UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE ODONTOLOGÍA

Transcripción

1 UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE ODONTOLOGÍA GRADO DE ANGIOGÉNESIS EN CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE CAVIDAD ORAL Y SU ASOCIACIÓN CON EL FRENTE DE INVASIÓN TUMORAL DE BRYNE Y CLASIFICACIÓN HISTOLÓGICA INTERNACIONAL DE TUMORES. MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE CIRUJANO- DENTISTA MARIO CANTIN LOPEZ DOCENTE GUÍA: Dr. BERNARDO VENEGAS R. TALCA-CHILE 2006

2 Dedicatoria: A todos los que me ayudaron y permitieron que esto fuera posible; que me acompañaron en este proceso de aprender en lo profesional, y más importante aún, en la vida Gracias. 2

3 AGRADECIMIENTOS Al Doctor Bernardo Venegas, mi profesor guía, por su gran ayuda y tiempo dedicado; por sus enseñanzas y amistad brindada. A mi made Margarita y a Polo, por los años de apoyo en esta gran tarea que ha significado estar en la universidad. A la Torra, por ayudarme todos estos años a realizar esta tarea. A mi familia que siempre ha estado acompañándome. A mis amigos que me han acompañado durante años, algunos desde el colegio, algunos desde mis primeros años de universidad, y otros que he tenido el agrado de conocer al final de esta etapa, espero que siempre están ahí. 3

4 4

5 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN HIPÓTESIS OBJETIVOS: OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA: ANGIOGÉNESIS FACTORES REGULADORES DE LA ANGIOGÉNESIS DETERMINACIÓN DEL GRADO DE ANGIOGÉNESIS 15 O DENSIDAD MICROVASCULAR. 4.2 GRADUACIÓN HISTOLÓGICA DE TUMORES CLASIFICACIÓN HISTOLÓGICA INTERNACIONAL 16 DE TUMORES CLASIFICACIÓN HISTOLÓGICA SEGÚN BRODER 17 MODIFICADA POR OMS SISTEMA DE GRADUACIÓN DEL FRENTE DE INVASIÓN TUMORAL DE BRYNE (FIT) SCORE EN EL FRENTE DE INVASIÓN MATERIAL Y MÉTODO RESULTADOS. 32

6 1. INTRODUCCION El término cáncer describe un grupo heterogéneo con más de 200 tipos diferentes de tumores malignos (Clark et al, 1991). Dentro de estos, el Carcinoma de células escamosas de la cavidad oral es uno de los 10 tumores más frecuentes, mostrando un significativo aumento en su incidencia (90%) (Riera P. 2005) y mortalidad en los últimos años (Ascani et al, 2005; Bankfalvi et al, 2000). El crecimiento de las neoplasias más allá de 2 o 3 mm requiere de un aumento del riego sanguíneo para obtener suficiente oxígeno y nutrientes, y poder eliminar sus productos. Esta teoría fue propuesta inicialmente por Judah Folkman el año 1971, lo que ha impulsado al estudio de la angiogénesis en el área oncológica en las últimas tres décadas (Folkman 1975, 2005; Ascani et al, 2005). La angiogénesis es un proceso fundamental en el crecimiento tumoral y metástasis (Maeda T, 1998), y consiste en la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes a través de múltiples mecanismos como la secreción de factores de crecimiento desde las células tumorales. Esto ha sido demostrado en muchas enfermedades malignas como cáncer de próstata, cérvico uterino, colon, esófago y cáncer de mamas (Yi-Shing S, 2004). Esta angiogénesis es uno de los fenotipos esenciales para la formación de tumores, y también en procesos fisiológicos normales incluyendo crecimiento, desarrollo y reproducción (Risau W et al, 1992). Existen evidencias directas e indirectas que demuestran que el proceso tumoral es angiogénesis dependiente. Estudios in vitro han demostrado que el crecimiento tumoral sin vasos sanguíneos alcanza proporciones hasta que los nutrientes son capaces de llegar al tumor por simple difusión; por lo que se ha propuesto que la neovascularización tumoral es resultado de estímulos específicos, lo que se transforma en el mecanismo de control más importante de crecimiento tumoral. El punto en el cual el tumor comienza

7 con su angiogénesis en etapas tempranas divide al tumor en dos fases: una antes de la vascularización y otra después de la vascularización. Las células tumorales tienen un rol significativo en este proceso liberando moléculas reguladoras de la angiogénesis, así como la existencia de antagonistas que pueden retardar o prevenir el crecimiento tumoral. Este crecimiento ocurre tras la secreción de múltiples sustancias conocidas como factores de crecimiento, siendo el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) el más importante ( Ragus PA et al, 1992). Por lo tanto la angiogénesis es un paso fundamental para el paso de un grupo pequeño de células inofensivas, a un tumor de gran tamaño; siendo también fundamental para la diseminación del cáncer o metástasis. El diagnóstico histopatológico juega un rol fundamental en la decisión terapéutica del cáncer y su pronóstico, y esta observación de características histológicas en cánceres agresivos ha creado el concepto de grado histológico, que es la expresión numérica de la diferenciación (Ivkic M. 2002). El año 1932 tras estudios realizados por Broder relatando la extensión de malignidad de las neoplasias, enfatizó la correlación entre diferenciación histopatológica del tumor, su tratamiento y pronóstico, estableciéndose un método simple de graduación para carcinoma de células escamosas. Wahi (Wahi et al, 1997), en un reporte de la OMS, modificó y simplificó el sistema de graduación de malignidad histológica y la subdividió en tres grados: I, II y II; siendo esta clasificación basada principalmente en la proliferación y diferenciación tumoral (Geiger de Oliveira et al, 2005), el que es usado hasta el día de hoy, pero modificada en la clasificación internacional de tumores (OMS 1997).

8 Uno de los descubrimientos más recientes, ha sido el reconocimiento de la estructura y función de las partes más avanzadas del carcinoma, denominada Frente de Invasión Tumoral (Bankfalvi A. et al, 2000), que determina la agresividad biológica del cáncer. Bryne desarrolló un sistema de graduación de malignidad enfocado sólo a este frente de invasión tumoral (FIT) (Bryne M. 1992, 1998), que hace una relación entre el grado histológico y la proliferación celular en el CECCO (Tumuluri V, 2004). Se han realizado muchos estudios analizando individualmente el grado de angiogénesis, grado de diferenciación y frente de invasión del CCECO, demostrando la importancia diagnóstica y pronóstica de cada uno de ellos, pero no existen estudios que asocien estos parámetros. El propósito de este estudio es determinar el grado de angiogénesis y su asociación con el grado de diferenciación según la clasificación internacional de tumores y el patrón de invasión según el sistema de medición de Bryne en pacientes con carcinoma de células escamosas de cavidad oral diagnosticados en el Hospital Regional de Talca y Hospital Base de Curicó entre los años 1995 y 2005.

9 2. HIPÓTESIS El grado de angiogénesis tumoral junto con el grado de diferenciación según clasificación internacional de tumores tienen una asociación inversamente proporcional; y una asociación directamente proporcional con el frente de invasión según el sistema de medición de Bryne en pacientes con diagnóstico de CCECO en los Servicios de Patología del Hospital Regional de Talca y el Hospital Base de Curicó.

10 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO PRINCIPAL - Determinar el grado de angiogénesis tumoral y su asociación con el grado de diferenciación según la clasificación internacional de tumores y el frente de invasión según el sistema de medición de Bryne en pacientes con carcinoma de células escamosas de cavidad oral diagnosticados en los Servicios de Patología del Hospital regional de Talca y el Hospital Base de Curicó entre los años 1995 y OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Determinar el grado de angiogénesis y su asociación con el grado de diferenciación según la clasificación internacional de tumores en pacientes con CCECO en los Servicios de Patología del Hospital Regional de Talca y el Hospital Base de Curicó. - Determinar el grado de angiogénesis tumoral y su asociación con el frente de invasión según el sistema de medición de Bryne en pacientes con CCECO en los Servicios de Patología del Hospital Regional de Talca y el Hospital Base de Curicó. - Determinar el grado de angiogénesis tumoral y su asociación con el patrón de invasión según el sistema de medición de Bryne en pacientes con CCECO en los Servicios de Patología del Hospital Regional de Talca y el Hospital Base de Curicó. - Determinar el grado de angiogénesis y su asociación con el grado de respuesta inmune en pacientes diagnosticados con CCECO en los Servicios de Patología del Hospital Regional de Talca y el Hospital Base de Curicó.

11 - Determinar el grado de angiogénesis y su asociación con el grado de queratinización en pacientes diagnosticados con CCECO en los Servicios de Patología del Hospital Regional de Talca y el Hospital Base de Curicó. - Determinar el grado de angiogénesis y su asociación con el pleomorfismo nuclear en pacientes diagnosticados con CCECO en los Servicios de Patología del Hospital Regional de Talca y el Hospital Base de Curicó. - Determinar el grado de angiogénesis o microdensidad vascular (MDV) y su asociación según la ubicación del CCECO.

12 4. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 4.1 ANGIOGÉNESIS Los vasos sanguíneos son uno de los primeros órganos en constituirse embriológicamente, y forman una gran red en todo el organismo. La formación de los vasos sanguíneos envuelve por tanto procesos biológicos, pero también patológicos (Costa et al., 2004). Angiogénesis, puede definirse como el proceso de desarrollo de nuevos vasos sanguíneos producidos a partir del crecimiento y ramificación de vasos sanguíneos preexistentes (Lozano et al., 1998). Judah Folkman demostró que los tumores sólidos no pueden crecer más allá de 2 a 3 mm de diámetro si no existe el aporte sanguíneo dado por la angiogénesis (Folkman et al., 1971). La angiogénesis juega un rol crucial en el desarrollo del tumor, invasión y metástasis (Okamoto et al., 2002; Lee et al 1997); ha sido reconocida como ayudante de la progresión y metástasis de tumores malignos. Este proceso es complejo y está mediado por factores reguladores. Estos factores inducen a la formación de nuevos vasos sanguíneos, los que se encargan del crecimiento del tumor (Naresh et al. 2001).

13 4.1.2 FACTORES REGULADORES DE LA ANGIOGÉNESIS La desviación de los tejidos hacia un fenotipo angiogénico, incluye cambios en el equilibrio local entre los factores reguladores activadores e inhibidores del crecimiento de los vasos y que ocurre por uno de los mecanismos siguientes: Sobreexpresión intracelular de uno o más reguladores positivos de la angiogénesis. Movilización de proteínas angiogénicas de la matriz extracelular (producidas por los macrófagos). Combinación de estos procesos. Reguladores Activadores: -Factor de transformación beta (TGFβ) Este factor de crecimiento inhibe la proliferación de los endoteliocitos in vitro, pero una inyección focal in vivo estimula la angiogénesis (Sánchez, 2001). -Factor de crecimiento placentario (PGF) Las células neoplásicas pueden sintetizar de forma alternativa un PGF identificado como tipo 2, este posee un mayor número de aminoácidos básicos que la secuencia del factor clásico. Compite por los sitios de unión de los factores de crecimiento de fibroblastos (FGR) y los factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Hace que las formas difusibles activas permanezcan mayor tiempo en los tejidos e incrementan su efecto angiogénico. Esto sugiere un mecanismo por el cual las isoformas de factores de crecimiento sintetizadas por las células neoplásicas aumentan la angiogénesis, para favorecer el crecimiento y la progresión tumoral (Sánchez, 2001).

14 -Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) Existen 2 variedades ácidas y básicas, ambas pueden por estimulación paracrina incrementar la síntesis de factores angiogénicos por los macrófagos del tejido conjuntivo o estimular la proliferación de las células endoteliales e inhiben su apoptosis (Chavaskis et al., 2002). El FGF al igual que otros factores de crecimiento tumoral, al aumentar el índice de actividad mitótica, facilitan la proliferación de células tumorales y endoteliales vasculares en las áreas más vascularizadas del tumor y estimulan la angiogénesis in vivo (Papetti et al., 2002). Además se ha visto que es dependiente de la expresión del VEGF (Folkman et al., 2003). -Factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) Es considerado el factor de crecimiento angiogénico más importante (Nakaya et al 2005; Papetti et al., 2002). Generalmente actúa de forma coordinada con otros factores como el factor de crecimiento de las células endoteliales derivado de las plaquetas (PD- ECGF). Se expresa abundantemente en tumores de origen epitelial y asociado a otros estados clínicos como isquemia del miocardio y enfermedades retinianas, en las cuales su elevación es estimulada por la isquemia tisular. En los tejidos neoplásicos su síntesis es promovida por las propias células tumorales (Kerbel R., 2000). También incrementa la permeabilidad de las células endoteliales y su proliferación; inhibe la apoptosis de células endoteliales y estimula la angiogénesis in vivo (Papetti et al., 2002; Folkman & D`Amore, 1996). -Factor de crecimiento de las células endoteliales derivado de las plaquetas (PD-ECGF) Se sobreexpresa en los tumores vasculares que manifiestan el VEGF; generalmente actúa en coordinación con este último para estimular la angiogénesis. Además estimula la síntesis de DNA e incrementa la estabilidad de los capilares (Papetti et al., 2002).

15 -Angiopoyetina 1 y 2 Ayudan a la remodelación de vasos sanguíneos y diferenciación del sistema vascular, adaptándolo a las demandas metabólicas de los tejidos (Chavaskis et al., 2002). Además tiene una importante acción en la diferenciación de células endoteliales y la maduración vascular (Babaei et al., 2003). Reguladores inhibidores (Iamaroon et al., 2003): -Trombospondina Su síntesis está controlada por el gen p53. La trombospondina impide la unión del FGF a células, y como consecuencia inhibe la proliferación celular. -Angiostatina Inhibe específicamente la proliferación endotelial. -Factor IV plaquetario. Inhibe específicamente la proliferación endotelial y disminuye la adhesión celular.

16 Por lo tanto, la invasión y la metástasis dependen de la angiogénesis en dos estadios: 1.- Las células no se desprenden del tumor primario hasta que este no ha desarrollado una neovascularización (Lozano et al., 1998). 2.- Cuando llegan a un órgano distante, de nuevo es preciso el desarrollo de angiogénesis para que las metástasis crezca hasta un tamaño clínicamente detectable (Lozano et al., 1998). Etapas del proceso de angiogénesis (Lozano et al., 1998): 1. Disolución de la membrana que rodea a un vaso preexistente. 2. Migración de células endoteliales desde un vaso antiguo hasta el tumor. 3. Las células líderes en esta migración parecen no dividirse, pero las que les siguen sintetizan ADN y se produce la división celular. 4. Elongación de los nuevos vasos inmaduros. 5. Canalización: Formación de una red, junto con la ramificación y la formación de conexiones que dan lugar a la red capilar. 6. Asentamiento de la red capilar ya madura rodeada por componentes basales de membrana, y en algunos casos por una red de células perivasculares denominadas pericitos, lo que constituiría la etapa final del proceso.

17 4.1.2 DETERMINACIÓN DEL GRADO DE ANGIOGÉNESIS O DENSIDAD MICROVASCULAR. Uno de los métodos más usados fue introducido por Weidner (Weidner et al., 1991); consiste en el conteo de vasos sanguíneos teñidos inmuhistoquímicamente, obteniendo la densidad microvascular (MDV), la cual representa el potencial angiogénico de la neoplasia. El primer paso consiste en la identificación con baja magnificación de un dominio de alta intensidad de tinción o áreas de mayor vascularización, denominado hot spot neovascular; enseguida la MDV es determinada con un poder de magnificación mayor (Ascani et al., 2005; Shieh et al., 2004, Tae et al., 2000). La MDV se encuentra aumentada con el incremento del grado histológico; en el conteo de alta MDV detectado en tumores de CECCO, mostraron un bajo grado de diferenciación (Ascani et al., 2005). En un estudio realizado por Shieh, se registró la MDV con marcadores endoteliales celulares específicos vwf, CD31 y CD34, se encontró una correlación significativa entre MDV y el grado de diferenciación histológica (Shieh et al., 2004).

18 4.2 GRADUACIÓN HISTOLÓGICA DE TUMORES CLASIFICACION HISTOLÓGICA INTERNACIONAL DE TUMORES El CECCO se origina a partir de células provenientes del estrato espinoso de epitelios planos estratificados. Muestra una gran variación histológica, están formados por una población celular heterogénea, presentando distintos grados de diferenciación y diferentes características funcionales y morfológicas; algunas células pueden dar al tumor la capacidad de producir invasión y metástasis. El reconocimiento de que se presentaban diferentes grados de diferenciación en el carcinoma espinocelular, originó que Broder sugiriera un sistema de graduación de tumores, divididos en cuatro grados (Shafer & Levy, 1986). Sin embargo, la OMS en 1997 los clasificó en sólo tres tipos (Kentola et al., 2000) De acuerdo a su grado de diferenciación, se clasifican histológicamente en neoplasias bien diferenciadas (semejantes a sus células de origen), hasta una neoplasia mal diferenciada o anaplásica (que ha perdido los patrones celulares de su célula de origen). Aunque generalmente se presenta como una neoplasia bien diferenciada con algún grado de queratinización, puede aparecer como una lesión con gran anaplasia, que tiende a causar metástasis tempranamente y causar una muerte rápida (Shafer & Levy, 1986).

19 4.2.2 CLASIFICACIÓN HISTOLÓGICA SEGÚN BRODER MODIFICADA POR OMS (CLASIFICACIÓN INTERNACIONAL DE TUMORES). Los CECCO pueden ser: Carcinoma Bien diferenciado, moderadamente diferenciado o indiferenciado. Carcinoma espinocelular de cavidad oral bien diferenciado: Presenta células de origen epitelial ubicadas en el estrato espinoso, que forman láminas o nidos celulares; por lo general estas células son grandes y muestran una gran variabilidad en la intensidad de la reacción de coloración. Se encuentran mitosis atípicas, aunque no son numerosas, menos de 2 al observar por cada campo del microscopio (Shafer & Levy, 1986). Uno de los aspectos más característicos de los carcinomas bien diferenciados es la presencia de queratinización de las células y formación de numerosas perlas de tamaño variable de queratina o epitelio. Reducido pleomorfismo celular y nuclear. (Gaiger et al.,2005). Carcinoma espinocelular de cavidad oral moderadamente diferenciado: Las células pierden algunas características, de modo que su semejanza con el epitelio escamoso es menos notable. La forma puede estar alterada, así como su ordenamiento respecto una de otra. El grado de crecimiento de las células individuales es más rápido y se refleja en un mayor número de mitosis, de 2 a 4 por campo de microscopio; gran variedad de tamaños, forma y reacción a la coloración, y escasa o nula formación de queratina. Pleomorfismo nuclear y celular moderado (Gaiger et al., 2005).

20 Carcinoma espinocelular de cavidad oral indiferenciado: Las células guardan poca semejanza con sus células de origen y frecuentemente presentan dificultades en el diagnóstico por su aspecto histológico primitivo y no característico de las células malignas que se dividen con rapidez. Muestran una carencia de cohesividad y se disponen al azar. Se observa una muy marcada pérdida de uniformidad de las células individuales, así como una pérdida de su orientación arquitectónica, en estas células se puede observar considerable pleomorfismo y núcleos hipercromáticos, anormalmente grandes para el tamaño de las células, existe gran cantidad de mitosis atípicas, mayor a 4 por campo de microscopio las cuales no se limitan a los estratos basales, sino que pueden aparecer en todos los niveles, e incluso en células superficiales. Se pierde la maduración progresiva habitual, desde células altas en el estrato basal hasta escama aplanadas en la superficie, siendo reemplazada por una mezcla de células oscuras de aspecto basal. Además nula formación de queratina (Gaiger et al., 2005). En un estudio realizado por Kurokawa a 174 pacientes con CECCO de lengua; encontró asociación entre la clasificación histológica de Broder y el FIT de Bryne (Kurokawa et al., 2005).

21 4.2.3 SISTEMA DE GRADUACIÓN DEL FRENTE DE INVASIÓN TUMORAL DE BRYNE (FIT). El FIT constituye la zona de avance o de invasión hacia tejidos de la neoplasia y en estos últimos años se ha descubierto su potencial para determinar de mejor manera la agresividad biológica y el pronóstico de los pacientes con cáncer ( Bankalfi & Piffko, 2000). Las células que constituyen el FIT difieren de las células que están en la superficie y la zona central del tumor, tanto en sus características morfológicas y funcionales (Noguchi et al, 2002). El FIT frecuentemente presenta células con un bajo grado de diferenciación y una alta disociación (Bryne et al., 1998). Evidencia reciente sugiere que las células presentes en el FIT de CECCO poseen características moleculares diferentes, convirtiendo al FIT en el área más importante para el pronóstico. Estos eventos moleculares incluyen disminución de la apoptosis, pérdida de la adhesión celular, aumento en la angiogénesis, expresión aberrante de moléculas de adhesión, tales como cadherinas e integrinas, sobreproducción de enzimas que degradan la MEC y aumento de la expresión de moléculas de proliferación (Bryne et al., 1998; Tumuluri et al., 2002). Se cree que en el FIT están los subclones celulares que poseen una mayor capacidad de proliferación. Piffko et al. en 1996 observó que el FIT está compuesto de una subpoblación celular altamente proliferativa, midiendo la expresión de MIB-1 (marcador de crecimiento), también Piffko et al. en 1997 descubrieron que en el FIT se expresan altos valores de AgNOR (Marcador de crecimiento tumoral), lo que indica que en esta zona existe una mayor actividad proliferativa y presenta un mayor potencial maligno (Piffko et al.,1996, 1997). El Ki-67 (marcador de proliferación) se encuentra aumentado en el FIT, en relación a los tejidos sanos y otras zonas del tumor, indicando que las células del FIT son menos diferenciadas que células de otras áreas y que presentan una mayor actividad proliferativa (Tumuluri et al., 2002).

22 La adhesión entre las células y con la matriz extracelular (MEC) se pierde debido a la alteración de los procesos que regulan la adhesión, esto es un requisito para producir invasión y muchos estudios (Bànkfalvi et al., 2002) sugieren que el análisis de estas moléculas de adhesión en el FIT puede tener algún valor pronóstico. La expresión aberrante de varias moléculas de adhesión se ha observado en el FIT, tales como: Cadherinas, integrinas, CD 44, lamininas, tenascinas y oligosacáridos (Bryne et al., 1998). Las enzimas proteolíticas y sus receptores son necesarios para que se produzca la invasión celular, actuando sobre las células del estroma adyacente y/o las células invasivas. Se ha observado que en el FIT existe un incremento en la actividad proteolítica. Otros eventos se han observado en el frente invasivo tumoral como señales de iniciación de angiogénesis y migración (Bryne et al., 1995). Bryne y colaboradores desarrollaron un Sistema de Graduación del frente invasivo en CECCO, basándose en un sistema multifactorial propuesto por Jacobsson et al. en 1973 y por Anneroth et al en 1987 (Sawair et al., 2003). Este sistema consta de cinco características histológicas y asignándoles valores de 1 a 4. Las características que se consideran son : grado de queratinización, pleomorfismo nuclear, cantidad de mitosis, patrón de invasión y respuesta inmune del huésped (Ivkié et al., 2002). Actualmente el parámetro de número de mitosis se ha eliminado del sistema debido a su difícil cuantificación y estandarización (Bryne et al., 1992); el no ser considerado aumenta la reproductibilidad, sin afectar el valor pronóstico del sistema. La variabilidad del sistema se puede disminuir a través de la calibración de los operadores y la simplificación de los criterios (Bryne et al., 1998). El patrón de invasión resulta ser el parámetro de mayor valor pronóstico y el pleomorfismo nuclear el de menor valor.

23 4.2.4 SCORE EN EL FRENTE DE INVASIÓN. Sistema de graduación de malignidad. Solamente se evalúa las partes más invasivas del tumor. El score para cada parámetro es sumado y permite tener un score de malignidad total (Anneroth et al., 1987; Bryne et al., 1998). Score del frente invasivo: Rasgo Morfológico Grado de queratinización. Pleomorfismo nuclear Altamente queratinizadas (> 50% de células). Poco PN (> 75 % de células bien diferenciadas). Moderadamente Mínimamente queratinizadas queratinizadas (20-50% de células). (5-20% de células). Moderado PN (50- Abundante PN (25-75% de células bien 50% de células bien diferenciadas). diferenciadas). Sin queratina (0-5% de células). Extremo PN (0-25% de células bien diferenciadas Patrón de invasión Respuesta del huésped Bordes bien definidos, células infiltrando en forma de islotes anchos. Marcado infiltrado inflamatorio Infiltración en cordones sólidos o Pequeños grupos o cordones celulares Disociación marcada y amplia con células acintados. infiltrando con menos infiltrando en forma de 15 células. individual o pequeños grupos de menos de 5 células Moderado Leve Ausente Fuente: Bryne et al., Histological grading of the deep invasive front of T1 and T2 glottic squamous cell carcinoma has high pronostic value. Virchows Arch 427 (3):

24 El score final debe ser la suma de cada rasgo morfológico evaluado. Mientras más alto, peor el pronóstico, pero indudablemente que otros factores influyen, tales como tamaño, ubicación, presencia de nódulos linfáticos, metástasis y grado histológico (Kurokawa et al., 2005). El grado de queratinización (Figura 1) y pleomorfismo nuclear expresan la diferenciación de un tumor, además se cuantifica independiente de la forma de presentación, ya sea como queratinización intracelular individual o como perlas de queratina. La respuesta inmune (Figura 1) es el reflejo de la reacción inmunológica a la neoplasia, la infiltración inflamatoria puede ser expresada como un parámetro morfológico de la reacción inflamatoria en muchos casos causada por la ulceración, por lo que se recomienda tomar una muestra donde aparezca el estroma adyacente al frente invasivo. (Anneroth et al., 1987). Además, células inflamatorias son potencialmente una fuente importante de citoquinas angiogénicas. Lee demostró que existe una correlación entre el incremento de la inflamación y el aumento de la densidad vascular dentro de el tumor (Lee et al., 1997). El pleomorfismo nuclear incluye variaciones en el número, tamaño, forma del núcleo alterada, incremento del tamaño del núcleo en relación al citoplasma y presencia de núcleos múltiples e hipercromáticos (Anneroth et al., 1987). El patrón de invasión (Figura 2) puede definirse como la forma en que la neoplasia se infiltra hacia los tejidos adyacentes, invadiéndolos, esto incluye la relación tumorhospedero (Anneroth et al., 1987).

25 En un estudio realizado por Sawai, se confirmó el potencial valor diagnóstico y pronóstico del sistema del FIT en pacientes con CECCO (Sawai et al., 2002).

26 FIGURA 1 Fuente: Anneroth et al., Review of the literatura and a recomended system of malignancy grading in oral squamous cell carcinoma. Scand J Dent Res 1987.

27 FIGURA 2 Fuente: Anneroth et al., Review of the literatura and a recomended system of malignancy grading in oral squamous cell carcinoma. Scand J Dent Res 1987.

28 5. MATERIALES Y MÉTODOS. 5.1 DISEÑO DEL ESTUDIO. Se realizó un estudio Descriptivo-Observacional de corte Transversal. 5.2 DESCRIPCIÓN GENERAL DEL ESTUDIO. Se observaron microscópicamente placas histológicas procesadas con técnica Inmunohistoquímica y su correspondiente Hematoxilina- Eosina (H&E), para identificar el grado de angiogénesis, en base al Anticuerpo Monoclonal de ratón Collagen Type IV (NCL-COLL-IV), de especificidad para colágeno tipo IV humano, Clone PHM12, del Laboratorio Novocastra Ltda.) de pacientes diagnosticados con CCECO, obtenidas del procesamiento de tacos derivados de los Servicios de Anatomía Patológica del Hospital Regional de Talca y Hospital Base de Curicó, entre los años 1993 y 2005; para determinar la asociación existente entre el grado de angiogénesis, el grado de diferenciación y el frente de invasión tumoral. 5.3 POBLACIÓN ESTUDIADA. Placas histológicas de 32 pacientes diagnosticados con Carcinoma de Células Escamosas de Cavidad Oral, derivadas del procesamiento de tacos, obtenidos del Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Regional de Talca y Hospital Base de Curicó, entre los años 1993 y 2005.

29 5.4 CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN DE MUESTRAS. De un total inicial de 37 placas histológicas procesadas con técnica Inmunohistoquímica y su correspondiente H&E, se excluyeron 5 placas. Una por presentar importante disgregación, dificultando la observación de los parámetros a evaluar; otra por ausencia de lesión tumoral y tres por dificultad para clasificar la microdensidad vascular, de acuerdo a los criterios establecidos. 5.5 ANÁLISIS DE LA MUESTRA. Las placas histológicas fueron observadas por dos operadores previamente calibrados, utilizando un microscopio óptico marca ZEISS, modelo 0.25 Standard (Germany), con diferentes objetivos ópticos (3.2, 10, 20 y 40 X) siguiendo el procedimiento propuesto por Weidner (Weidner et al., 1991). Cada placa histológica se clasificó de acuerdo a las variables: Grado de angiogénesis (MDV), Grado de Diferenciación Celular y Frente de Invasión Tumoral de Bryne (FIT), utilizando las siguientes categorías: GRADO DE ANGIOGÉNESIS: ESTADIO MICRODENSIDAD VASCULAR 1 10 VASOS 2 >10 Y 20 VASOS 3 >20 VASOS

30 GRADO DE DIFERENCIACIÓN CELULAR: GRADO DE DIFERENCIACIÓN 1 BIEN DIFERENCIADOS MODERADAMENTE 2 DIFERENCIADOS 3 INDIFERENCIADOS FRENTE DE INVASIÓN TUMORAL DE BRYNE (FIT): De acuerdo a este parámetro las muestras fueron clasificadas, otorgando puntuaciones individuales, de 1 a 4 puntos, a cada elemento morfológico en estudio en base a las siguientes características: PLEOMORFISMO NUCLEAR: GRADO PLEOMORFISMO NUCLEAR 1 BAJO 2 MODERADO 3 ABUNDANTE 4 EXTREMO

31 PATRÓN DE INVASIÓN: GRADO RESPUESTA INMUNE 1 MARCADA GRADO PATRON DE INVASION 1 BORDES BIEN DEFINIDOS 2 CORDONES SÓLIDOS 3 GRUPOS CELULARES PEQUEÑOS 4 MARCADA DISOCIACIÒN GRADO DE QUERATINIZACIÓN: GRADO QUERATINIZACION 1 ALTA 2 MODERADA 3 MÍNIMA 4 SIN QUERATINA RESPUESTA INMUNE: 2 MODERADA 3 LEVE

32 4 AUSENTE Los puntajes obtenidos en cada una de las cuatro variables se sumaron para obtener un score o resultado total para cada placa. Los resultados obtenidos fueron llevados a consenso, por los dos operadores, al momento de la observación. 5.6 ANALISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS. La información obtenida se analizó en base a tablas de contingencia relacionando el Grado de angiogénesis y los parámetros de Clasificación Histológica Internacional de Tumores y Sistema de Graduación del Frente de Invasión Tumoral de Bryne, con todas sus variantes. Para determinar la correlación estadística entre las variables en estudio, se utilizó la prueba de Chi-cuadrado, considerando significativos valores iguales o menores a El procesamiento y cálculo de datos se realizó utilizando el Sistema Software SPSS 13.0 para Windows (Stadistical Program Social Sciencie), previo ingreso de datos (Planilla Excel) por un solo operador. 5.7 ASPECTOS ÉTICOS La información que en este estudio se recopiló, es totalmente confidencial, y fue utilizada solamente para fines de estudio.

33 6. RESULTADOS En un total de 32 placas histológicas observadas en este estudio, el grado de angiogénesis correspondió a un 43% leve (Estadio I), un 38% a moderado (Estadio II) y un 19% a avanzado (Estadio III) (Gráfico 1).

34 Gráfico 1: Distribución de placas histológicas según grado de angiogénesis GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 19% 43% 38% Con respecto al Grado de diferenciación celular un 60% correspondió a CCECO Moderadamente Diferenciados (Grado II), un 34% a CCECO Bien Diferenciados (Grado I) y un 6% a CCECO Indiferenciados (Grado III) (Gráfico 2). Gráfico 2: Distribución de placas histológicas según grado de diferenciación celular GRADO DE DIFERENCIACIÓN BIEN DIFERENCIADO 6% 34% MODERADAMENTE DIFERENCIADO INDIFERENCIADO 60% Gráfico 3: Asociación entre grado de angiogénesis y grado de diferenciación celular

35 Nº PLACAS LEVE Moderado 0 BIEN DIFERENCIADO MODERADAMENTE DIFERENCIADO INDIFERENCIADO Total Avanzado TOTAL GRADO DE ANGIOGÉNESIS GRADO DE DIFERENCIACIÓN CELULAR Entre las placas con un Grado de angiogénesis leve en el CECCO se encontró que un 50% correspondió a bien diferenciado y un 50% a moderadamente diferenciado. No se observaron placas histológicas con CECCO Indiferenciado (Gráfico 4). Gráfico 4: Distribución de placas histológicas según grado de angiogénesis leve en el grado de diferenciación celular GRADO DE DIFERENCIACIÓN BIEN DIFERENCIADO 0% MODERADAMENTE DIFERENCIADO INDIFERENCIADO 50% 50% Entre las placas con un Grado de angiogénesis moderado en CECCO, se encontró que un 58% correspondió a Moderadamente diferenciado, un 25% a Bien diferenciado, y sólo un 17% a Indiferenciado (Gráfico 5).

36 Gráfico 5: Distribución de placas histológicas según grado de angiogénesis moderado en el grado de diferenciación celular 17% 25% GRADO DE DIFERENCIACIÓN BIEN DIFERENCIADO MODERADAMENTE DIFERENCIADO INDIFERENCIADO 58% Entre las placas con un Grado de angiogénesis avanzado en CECCO, se encontró que un 83% correspondió a Moderadamente diferenciado, un 17% a Bien diferenciado. No se observaron placas histológicas con CECCO Indiferenciado (Gráfico 6). Gráfico 6: Distribución de placas histológicas según grado de angiogénesis avanzado en el grado de diferenciación celular 0% 17% GRADO DE DIFERENCIACIÓN BIEN DIFERENCIADO MODERADAMENTE DIFERENCIADO INDIFERENCIADO 83% Al aplicar la prueba de Chi- cuadrado para establecer la relación entre el Grado de angiogénesis y el grado de diferenciación celular se obtuvieron valores de p = 0.687, por lo que no existe evidencia muestral significativa para concluir que ambas variables están asociadas (Gráfico 3).

37 De acuerdo al score total del FIT se establecieron tres categorías, de 8 a 9, de 10 a 11 y de 12 a 13 puntos, para agrupar las placas observadas. Un 43% del total se agrupo en la categoría de 10 a 11 puntos, un 41% en la categoría de 8 a 9 puntos y un 16% en la categoría de 12 a 13 puntos (Gráfico 7). Gráfico 7: Distribución de placas histológicas según el Frente de Invasión Tumoral de Bryne FRENTE DE INVASIÓN TUMORAL CATEGORIA 8 Y 9 CATEGORIA 10 Y 11 CATEGORIA 12 Y 13 16% 41% 43% Gráfico 8: Asociación entre grado de angiogénesis y Frente de Invasión Tumoral de Bryne

38 Nº DE PLACAS Leve 5 Moderado Avanzado 0 8 Y 9 10 Y Y 13 TOTAL TOTAL FRENTE DE INVASIÓN TUMORAL DE BRYNE GRADO DE ANGIOGÉNESIS Entre las categorías 8 y 9 de un total de 13 placas histológicas, un 47% correspondió a un grado de angiogénesis leve, un 38% correspondió a un grado de angiogénesis moderado y un 15% a un grado de angiogénesis avanzado (Gráfico 8). Entre las categorías 10 y 11 de un total de 14 placas histológicas, un 43% correspondió a un grado de angiogénesis leve, un 36% correspondió a un grado de angiogénesis moderado y un 21% a un grado de angiogénesis avanzado (Gráfico 8). Entre las categorías 12 y 13 de un total de 5 placas histológicas, un 40% correspondió a un grado de angiogénesis leve, un 30% correspondió a un grado de angiogénesis moderado y un 20% a un grado de angiogénesis avanzado (Gráfico 8). Al aplicar la prueba de Chi- cuadrado para establecer relación entre el grado de angiogénesis y el score total del FIT de Bryne se obtuvo un valor p = 0.687, por lo que no existe evidencia muestral significativa para establecer una asociación entre ambas variables (Gráfico 8). Con respecto al patrón de invasión tumoral, de la totalidad de placas histológicas observadas, un 62% presento un patrón de invasión score 3, un 19% un patrón de

39 invasión score 2 y un 19% un patrón de invasión score 4, no observándose placas con patrón de invasión score 1 (Gráfico 9). Gráfico 9: Distribución de placas histológicas según el Patrón de invasión 19% 0% PATRÓN DE INVASIÓN SCORE 1 SCORE 2 SCORE 3 SCORE 4 19% 62% Gráfico 10: Asociación entre grado de angiogénesis y Patrón de invasión

40 N DE PLACAS Leve 5 Moderado Avanzado 0 TOTAL SCORE 1 SCORE 2 SCORE 3 SCORE 4 TOTAL GRADO DE ANGIOGÉNESIS PATRÓN DE INVASIÓN No se observó presencia de un score 1 en el patrón de invasión de las placas histológicas. De las placas histológicas clasificadas con un score 2 en el patrón de invasión, un 50% correspondió a un grado de angiogénesis moderado, un 33% a un grado de angiogénesis avanzado y sólo un 17% correspondió a un grado de angiogénesis leve (Gráfico 11). Gráfico 11: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 2 del Patrón de invasión

41 33% 17% GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 50% De las placas histológicas clasificadas con un score 3 en el patrón de invasión, un 50% correspondió a un grado de angiogénesis leve, un 45% a un grado de angiogénesis moderado y sólo un 5% correspondió a un grado de angiogénesis avanzado (Gráfico 12). Gráfico 12: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 3 del Patrón de invasión 5% GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 45% 50% De las placas histológicas clasificadas con un score 4 en el patrón de invasión, un 50% correspondió a un grado de angiogénesis leve, un 50% a un grado de angiogénesis avanzado, no observándose placas histológicas con un score 4 que tuvieran un grado de angiogénesis moderado (Gráfico 13). Gráfico 13: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 4 del Patrón de invasión

42 GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 50% 50% 0% Al aplicar la prueba estadística de Chi- cuadrado para establecer asociación entre el grado de angiogénesis y el patrón de invasión tumoral, se obtuvo un valor p = 0.043, por lo que existe evidencia muestral significativa para afirmar una asociación entre ambas variables (Gráfico 10). Gráfico 14: Asociación entre grado de angiogénesis y respuesta inmune

43 Nº DE PLACAS Leve 5 Moderado Avanzado 0 TOTAL SCORE 1 SCORE 2 SCORE 3 SCORE 4 TOTAL RESPUESTA INMUNE GRADO DE ANGIOGÉNESIS Según el grado de respuesta inmune celular observado en las 32 placas histológicas, se pudo observar que un 44% correspondió a un score de 2, un 31% un score de 3, y sólo un 25% correspondió a un score de 1. No se observaron placas histológicas con un score 4 de respuesta inmune o respuesta inmune ausente (Gráfico 14). De las placas histológicas que presentaron un score 1 en respuesta inmune, un 62% corresponde a un grado de angiogénesis leve, un 25% corresponde a un grado de angiogénesis avanzado, y sólo un 13% correspondió a un grado de angiogénesis moderado (Gráfico 15). Gráfico 15: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 1 de la Respuesta inmune

44 25% GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 13% 62% De las placas histológicas que presentaron un score 2 en respuesta inmune, un 50% corresponde a un grado de angiogénesis moderado, un 29% corresponde a un grado de angiogénesis leve, y sólo un 21% correspondió a un grado de angiogénesis avanzado. (Gráfico 16). Gráfico 16: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 2 de la Respuesta inmune 21% 29% GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 50% De las placas histológicas que presentaron un score 3 en respuesta inmune, un 50% corresponde a un grado de angiogénesis leve, un 40% corresponde a un grado de angiogénesis moderado, y sólo un 10% correspondió a un grado de angiogénesis avanzado (Gráfico 17).

45 Gráfico 17: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 3 de la Respuesta inmune 10% GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 40% 50% No se observó presencia de un score de 4 en la respuesta inmune de las placas histológicas. Al aplicar la prueba de Chi- cuadrado para establecer asociación entre las variables grado de angiogénesis y grado de respuesta inmune se obtuvo un valor p = 0.402, por lo que no existe evidencia muestral significativa para afirmar una asociación entre ambas variables (Gráfico 14). Gráfico 18: Asociación entre grado de angiogénesis y Grado de queratinización

46 Nº DE PLACAS Leve 5 Moderado Avanzado 0 TOTAL SCORE 1 SCORE 2 SCORE 3 SCORE 4 TOTAL GRADO DE QUERATINIZACIÓN GRADO DE ANGIOGÉNESIS De acuerdo al grado de queratinización se pudo observar que un 47% correspondió a un score de 3 o mínima queratinización, un 25% correspondió a un score de 1 o alta queratinización, un 19% correspondió a un score de 2 o moderada queratinización, y sólo un 9% correspondió a un score de 4 o que no presento queratina (Gráfico 18). De acuerdo al grado de queratinización, en un 25% de las placas clasificadas como grado 1 (alta queratinización) se observó un grado de angiogénesis leve en un 62%, un grado de angiogénesis moderado en un 25% y un grado de angiogénesis avanzado en sólo un 13% de los casos (Gráfico 19). Gráfico 19: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 1 en el grado de queratinización

47 13% GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 25% 62% Dentro de las placas clasificadas como grado 2, moderada queratinización, un 50% presento un grado de angiogénesis leve y un 50% un grado de angiogénesis moderado, no observando placas con un grado de angiogénesis avanzado (Gráfico 20). Gráfico 20: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 2 en el grado de queratinización 0% GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 50% 50% De las placas histológicas clasificadas como grado 3, mínima queratinización, en un 34% se observo un grado de angiogénesis leve, en un 33% el grado de angiogénesis moderada y en 33% un grado de angiogénesis avanzado (Gráfico 21). Gráfico 21: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 3 en el grado de queratinización

48 33% 34% GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 33% Entre las placas clasificadas como grado 4 o sin queratina, un 67% presentó un grado de angiogénesis moderado y un 33% un grado de angiogénesis leve. No se observó algún grado de angiogénesis avanzada (Gráfico 22). Gráfico 22: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 4 en el grado de queratinización 0% 33% GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 67% Al aplicar la prueba estadística de Chi- cuadrado para establecer la asociación entre el grado de angiogénesis y grado de queratinización se obtuvo un valor p = 0.420, por lo que no existe evidencia muestral significativa para concluir que ambas variables están asociadas (Gráfico 18). Gráfico 23: Asociación entre grado de angiogénesis y Pleomorfismo nuclear

49 Nº DE PLACAS Leve 5 Moderado Avanzado 0 TOTAL SCORE 1 SCORE 2 SCORE 3 SCORE 4 TOTAL GRADO DE ANGIOGÉNESIS PLEOMORFISMO NUCLEAR De acuerdo al grado de pleomorfismo nuclear un 53% corresponde a un score de 3, un 42% corresponde a un score de 2 y sólo un 6% corresponde a un score de 1. No se observó (0%) un score 4 de pleomorfismo nuclear (Gráfico 23). Un 50% de las placas clasificadas, de acuerdo al pleomorfismo como grado 1 (poco) presentaron grado de angiogénesis moderado y otro 50% un grado de angiogénesis avanzado, no observándose placas con un grado de angiogénesis leve (Gráfico 24). Gráfico 24: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 1 en el Pleomorfismo nuclear

50 0% GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 50% 50% Un 54% de las placas clasificadas como pleomorfismo score 2 (moderado), presentaron un grado de angiogénesis leve, 31% un grado de angiogénesis moderado y solo un 15% grado de angiogénesis avanzado (Gráfico 25). Gráfico 25: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 2 en el Pleomorfismo nuclear 15% GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 31% 54% Un 41% de las placas clasificadas como pleomorfismo score 3 (moderado), 41% presentaron un grado de angiogénesis leve, 41% un grado de angiogénesis moderado y solo un 18% grado de angiogénesis avanzado (Gráfico 26). Gráfico 26: Distribución de placas histológicas según el grado de angiogénesis en el score 3 en el Pleomorfismo nuclear

51 18% 41% GRADO DE ANGIOGÉNESIS Leve Moderado Avanzado 41% Al aplicar la prueba estadística de Chi- cuadrado para establecer asociación entre grado de angiogénesis y pleomorfismo nuclear se obtuvo un valor p = 0.62, por lo que no existe evidencia muestral significativa para afirmar una asociación entre ambas variables (Gráfico 23). Gráfico 27: Asociación entre grado de diferenciación y el Frente de Invasión Tumoral de Bryne Nº DE PLACAS BIEN DIFERENCIADO GRADO DE DIFERENCIACIÓN MODERADAMENTE DIFERENCIADO 8 Y 9 10 Y 11 INDIFERENCIADO 12 Y 13 FRENTE DE INVASIÓN TUMORAL De acuerdo al score total del FIT se establecieron tres categorías, de 8 a 9, de 10 a 11 y de 12 a 13 puntos, para agrupar las placas observadas. Un 43% del total se agrupo en la categoría de 10 a 11 puntos, un 41% en la categoría de 8 a 9 puntos y un 16% en la categoría de 12 a 13 puntos (Gráfico 27).

52 Al aplicar la prueba estadística de Chi- cuadrado para establecer asociación entre grado de diferenciación celular y el frente de invasión tumoral se obtuvo un valor p = 0.728, por lo que no existe evidencia muestral significativa para afirmar una asociación entre ambas variables (Gráfico 27). Al ver la distribución de casos según el sitio anatómico, podemos ver que el sitio de presentación más frecuente es el labio con un 51%, seguido por la encía con un 21%, piso de boca con un 14%, y la mucosa de mejilla y el paladar que tienen una baja frecuencia con un 7% respectivamente (Gráfico 28). Gráfico 28: Distribución de casos según sitio anatómico afectado 21% SITIO ANATÓMICO LABIO ENCIA MUCOSA MEJILLA PALADAR PISO DE BOCA 7% 7% 14% 51% Al aplicar la prueba estadística de Chi- cuadrado para establecer asociación entre el sitio anatómico afectado y el grado de angiogénesis, se obtuvo un valor p = 0.628, por lo que no existe evidencia muestral significativa para afirmar una asociación entre ambas variables (Gráfico 29).

53 Gráfico 29: Asociación entre el grado de angiogénesis y el sitio anatómico afectado GRADO DE ANGIOGÉNESIS LEVE MODERADO AVANZADO 0 LABIO ENCIA MUCOSA MEJILLA PALADAR PISO DE BOCA 7. DISCUSIONES Un aumento en el grado de angiogénesis o microdensidad vascular, se esperaba encontrar en el Frente de Invasión Tumoral de Bryne a medida que aumentaba su Score, al igual que en tumores de mayor indiferenciación o de mayor graduación histológica, categorizados de acuerdo a la Clasificación Internacional de Tumores. Sin embargo, de acuerdo al análisis de los datos obtenidos en el estudio, no existe una asociación

54 estadísticamente significativa entre el grado de angiogénesis, Frente de Invasión Tumoral y el grado de diferenciación celular, por lo que no se acepta la hipótesis alterna. Al analizar la asociación entre el grado de angiogénesis y la Clasificación Histológica Internacional de Tumores no se encontró una asociación estadísticamente significativa (p = 0.687), contrariamente a lo visualizado por Gaiger (Gaiger et al., 2005) y Kurokawa (Kurokawa et al., 2005), quienes observaron en carcinomas grado I y grado II, un menor grado de angiogénesis, con respecto a los carcinomas más indiferenciados. Esto se podría explicar, ya que en este estudio se utilizó la clasificación propuesta por Broder que consta de cuatro grados de diferenciación; sin embargo el sistema utilizado en este trabajo consta solo de tres, en el cual se eliminó el grado pobremente diferenciado, ya que al momento de discernir entre un tumor moderadamente diferenciado y uno pobremente diferenciado se tornaba muy subjetivo, razón por la cual el nuevo sistema eliminó este parámetro (Wahi et al, 1997). Al analizar la asociación con el sistema FIT de Bryne, este no resultó tener una asociación significativa, contrariamente a lo pensado para este trabajo, ya que hipotéticamente al aumentar el Score del FIT debería haber una mayor proliferación de vasos sanguíneos, debido a que los elementos celulares y morfológicos necesitarían una mayor cantidad de sustentos nutricionales y fisiológicos. En 1992 Bryne demostró que el FIT del carcinoma de piso de boca es estadísticamente significativo en relación al grado de angiogénesis (Bryne, M. et al. 1992). Se analizó por separado cada parámetro del FIT de Bryne, donde el patrón de invasión resultó tener un grado de asociación estadísticamente significativo (p = 0.043). Esto concuerda con los resultados expuestos por Bryne (Bryne, M. et al. 1998), donde encontró que el patrón de invasión resultó tener una alta asociación con el grado de angiogénesis, además de ser el parámetro de mayor pronóstico y el pleomorfismo el de menor (Anneroth et al., 1987). No se encontró asociación estadísticamente significativa que nos permitiera establecer una asociación entre grado de angiogénesis y las variables de grado de queratinización, grado de pleomorfismo nuclear y grado de respuesta inmune. Esto difiere con los resultados de otros estudios donde se encuentra asociación

55 con el grado de angiogénesis (Gaiger et al.,2005; Shieh et al., 2004; Tae et al., 2000 ). El porqué de nuestros resultados, se puede explicar por la reducida muestra con que se contó (n = 32), a diferencia de estudios realizados por Sawai (Sawai et al., 2002). donde la muestra constaba con 96 casos, o estudios realizados por Noguchi (Noguchi et al, 2002) quien contaba con 200 casos. La disminución del grado de angiogénesis, podría deberse a que la distribución de casos en las diferentes categorías no es proporcional. La primera y segunda categoría (de 8 a 9 y de 10 a 11 puntos, respectivamente) agrupan al 74.4% de los casos de carcinomas, existiendo sólo cinco casos, representado por el 15.6 % restante, donde sólo uno posee un score mayor a los 12 puntos (tercera categoría). Algo similar podría explicar la disminución y no aumento del grado de angiogénesis al aumentar el score del FIT. Esto difiere de los resultados encontrados por Kurokawa, donde utilizó una muestra homogénea de pacientes para cada grupo de Score del FIT, dando una asociación estadísticamente significativa con el grado de angiogénesis (Kurokawa et al., 2005). Estos resultados en general confusos, pueden deberse probablemente a la ausencia de un protocolo estandarizado de la evaluación de grado de angiogénesis, el cual crea dificultades al momento de distinguir entre vasos sanguíneos preexistentes y la formación de nuevos vasos sanguíneos, o la falta de diferenciación entre vasos sanguíneos y vasos linfáticos observados microcópicamente (Shieh et al., 2004). La mayor dificultad concierne a la baja reproductibilidad de los métodos utilizados para la evaluación de la actividad angiogénica de los tejidos neoplásicos. El método más utilizado ha sido introducido por Weidner (Weidner et al., 1991), que consiste en el conteo de los vasos sanguíneos, determinando un grado de angiogénesis y considerando este número como potencial angiogénico de la neoplasia (Ascani et al, 2005). Al contrario de la gran mayoría de estudios revisados, en el presente no logramos demostrar una asociación entre el grado de angiogénesis y el grado de diferenciación y sistema de graduación del frente de Invasión Tumoral, al ser analizado con la totalidad de los elementos morfológicos que lo constituyen. Sólo se encontró una relación