Centro: Facultat de Ciències de la Salut i de la Vida. Universitat Pompeu Fabra

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José Manuel Cordero Escobar
hace 8 años
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1 IDENTIFICACIÓN DE LOS FACTORES CELULARES QUE INTERACCIONAN CON LA PROTEÍNA VIF DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA Investigador principal: Dr. Juan Sayós Ortega Centro: Facultat de Ciències de la Salut i de la Vida. Universitat Pompeu Fabra Duración: 3 años MEMORIA FINAL 1. Resumen El factor de infectividad vírico (VIF) es una de la seis proteínas reguladoras codificadas por el virus de la inmunodeficiencia adquirida humana (VIF). VIF parece ser esencial para la replicación del virus, pero su mecanismo bioquímico y su regulación y función son aún desconocidos. VIF no muestra homología de secuencia significativa con ninguna otra proteína de función conocida, pero la presencia de un cierto número de posibles motivos de unión, muy bien conservados incluso en la proteína del virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS) sugieren que esta molécula ejerce su función interaccionando con componentes celulares y víricos. VIF contiene un motivo rico en prolinas capaz de unir dominios 1

Resumen El factor de infectividad vírico (VIF) es una de la seis proteínas reguladoras codificadas por el virus de la inmunodeficiencia adquirida humana (VIF).

2 SH3, dos motivos ITIM Like con capacidad de interaccionar con dominios SH2, y un cierto número de residuos serina y treonina que pueden ser fosforilados por la enzima celular ERK2. La importancia de estas causas queda patente por el hecho de que su eliminación supone la abolición casi por completo de la replicación del virus. Nuestro objetivo inicial era la identificación de las proteínas celulares con capacidad de unirse a VIF. Para llevar a cabo este proyecto, decidimos emplear el sistema de dos y tres híbridos en levadura con el objetivo de clonar moléculas que interaccionasen con VIF. El sistema de dos híbridos permite identificar interacciones que no se basan en modificaciones postraduccionales. Para hallar las interacciones basadas en la fosforilación de residuos tirosina, serina y treonina se utilizó la técnica de tres híbridos expresando en levaduras enzimas capaces de fosforilar residuos aminoacídicos específicos de VIF. Desafortunadamente, ninguno de los cribados realizados con estos sistemas identificaron proteínas celulares con capacidad de unión a VIF. Por dicha razón cambiamos de estrategia, incorporando el sistema de dos híbridos Cytotrap al proyecto. El motivo principal se debe a que ciertas interacciones proteína-proteína detectadas con el sistema de los dos híbridos Gal4 no se detectan por el sistema Cytotrap, y viceversa. Empleando ambos sistemas incrementamos, por tanto, las posibilidades de identificar proteínas celulares que se unen a VIF. Este sistema se basa en la obtención de dos proteínas de fusión que al interaccionar entre ellas en el citoplasma de la levadura activan la vía de señalización del gen Ras, induciendo el crecimiento de la levadura. Este sistema emplea la cepa de levadura cdc25h que contiene una forma mutada del gen CDC25, ortólogo del gen Sos humano. Esta cepa puede crecer a la temperatura de 25 ºC, pero no a la temperatura restrictiva de 37 ºC. El cdna que codifica por una proteína de interés (VIF) es clonado en el vector psos para obtener una proteína de fusión hsos-vif. Paralelamente, una genoteca de cdna es clonada en el vector pmyr, generando una serie de proteínas con una señal de miristilación que provocará su anclaje a la membrana plasmática. 2

Nuestro objetivo inicial era la identificación de las proteínas celulares con capacidad de unirse a VIF.

3 Al coexpresar en levadura ambas construcciones, si VIF es capaz de interaccionar con alguna de las proteínas ancladas en la membrana, ello provocará que hsos se asocie a la membrana y se active, permitiendo el crecimiento de la cepa cdc25h a la temperatura restrictiva de 37 ºC. 2. Resultados El principal resultado del presente estudio ha sido la identificación mediante un cribado a través del sistema de Cytotrap de una serie de proteínas celulares con capacidad de unión a la proteína vírica VIF. De estas moléculas, sólo por dos (BIP y HSP70) obtuvimos más de un clon en el cribado (5 y 2, respectivamente). Por las otras proteínas (Vimentin, 26S proteasome subunit 5A [S265a], Mcm6 y trna aspartil sintetasa [AspRS]) sólo se identificó un clon. Este hecho nos llevó a centrar nuestros esfuerzos en BIP y HSP70. BIP y HSP70 pertenecen a la familia de las chaperonas HSP70. Dicha familia de proteínas se encuentra involucrada en una enorme variedad de procesos celulares, tales como el correcto repliegue (folding) de proteínas sintetizadas de novo, de proteínas desnaturalizadas por estrés, de la translocación a través de membranas, así como una gran variedad de procesos relacionados con la transducción de la señal, regulación del ciclo celular y apoptosis. Estas proteínas poseen una región N-terminal con un dominio ATPasa y una región C-terminal que incluye el dominio de unión al sustrato. Todos los clones obtenidos con el cribado por HSP70 y BIP codificaban por la región C-terminal. 3

Resultados El principal resultado del presente estudio ha sido la identificación mediante un cribado a través del sistema de Cytotrap de una serie de proteínas celulares con capacidad de unión a la

4 hsp70.1a N - ATPase domain Substrate binding domain N - Clones hsp70.1a (_2) Para validar estas interacciones en levaduras, comprobamos si una proteína recombinante era capaz de coprecipitar con BIP y HSP70. En estos experimentos utilizamos una enzima denominada apirasa, que añadida a los lisados celulares inhibe la degradación del ATP presente en la muestra. De esta manera, lo que se hace es mantener la unión de ATP a las proteínas HSP70 y BIP. El resultado esperado, por tanto, sería que la unión de a HSP70 y BIP se viese incrementada en las muestras no tratadas con apirasa. Este resultado es el que obtuvimos con BIP, pero curiosamente, no funcionó de igual modo por HSP70. Este hecho conllevó que centrásemos nuestro interés en la interacción BIP-VIF. PULL-DOWN Control BIP HSP70 Lysate Mr (K) BIP HSP70 Apyrase 97 BIP BIP HSP70 54 WB Anti-FLAG (M-5) WB Anti- BIP, también denominada GRP78, es una proteína con varias funciones. BIP se encuentra en el retículo endoplásmico unido a una serie de proteínas (PERK, IRE1 y ATF6). Tal unión mantiene inactivas estas moléculas. La aparición de una nueva proteína capaz de unirse a BIP produce la disociación de los complejos anteriores y el inicio de una 4

En estos experimentos utilizamos una enzima denominada apirasa, que añadida a los lisados celulares inhibe la degradación del ATP presente en la muestra.

5 respuesta de estrés celular (UPR). Esta respuesta trata de promover la supervivencia de la célula ante una situación de estrés. Si dicha supervivencia no es posible, entonces se induciría la apoptosis celular. Nuestra hipótesis en este punto era que VIF podía inducir una respuesta de estrés celular por secuestro de BIP. Para la comprobación de la hipótesis, diseñamos una serie de ensayos funcionales para estudiar si la sobreexpresión de VIF en diversos tipos celulares podía inducir UPR. Así, estudiamos si se incrementaba tanto la expresión de una serie de proteínas como su estado de fosforilación. Estas moléculas son el propio BIP, GADD153, eif2_ y PERK. Desdichadamente, en ninguno de los experimentos realizados se detectó incremento en los niveles de expresión de BIP y GADD153. De igual forma, la expresión de hvif y/o EGFP-VIF no indujo la fosforilación de eif2_ o PERK. Debido a que la respuesta de estrés generada por la unión de VIF a BIP debería producir un incremento en la expresión de una serie de genes, analizamos a través de microarrays de cdna el patrón de expresión de genes diferentes después de la transfección de VIF en células HEK. Para llevar a cabo este experimento, células HEK fueron transfectadas con EGFP-VIF y como control utilizamos un vector vacío (pcdna3) y la proteína EGFP. Las células transfectadas fueron lisadas y obtenido el RNA. Este RNA fue hibridado con un microarray de Agilent (Agilent human 22K v2 array). Ninguno de los genes que se han descrito cambia su expresión en respuesta al estrés celular ni mostró diferencias significativas en su expresión en células transfectadas con EGFP vs EGFP-VIF. Estos resultados nos confirmaron que la unión de VIF a BIP no parece tener ninguna clase de influencia con la respuesta a estrés inducida por BIP. 5

Para la comprobación de la hipótesis, diseñamos una serie de ensayos funcionales para estudiar si la sobreexpresión de VIF en diversos tipos celulares podía inducir UPR.

6 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Cuando este proyecto fue presentado a la Fundació La Marató de TV3 para optar a ser financiado, aún no se había identificado APOBEC3G como el principal factor celular relacionado con la función de VIF. Ahora sabemos que APOBEC3G desempeña un papel antivírico, produciendo la hipermutación del RNA del virus VIH y, por tanto, da lugar a la formación de viriones defectivos. La función de VIF consistiría en bloquear la actividad antivírica de APOBEC3G y, por tanto, facilitar la producción de viriones productivos. A pesar de que en los últimos dos años han proliferado los estudios sobre VIF y APOBEC3G, todavía no está claro el mecanismo por el que VIF bloquea la actividad de APOBEC3G. No podemos descartar que la interacción entre BIP y VIF pueda desempeñar un papel en este mecanismo. Debe averiguarse la significación fisiológica de la unión de VIF a BIP para poder saber si existe la posibilidad de diseñar en el futuro estrategias antivíricas basadas en dicha interacción. 6

Ahora sabemos que APOBEC3G desempeña un papel antivírico, produciendo la hipermutación del RNA del virus VIH y, por tanto, da lugar a la formación de viriones defectivos.

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