratón que contienen un alelo condicional de Brca1. Para determinar el efecto de la mutación R1699Q se diferencian las células madre embrionarias en cuerpos embrioides que representan un modelo in vitro de la embriogénesis temprana (Figura 2c). Los datos obtenidos (no mostrados) apoyan la hipótesis de que las células con R1699Q son propensas a la diferenciación espontánea, lo que explicaría su menor supervivencia. Las células madre embrionarias R1699Q no presentan anomalías significativos en la sensibilidad a agentes dañinos del ADN, en el crecimiento celular o en la estabilidad del genoma. Figura 2: a) Esquemas de la generación de células madre embrionarias usando células R1699Q PL2F8 que contienen un alelo nulo y otro condicional del gen Brca1. Dos mitades de minigenes humanos HPRT1 (HP y RT) que flanquean los dos sitios loxp (triángulos sombreados) del alelo condicional. Los recombinantes Cre son HAT resistentes (HAT R ). b) Hibridación Southern de colonias HAT R de experimentos sin BAC (NO BAC), de tipo salvaje (WT) BAC BRCA1 y R1699Q BRCA1 BAC. Banda inferior, el alelo nulo (MT), banda superior, el alelo condicional (cko). Tasa de rescate, porcentaje de clones Brca1 ko/ko. c) Cuerpos embrionarios generados a partir de células madre embrionarias expresando el alelo de tipo salvaje (izquierda) de Brca1 y R1699Q (derecha). 4

5 b) mir-155 está sobreexpresado en células mutantes R1699Q y en células deficientes en BRCA1 Se comparan cuerpos embrioides procedentes de células madre embrionarias que expresan R1699Q BRCA1 con cuerpos embrioides generados a partir de células que expresan M1652I BRCA1, una variante neutral del BRCA1 que es funcionalmente indistinguible del alelo salvaje de BRCA1. Se observa un aumento notable (más del doble) de la regulación del mir-155 en células R1699Q mediante la técnica de PCR a tiempo real (RT-PCR) (Figura 3a). Además, la hibridación in situ muestra un aumento de la expresión de mir-155 hasta 40 veces mayor en células R1699Q (Figura 3b), al utilizar el antisense LNA de mir-155. Figura 3: a) Cuantificación de la expresión de mir-155 en wild-type (WT), R1699Q (RQ) y M1652I (MI) en células madre embrionarias (ES cells) y en células de cuerpos embrioides (EB cells) por RT-PCR. Arriba, la expresión de la proteína BRCA1. b) Hibridación in situ de mir-155 en cuerpos embrioides de fenotipo salvaje (WT) y R1699Q. Estos resultados sugieren que BRCA1 controla la expresión de mir-155 y para ello se mide la expresión de este microrna en tumores procedentes de ratones que tienen los alelos knock-out de Brca1 y Trp53 en el mismo cromosoma, comprobándose una sobreexpresión de entre 30 y 180 veces mayor de mir-155 al compararse con tejidos normales. El aumento de la expresión de mir-155 es nulo cuando se conserva el alelo salvaje de Brca1. Por tanto, la pérdida del alelo salvaje de Brca1 es necesaria para la sobreexpresión de mir-155. Por último, tumores con la mutación R1699Q también expresan un aumento de mir-155 pero de menor magnitud. Para comprobar si la desregulación de mir-155 es específica de R1699Q o si se produce por la pérdida completa de BRCA1, se expresa de forma transitoria BRCA1 salvaje y R1699Q en líneas celulares de tumores de mama deficientes en BRCA1. Sólo hay una reducción significativa en la expresión de mir-155 con el alelo salvaje de BRCA1 (Figura 4). Por tanto, BRCA1 controla negativamente mir- 155 y la pérdida de función de BRCA1 conlleva el aumento de Figura 4: resultados de RT- PCR de mir-155. Arriba: expresión de BRCA1 wt y R1699Q. 5

6 expresión de mir-155. c) BRCA1 reprime epigenéticamente el promotor de mir-155 En cuerpos embrioides R1699Q hay tres veces más de transcrito primario del gen mir-155 (primirna-155) que en cuerpos embrioides salvajes (Figura 5), sin observarse una alteración del procesamiento del pri-mir-155 hasta su forma madura. Esto indica que BRCA1 controla la expresión de mir-155 a nivel de transcripción. Mediante análisis de secuencia se comprueba que el promotor de mir-155 consta de dos regiones donde se podría unir BRCA1 (BRCA1-1 y BRCA1-2). Un análisis de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para estas dos regiones del promotor revela que BRCA1 se une a la región BRCA1-2 (Figura 6). Figura 5: crecimiento de células tumorales Figura 6: unión de BRCA1 a las potenciales regiones BRCA1-1 y BRCA1-2 del promotor de mir-155 Para confirmar esta interacción y examinar su efecto en la regulación de mir-155 se muta la región BRCA1-2, que consta, a su vez, de dos subregiones, Mut-1 y Mut-2, separadas por 58 pares de bases. Los mutantes en una de las dos regiones (Mut-1 o Mut-2) muestran activación del promotor de mir-155 mientras que no se observa efecto aditivo en el doble mutante (Figura 7). Esto se mide con un ensayo de luciferasa, en el que las células son transfectadas con un plásmido que consta del gen mir-155 y del gen de la luciferasa como gen reportero. Figura 7: efecto de las mutaciones en Mut-1, Mut-2 o doble mutante en la activación del promotor mir-155 6

7 La unión de R1699Q al promotor mir-155 es similar a la de la proteína salvaje BRCA1, por lo que el anómalo efecto de R1699Q puede deberse al reclutamiento que podría llevar a cabo BRCA1 de otros represores transcripcionales hacia el promotor. De este modo, la variante no funcional R1699Q no establecería la interacción con los otros represores, con la consecuente activación del promotor mir-155. BRCA1 se asocia con el complejo de deacetilación de histonas (HDAC). Al tratar células con el alelo salvaje de Brca1 (células BRCA1+) con inhibidores de HDAC (apidicina, M344 y TSA), se observa un aumento en la expresión mir-155. Sin embargo, células deficientes en BRCA1 no muestran un aumento de la expresión de mir-155 al tratarlas con inhibidores para HDAC (Figura 8). Además, los promotores con las regiones de unión a BRCA1 mutadas disminuyen su activación tras un tratamiento con inhibidores de HDAC (Figura 9). Esto indicaría que el promotor mir-155 está controlado epigenéticamente y en esta regulación está involucrado BRCA1, de forma que dicha regulación desaparece al eliminarse BRCA1. Figura 8: efecto de los inhibidores de HDAC en la expresión de mir-155 medido por RT- PCR en células BRCA1+ (izq) y BRCA1 deficientes (dcha). Figura 9: efecto de los inhibidores de HDAC en la activación del promotor salvaje de mir-155 (izq) y del promotor mutado (dcha) medido por un ensayo de luciferasa. Mediante ChIP y utilizando anticuerpos que reconocen histonas acetiladas se estudia si BRCA1 afecta a la acetilación de una o varias histonas en el promotor de mir-155, lo que podría provocar la activación o el silenciamiento del gen. Con este ensayo se revela que las histonas H2A y H3 aparecen más acetiladas en células deficientes en BRCA1 que en células normales; esta mayor acetilación también se observa en células de cuerpos embrioides R1699Q. Por otro lado, hay una menor acetilación de H2A y H3 cuando se expresa BRCA1 en células deficientes en esta proteína, mientras que la sobreexpresión de R1699Q en las mismas células no tiene tal efecto (Figura 10). Todo ello indica que BRCA1 es la responsable de los cambios en la acetilación de estas histonas, de modo que BRCA1 controla negativamente el promotor mir-155 al disminuir la acetilación de H2A y H3. 7

8 Figura 10: Efecto de BRCA1 salvaje (WT), RQ y RQ+BRCA1 WT en la acetilación de las histonas H2A y H3 del promotor mir-155 en células deficientes en BRCA1. Medido por ChIP y RT-PCR. Western blot (WB) de la expresión de la proteína ectópica utilizando como anticuerpo la hemaglutinina (HA). Al hacer experimentos de coinmunoprecipitación, se obtiene que BRAC1 wild-type interacciona con HDAC2, que a su vez se asocia específicamente con el promotor de mir-155; R1699Q BRCA1 no interacciona con HDAC2 (Figura 11). Figura 11: coinmunoprecipitación de HDAC2 con BRCA1 wild-type o R1699Q BRCA1. Paneles de arriba: inmunoprecipitación con anticuerpo para HDAC2. Paneles de abajo: inmunoprecipitación con anticuerpo para BRCA1. Se transfectan construcciones que contienen el promotor mir-155 salvaje o el promotor mutado de ratón (Mut1, Mut2 y doble mutante) en células humanas BRCA1+, encontrándose que el promotor no mutado se asocia con BRCA1 y HDAC2, lo que conlleva a una menor acetilación de H2A y H3, mientras que el promotor doblemente mutado no recluta el complejo BRCA1- HDAC2, y por tanto, se observa un aumento de la acetilación de H2A y H3. De este modo, se confirma que la proteína salvaje BRCA1 recluta HDAC2 hasta el promotor mir-155 donde deacetila las histonas H2A y H3. Con este experimento también se revela que la asociación entre el complejo BRCA1-HDAC2 y el promotor humano endógeno mir-155 se reduce por la presencia de un promotor no mutado exógeno mir-155 de ratón; hay competición por el complejo BRCA1-HDAC2. 8

9 d) Efecto de mir-155 en tumorogénesis y su sobreexpresión en tumores de mama mutantes para BRCA1 Se inyectan células que expresan mir-155 en tumores, resultando en un aumento del crecimiento del tumor. Por último, se analiza la correlación entre el estado de BRCA1 y la expresión de mir-155 en cáncer de mama en humanos. Se muestra que hay una correlación significativa entre la pérdida de BRCA1 y la sobreexpresión de mir-155 (Figura 12), de tal forma que mir-155 tiene una expresión 6 veces mayor en tumores BRCA1- que en tumores BRCA1+. Con estos resultados se puede concluir que la sobreexpresión de mir-155 se correlación con la mutación de BRCA1 en tumores de mama humanos. Figura 12: a) BRCA1 salvaje forma un complejo con HDAC2 y se une al promotor mir-155, lo que reduce la acetilación de las histonas de este promotor y la consiguiente expresión de mirna-155. b) Un alelo salvaje BRCA1 es suficiente para mantener inhibida la expresión de mir-155, a pesar de la existencia de un alelo BRCA1 mutado. c) La presencia de dos alelos BRCA1 mutados impide la formación del complejo BRCA1-HDAC2 en el promotor mir- 155, acetilándose las histonas, lo que favorece la expresión de mirna-155. d) mirna-155 contribuye a la transformación y al desarrollo tumoral. 3. Conclusiones Con esta investigación se ha confirmado que la variante R1699Q de BRCA1 no impide la reparación del ADN dañado pero sí inhibe la represión sobre mir-155. BRCA1 reprime epigenéticamente la expresión de mir-155 a través de su asociación con HDAC2, que desacetila histonas H2A y H3 en el promotor de mir-155. Se demuestra que la sobreexpresión de mir-155 acelera, mientras que la caída de mir-155 atenúa, el crecimiento de líneas celulares tumorales in 9

10 vivo. Estos resultados demuestran un nuevo modo de supresión tumoral por BRCA1 y sugieren a mir-155 como una posible diana terapéutica para los tumores BRCA1 deficientes. Sin embargo, el estudio llevado a cabo por el equipo de Chang también deja abiertas algunas cuestiones, como por ejemplo si la sobreexpresión de mir-155 es suficiente para causar cáncer en humanos o si es necesaria la mutación de otros genes. También habría que analizar si BRCA1 actúa por diferentes mecanismos o sólo por esta vía en el cáncer. Por último, se deberían estudiar las repercursiones de esta investigación en enfermos de cáncer, y si habría alguna manera de traducir estos avances científicos en avances terapeúticos. Bibliografía Chang, S. et al (2011). Tumor suppressor BRCA1 epigenetically controls oncogenic microrna-155. Nat. Med. 17, Deng C.X. (2006). BRCA1: cell cycle checkpoint, genetic instability, DNA damage response and cancer evolution. Nucleic Acids Res. 34, Lee, M.S. et al (2010). Comprehensive Analysis of Missense Variations in the BRCT Domain of BRCA1 by Structural and Functional Assays. Cancer Res. 70, Morris, J.R. et al (2006). Genetic analysis of BRCA1 ubiquitin ligase activity and its relationship to breast cancer susceptibility. Hum. Mol. Genet. 15, Velkova, A. & Monteiro, A. N. A. (2011). Epigenetic tumor suppression by BRCA1. Nat. Med. 17, Venkitaraman A.R. (2009). Linking the cellular functions of BRCA genes to cancer pathogenesis and treatment. Annu. Rev. Pathol. 4,