Proteínas: funciones generales

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1 Proteínas: Proteínas: Relación Relación Estructura Estructura -- Función Función Macromoléculas proteicas Funciones genéricas Proteínas fibrosas Estructura general: fibras Queratinas Propiedades fisico-químicas Ácido-base Solubilidad Colágeno Proteínas de membrana Unión Reactividad química Estructura general Topología de membrana Inserción en la membrana Proteínas globulares: Hemoglobina Estructura de Mioglobina y Hemoglobina Curvas de unión de O2: transporte Cambio conformacional y cooperatividad Hemoglobinas mutadas: A. falciforme Para Enrique Castro Los trabajos de terceros retienen su licencia original Proteínas: funciones generales Proteínas: funciones generales Fosforilasa Prot. Quinasas DNA-, RNA-polimerasas Enzimas Metabolismo Señalización Expresión génica Actina, Queratinas,Tubulina Distrofinas Colágeno Estructural Citoesqueleto Orgánulos, membranas Matriz extracelular Transporte Intracelular Extracelular Importinas/ exportinas Hemoglobina Albúmina sérica Almacenamiento Ligandos unidos Proteína Ferritina Ovoalbúmina Catálisis Cinesinas Dinamina Miosinas interacciones macromoleculares Motores moleculares Transporte intracelular Movimiento celular Regulación Señalización control génico Defensa Sistema inmune unión de ligandos Receptores GPCR Factores de transcripción Factores MHC Inmunoglobulinas 2

2 Propiedades de las proteínas Propiedades de las proteínas Propiedades: Espectroscópicas: absorción a 280 nm (W,Y) (W es fluorescente) 212 nm (peptídico) Ácido-base: anfóteras carga neta depende del ph Solubilidad: solubles en agua Precipitan por: tricloroacético HClO4 insolubles en solventes orgánicos dependencia de ph e I Estabilidad: desnaturalización por calor hidrólisis Etanol, cloroformo Nelson & Cox, 4ª Ed, p. 80 Reconocimiento: Reacción del Biuret Reacción xantoproteica 3 Dadores y aceptores de pdh en proteínas Dadores y aceptores de pdh en proteínas 4

3 Proteínas: propiedades ácido base Proteínas: propiedades ácido base Anfóteras Grupos ácidos y grupos básicos Carga depende del ph Punto isoeléctrico Curva de titulación de hemoglobina 75 Equivalentes añadidos ph al cual carga=0 positiva ácido 50 pi= Carga neta base Negativa 2 ph 4 6 <pi Carga neta 8 ph >pi ph Carga neta 5 Proteínas: grupos ionizables Proteínas: grupos ionizables - ph = pk a log [A ] [ HA] Berg, Tymoczko, Stryer 6ª Ed. p. 33 6

4 Proteínas: Solubilidad y ph Proteínas: Solubilidad y ph Solubilidad (mg/ml) de la β-lactoglobulina repulsión repulsión ph<pi carga neta ph>pi carga neta - ph Precipitación isoeléctrica: Solubilidad mínima a ph=pi ph=pi carga neta 0 No repulsión de largo alcance posibilita interacciones locales Puentes salinos e interacciones hidrófobas (van der Waals) 7 Salting-in Enrique Castro, 2003 Aumento de solubilidad con I I, adición de sal Fuerza iónica, I Salting-out Disminución de solubilidad con I I, adición de sal no desnaturalizante reversible fácil y barata Precipitación por salado: Atmósfera iónica impide interacciones macromoleculares directas Log(solubilidad) Proteínas: Solubilidad y fuerza iónica Proteínas: Solubilidad y fuerza iónica Exceso de sal secuestra agua de hidratación de las macromoléculas 8

5 Proteínas : estabilidad y desnaturalización Proteínas : estabilidad y desnaturalización Desnaturalización Pérdida de estructura 3D nativa = desplegamiento Sin rotura de Enlaces covalentes Cooperativa Irreversible (salvo condiciones controladas) Proteínas desnaturalizadas Cadenas desplegadas y entrelazadas Transición rápida: Cooperatividad Tm Desnaturalizantes Calor (todos, pdh) Extremos de ph (ionización, salinos, pdh) solventes orgánicos efecto hidrofóbico detergentes caotrópicos (urea, guanidinio Cl) (pdh) 9 Proteínas: Unión y reactividad Proteínas: Unión y reactividad Ligando Unión estereospecífica Unión a ligandos Unión proteína-proteína Unión a otras macromoléculas Enrique Castro, enlaces 2003 débiles: superficies complementarias Por Superficies complementarias Proteína de unión interacción superficial estereospecífica péptido HIV Inmunoglobulina Interacción antígeno-anticuerpo Interacción macromolecular: actina-misosina muscular Reactividad química Catálisis: Enzimas 10

6 Proteínas: Relación Estructura Función Proteínas: Relación Estructura Función Macromoléculas proteicas Funciones genéricas Proteínas fibrosas Estructura general: fibras Queratinas Propiedades fisico-químicas Ácido-base Solubilidad Colágeno Proteínas de membrana Unión Reactividad química Estructura general Topología de membrana Inserción en la membrana Proteínas globulares: Hemoglobina Estructura de Mioglobina y Hemoglobina Curvas de unión de O2: transporte Cambio conformacional y cooperatividad Hemoglobinas mutadas: A. falciforme 11 Estructura tridimensional: prot. de membrana Estructura tridimensional: prot. de membrana Glicosilación secuencias específicas extracelular Extracelular Globular Uno o varios dominios Glicoforina de eritrocitos Proteína integral de membrana Blucle insertado ida y vuelta aa cargados apareados ~5.0 nm Hélice transmembrana aa apolares aa (3-4 nm) Intracelular Globular Uno o varios dominios Terminador aa básicos (carga ) Unión a fosfolípidos ( ) 12

7 Identificación transmembrana: Perfil de hidropatía Identificación transmembrana: Perfil de hidropatía N C Ventana 20 aa Ventana 20 aa 30 Å aa 6-7 vueltas α-hélice 13 Topología de proteínas transmembrana Topología de proteínas transmembrana Un único segmento TM; N extracelular Un único segmento TM; C extracelular Múltiples segmentos TM Múltiples segmentos TM En diferentes cadenas Canal único Sin segmentos TM; Anclajes covalentes Ambos Con segmentos TM y Anclajes covalentes 14

8 Inserción de proteínas de membrana Inserción de proteínas de membrana Señales topogénicas secuencia señal N-terminal secuencia señal interna secuencia de parada de transferencia secuencia señal: parada de transferencia: Básico hidrófobos hidrófobos (transmembrana) 15 Topología transmembrana y señales de inserción Topología transmembrana y señales de inserción 6 señal internas 6 stop internos señal N-terminal 1 stop interno 1 señal N-terminal 3 señal internas 3 stop internos señal interna 1 stop interno 16

9 Prot. Periféricas: Anclajes lipídicos a la membrana Prot. Periféricas: Anclajes lipídicos a la membrana 17 Proteínas: Relación Estructura Función Proteínas: Relación Estructura Función Macromoléculas proteicas Funciones genéricas Propiedades fisico-químicas Ácido-base Solubilidad Unión Reactividad química Proteínas fibrosas Estructura general: fibras Queratinas Colágeno Proteínas de membrana Estructura general Topología de membrana Inserción en la membrana Proteínas globulares: Hemoglobina Estructura de Mioglobina y Hemoglobina Curvas de unión de O2: transporte Cambio conformacional y cooperatividad Hemoglobinas mutadas: A. falciforme 18

10 Estructura tridimensional: Prot. Fibrosas Estructura tridimensional: Prot. Fibrosas Características estructurales Cadena polipetídica extendida en un eje axial Secuencias cortas repetitivas Interacciones laterales: asociación en fibras Resistencia mecánica a tensión/contracción axial Insolubles: estructuras sólidos Función estructural (citoesqueleto, matriz extracelular) Familia de Filamentos intermedios intracelulares Tipos Familia de Colágeno Matriz extracelular 19 Proteínas fibrosas: Composición en aa Proteínas fibrosas: Composición en aa -queratina: alifáticos>20% Mattews, vanholde & Ahern 3ªEd (2002). Tabla

11 Proteínas Fibrosas: queratinas Proteínas Fibrosas: queratinas -queratinas Unidad básica: hélice enrollada (coiled coil) Rica aa alifáticos y Cys Interacciones laterales: asociación en fibras Entrecruzamiento por HSP (ricas en S) Secuencias espaciadoras (8-18aa) D. N-Terminal variable globular D. C-Terminal variable globular Interacciones hidrofóbicas entre heptadas unen las hélices D. Central conservado 314 aa helicoidal (coiled coil levógiro) repetición (a-b-c-d-e-f-g-) n a,d hidrófobos) -hélice aa apolares cada 4, 7 Arrollamiento levógiro de dos -hélices (coiled coil, hélice enrollada) 21 Familia de Filamentos Intermedios Familia de Filamentos Intermedios Lodish et al. (2000) 4ª Ed 22

12 queratinas: ensamblaje de IF queratinas: ensamblaje de IF Dom. N-terminal y espaciadores esenciales en dimerización Dímero coiled-coil paralelo Tetrámero antiparalelo (simétrico) asociación cabeza-cola de tetrámeros 2-3 nm asociación lateral de protofilamentos asociación helicoidal (levógira) de 4 de protofibrillas 10 nm 23 queratinas queratinas Fibroína de seda Secuencia repetitiva (Gly-Ala)n Unidad básica: láminas apiladas Enrique Resistente Castro, 2003 axial, flexible lateral Puentes de hidrógeno interhebra Ala gran resistencia tensil Gly flexible (vdw) interacciones de van der Waals Seda de araña Mezcla zonas amorfas/cristalinas 24

13 Proteínas Fibrosas: Colágeno Proteínas Fibrosas: Colágeno Características Tres cadenas similares (2 1:1 2) 1050 aa cada una Composición aa especial 35% Gly, 20-25% Pro/Hyp aa modificados (Hyp, HO-Lys) Secuencia repetitiva (Gly-X-Y)n -(G-X-Y)n- X: usualmente Pro Y: frecuente Hyp Tropocolágeno 3 cadenas/triple hélice Mr 285 kda 300 nm largo 1,4 nm diámetro 25 Colágeno: aa modificados Colágeno: aa modificados 4-HO-Pro (Hyp) fuerza C -endo posición Y 3-HO-Pro / 5-HO-Pro PdH vía agua 5-HO-Lys (Hyp) Glicosilación (ensamblaje triple hélice) Enlaces cruzados (aldol): Fibras 26

14 Triple hélice de colágeno: estructura y estabilidad Triple hélice de colágeno: estructura y estabilidad Hélice de colágeno =-54º =155º levógira aa por vuelta: 3,2 avance por aa : 0,29 nm Gly en rojo 3er aa hacia el interior sólo Gly (no R) mutado en OI, EDS Restricciones estéricas ángulo prefijado Pro pirrolidina hacia fuera (repulsión estérica) Y: C -endo 3,3 aa 0,95 nm Arrollamiento no separable hélice levógira superhélice dextrógira triple hélice dextrógira Secuencia Gly-X-Y No compatible -hélice No compatible -lamina pdh intercatenarios Gly-NH O=C (otra cadena) trans-axiales 27 Función de 4 hidroxi Pro (Hyp) Función de 4 hidroxi Pro (Hyp) Prolil-4-hidroxilasa O2 tetrámero 2 2 = PDI Fe(II) como cofactor consume ascorbato CO2 Escorbuto Ascorbato (Vitamina C) Hyp congelada en conformación hélice (efecto estereoelectrónico) Hyp estabiliza triple hélice Deshidroascorbato 28

15 Tipos de colágeno Tipos de colágeno 29 Fibras de colágeno Fibras de colágeno Ensamblaje alineamiento cabeza-cola Hueco nm (1/4-1/5) >50 nm diámetro Puentes cruzados HO-Lys N-terminal C-terminal tridimensional 30

16 Hyl: Puentes cruzados Hyl: Puentes cruzados 31 Biosíntesis de colágeno Biosíntesis de colágeno HO-Lys: esencial para ensamblaje de triple hélice HO-Lys: esencial para ensamblaje de fibras 32

17 Fibras elásticas Fibras elásticas Elastina Rica en Gly (30%), Ala, Val Ovillo aleatorio: extensible Entrecruzada: desmosina puentes cruzados desmosinas (4 Lys) 33 Proteínas: Proteínas: Relación Relación Estructura Estructura -- Función Función Macromoléculas proteicas Funciones genéricas Propiedades fisico-químicas Ácido-base Solubilidad Unión Reactividad química Proteínas fibrosas Estructura general: fibras Queratinas Colágeno Proteínas de membrana Estructura general Topología de membrana Inserción en la membrana Proteínas globulares: Hemoglobina Estructura de Mioglobina y Hemoglobina Curvas de unión de O2: transporte Cambio conformacional y cooperatividad Hemoglobinas mutadas: A. falciforme 34

18 Equivalencia estructural de las globinas Equivalencia estructural de las globinas 35 Protoporfirinas y Hemo Protoporfirinas y Hemo 36

19 Estructura genérica de la globina Estructura genérica de la globina 37 Homología secuencial en las globinas Homología secuencial en las globinas 38

20 Unión del hemo a la globina Unión del hemo a la globina Impedimento estérico 39 Unión del O Unión del O2 2 (1) (1) 40

21 Unión del O Unión del O2 2 (2) (2) 41 Dinámica molecular de la unión de O Dinámica molecular de la unión de O2 2 42

22 Curva de unión de O Curva de unión de O22 a Mb y Hb a Mb y Hb 43 Transporte de O Transporte de O22 44

23 Transporte de O Transporte de O22 a tejidos activos a tejidos activos 45 Propiedades de un buen transportador Propiedades de un buen transportador 46

24 Cooperatividad Cooperatividad 47 Cooperatividad: ecuación de Hill Cooperatividad: ecuación de Hill 48

25 Modelos de cooperatividad Modelos de cooperatividad 49 Cooperatividad: intoxicación por CO Cooperatividad: intoxicación por CO 50

26 Cl Cl Estructura cuaternaria de la Hb Estructura cuaternaria de la Hb 51 Cambios cuaternarios en la oxigenación de Hb Cambios cuaternarios en la oxigenación de Hb 52

27 Mecanismo de la cooperatividad Mecanismo de la cooperatividad Estado T Estado R 53 Papel del 2,3 BPG Papel del 2,3 BPG 54

28 BPG (2): HbF BPG (2): HbF Cadenas His143 (HC) Ser(HC) 55 Efecto Bohr: ph Efecto Bohr: ph 56

29 Equilibrio CO Equilibrio CO22 HCO HCO33 : Anhidrasa carbónica : Anhidrasa carbónica 57 Efecto Bohr: CO Efecto Bohr: CO22 58

30 Acoplamiento del transporte de CO Acoplamiento del transporte de CO22/O /O22 59 Papel del NO en el ciclo respiratorio Papel del NO en el ciclo respiratorio 60

31 Estructura del gen de globina Estructura del gen de globina 61 Evolución de los genes de globina Evolución de los genes de globina 62