MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Curso (grupo 1)

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1 Tema 7.- Esterilización, desinfección y asepsia. Esterilización, desinfección, descontaminación y antisepsis. Desinfectantes y antisépticos. Evaluación de la actividad germicida. Desinfectantes de alta, media y baja actividad. Desinfección de endoscopios. Esterilización por calor. Esterilización por óxido de etileno. 1.- ESTERILIZACIÓN, DESINFECCIÓN, DESCONTAMINACIÓN Y ANTISEPSIS. En todos los ambientes abiertos y en muchos lugares del cuerpo se puede encontrar una gran cantidad de microorganismos (principalmente bacterias y virus). Estos microorganismos, si tienen a su disposición nutrientes y condiciones ambientales adecuadas pueden crecer y multiplicarse produciendo en su caso enfermedades infecciosas. En los ambientes naturales hay mezclas complejas de muchos tipos de microorganismos que forman poblaciones que comparten el mismo ambiente. Con objeto de evitar los efectos nocivos de los microorganismos, es necesario disponer de métodos que permitan eliminarlos de manera que podamos conseguir ambientes limpios sin contaminación microbiana. Se dice que un ambiente es estéril cuando se han eliminado todos los microorganismos del mismo. La esterilidad se puede alcanzar usando procedimientos físicos (calor, radiaciones), químicos o mecánicos (filtración). Sin embargo, los procedimientos de esterilización son costosos y, en ciertas ocasiones, desaconsejables. Por ejemplo, la esterilización completa de ciertos alimentos no es posible sin destruir sus características nutritivas. Por su parte, la antisepsis es la técnica que permite eliminar los microorganismos de la piel o de los tejidos vivos. En la práctica es imposible afirmar la ausencia absoluta de microorganismos en una muestra determinada. En este sentido, se considera que un producto está estéril desde el punto de vista clínico cuando existe menos de una posibilidad ente un millón (10-6 ) de que existan en él microorganismos viables. También se usa el término desinfección referido a la técnica que empleando calor o substancias químicas reduce la carga microbiana o elimina los microorganismos de las superficies. Un término parcialmente sinónimo es el de descontaminación que es un poco más general ya que en él se aplican además del calor, otros métodos de eliminación de microorganismos. Se dice que un ambiente es aséptico cuando se han eliminado todos los microorganismos patógenos. Un ambiente aséptico no tiene porqué ser estéril. La asepsia también se puede conseguir por procedimientos físicos y químicos. LIMPIEZA La limpieza tiene por objetivo dejar un objeto libre de contaminación. En algunas ocasiones es suficiente con la limpieza en el medio hospitalario; sin embargo, en otras es necesario proceder a la desinfección o a la esterilización. Nada debe ser sometido a procedimientos de desinfección o esterilización si no ha sido sometido anteriormente a limpieza manual o a limpieza mecánica (con lavadoras). 1

2 En el medio hospitalario, los principales agentes de limpieza son: Hipoclorito sódico Derivados fenólicos Complejos trialdehídicos quirúrgicos Polvo abrasivo clorado Por otra parte, la limpieza en el medio hospitalario será diferente si se trata de: Zonas sin contacto con enfermos Zonas de hostelería y lavandería Servicios y cuartos de baño Áreas de hospitalización, consultas externas y servicios generales Áreas críticas (quirúrgicas, intensivos, prematuros, hemodiálisis, quemados, diagnósticas intervencionistas) Banco de sangre, laboratorios, hospital de día, urgencias, habitaciones con aislamiento indicado. El personal de enfermería debe vigilar de forma personal la limpieza de su área asistencial. La limpieza del material hospitalario en muchas ocasiones requiere personal especializado adiestrado en el manejo de aquellos materiales que por ser huecos (botellas) o tubulares con diámetro pequeño (canales de endoscopía por ejemplo) presentan dificultades especiales. CLASIFICACIÓN DE LOS MATERIALES SEGÚN SU USO Los equipos que se reutilizan en los hospitales se pueden clasificar según su aplicación en: Elementos críticos que entran en contacto con el sistema vascular u otras zonas estériles del cuerpo (catéteres intravasculares) Elemento semicrítico que entra en contacto con la mucosa (tubos endotraqueales) Elementos no críticos que entran en contacto con la piel intacta (cuña de orina) Todos los elementos que vayan a ser reutilizados deben ser limpiados previamente. Además, los elementos críticos deben ser esterilizados, los semicríticos sometidos a una desinfección de alto grado y los no críticos a una desinfección de bajo grado. 2.- DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS Se denominan antisépticos aquellos compuestos químicos que desarrollan su acción letal inteaccionando de forma inespecífica con los componentes celulares de forma que no existe una acción selectiva frente a grupos de microorganismos sino que su acción es más general. Los antisépticos no suelen ser demasiado tóxicos y pueden aplicarse sobre tejidos vivos. Esta falta de especificidad de los antisépticos los diferencia de los antibióticos cuya principal característica es la selectividad. Los desinfectantes son productos químicos que matan los microorganismos y se aplican sobre objetos inanimados, mientras que los antisépticos, por su menor 2

3 toxicidad, se emplean sobre tejidos vivos. Puesto que dependiendo de la forma como se realice el tratamiento un mismo agente puede utilizarse como antiséptico o como desinfectante, se suele usar el término germicida para englobar ambos conceptos. Los diferentes tipos de microorganismos o de sus formas de desarrollo (esporas vs. células vegetativas) tienen diferentes grados de sensibilidad a los tratamientos físicos o químicos. En muchos casos, el tratamiento con agentes desinfectantes no elimina completamente los microorganismos presentes, sino que simplemente se reduce mucho su número de forma que la acción indeseable de los microorganismos se retrasa. Las esporas bacterianas son las formas más resistentes a los antisépticos y desinfectantes y sólo mueren al ser tratadas con agentes con alta actividad germicida. En general las formas vegetativas de las bacterias son sensibles a todos los agentes desinfectantes, aunque algunos grupos de microorganismos tales como las micobacterias pueden presentar especial resistencia a los de baja actividad. Los hongos presentan, en general, mayor resistencia que las bacterias y resisten los desinfectantes de baja actividad. Por último, los virus presentan una sensibilidad similar a la de las bacterias, aunque es un poco más elevada en el caso de los virus desnudos que no presentan envueltas lipídicas. 3.- EVALUACIÓN DE LA A CTIVIDAD GERMICIDA. La determinación del efecto antiséptico o desinfectante de los diferentes productos es complicada porque este efecto depende de gran número de factores externos (temperatura, humedad, ph, etc.) así como de los diferentes tipos de microorganismos que se desea eliminar o controlar. Existen protocolos que regulan cómo se debe evaluar la eficacia de un compuesto germicida y entre ellas destaca la prueba del coeficiente del fenol (CF) en la que se toma como referencia de desinfectante el fenol y como referencia de microorganismos Staphylococcus aureus y Salmonella typhi. CF = dil fenol / dil desinf (Ecuación 17) donde dil fenol es el inverso de la mayor dilución del fenol que elimina completamente la bacteria de referencia en 10 min de tratamiento, y dil desinf es la mayor dilución del desinfectante que elimina el microorganismo de referencia en 10 min de tratamiento realizado el estudio de los supervivientes tras un cultivo de 48h 1. El valor de CF es simplemente indicativo ya que se trata de una medida realizada sobre cultivos puros y en la realidad, los germicidas se usan sobre poblaciones mixtas. Para evaluar la acción de un germicida frente a un microorganismo en particular se realizan test de dilución similares a los realizados para los antibiogramas cualitativos o cuantitativos. En función de su CF, los germicidas se clasifican en de actividad alta, media o baja. Si se desea realizar una esterilización se deberán escoger germicidas de actividad más alta o a mayores concentraciones. Igual ocurre si en la muestra existen substancias que protegen a los microorganismos de la acción de los germicidas (como ocurre en el caso de la sangre o en las heces). 1 Por ejemplo, si dil fenol es 1/90 y dil desinf es 1/450, el cf será de 50; esto es, el desinfectante es 50 veces más activo que el fenol. 3

4 4.- DESINFECTANTES DE ALTA, MEDIA Y BAJA ACTIVIDAD. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA DESINFECCIÓN Los factores que afectan la eficiencia de un proceso de desinfección son los siguientes: naturaleza del microorganismo, su número, la concentración del germicida,. el tiempo de actuación, la temperatura, ph, el deterioro del producto en agua o por almacenamiento, la inactivación por la presencia de materia orgánica (moco, pus, heces, agua dura, etc.), la presencia de otros compuestos que modulen la actividad del germicida (detergentes, corcho, etc.) y las características de la superficie sobre la que se aplica. PRINCIPALES FAMILIAS DE AGENTES ANTISÉTICOS Agentes oxidantes Halogenados Gas cloro, y Compuestos de cloro ( mg/l), agentes oxidante que se usa para desinfectar el agua. Soluciones de iodo, agente oxidante que inactiva las proteínas, se usa en la piel, jabones, etc. La tintura de iodo es una solución al 2% (o más) de yoduro potásico en agua y etanol (CF ) Solución de iodo, se usa en instrumental médico Povidona yodada (Betadine) que es un complejo de iodo con polivinilpirrolidona de forma que se libera el germicida lentamente, se inactiva menos por materia orgánica y penetra mejor. Se utiliza en desinfección de la piel e incluso en lavados quirúgicos. Bromo Flúor Otros oxidantes Permanganato potásico Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) en disolución del 6 al 30% (para esterilización en este caso), es una agente oxidante que se usa sobre la piel. Ácido peracético Sales del ácido persulfúrico Agentes reductores Aldehídos tales como el formaldehído (6-8%) y el glutaraldehído (2%) que inactivan las proteínas y se pueden usar como agentes esterilizantes. Se suelen usar para esterilizar instrumental como soluciones acuosas. El glutaraldehído a ph alcalino (Cidex) permite una desinfección de alto grado y se aplica al material que no puede ser sometido al autoclave. Es un compuesto tóxico e irritante que hay que utilizar de acuerdo con unos procedimientos especiales. Alcoholes Etanol 4

5 Solución de alcohol al 70% en agua (CF 0.04), disuelve los lípidos y desnaturaliza las proteínas, se usa sobre la piel. Alcohol isopropílico Fenol y derivados Compuestos fenólicos (0.5-3%), agentes oxidantes que se usan para desinfectar superficies. El fenol fue históricamente el primer agente antiséptico utilizado en clínica. Actualmente no se emplea en clínica sino que se usan en hospitales y laboratorios derivados fenólicos menos cáusticos. Los cresoles (Lysol, CF 2.3) que tienen importancia por ser tuberculocidas y activos durante largo tiempo; sin embargo, su olor es desagradable y pueden llegar a ser tóxicos. El hexaclorofeno (CF 5-15 para S. typhi y para Staph. aureus) es una agente muy activo que perdura durante largo tiempo. Se usa solo para desinfectar departamentos infantiles después de brotes con estafilococos. Sin embargo, puede ser tóxico y por eso su uso es limitado. Bifenoles, rompen la membrana celular y se usan en jabones y lociones. Agentes tensoactivos Sales de amonio cuaternario Tensoactivos anfóteros Derivados minerales y organomin erales Dicloruro de mercurio, inactiva las proteínas y se usa para desinfectar mesas, suelos y otras superficies. Compuestos organomercuriales, actúan inhibiendo las proteínas, se emplean en uso tópico (por ejemplo, la mercromina o mercurocromo CF de 2.7 para S. typhi a 5.3 para Staph. aureus) Sulfato de cobre, precipita las proteínas y se usa como alguicida y como antifúngico. Nitrato de plata, precipita las proteínas. Se usa como solución al 1% en ojos de recién nacidos para evitar la ceguera producida por N. gonorrhoeae o por C. trachomatis. Clorhexidina antiséptico que combina la acción germicida de los compuestos yodados y la permanencia del hexaclorofeno. Es un bactericida eficaz, aunque tiene menos eficacia sobre micobactrias y sobre esporas. Se usa en la desinfección de la piel al 5%, en la de la boca ( %) y en jabones. N-duopropenida compuesto formado por dos yoduros de amonio cuaternario con gran actividad y rapidez frente a bacterias y hongos, aunque menos activo frente a micobacterias. Es de baja toxicidad por lo que puede usarse para la esterilización de endoscopios. 5

6 5.- DESINFECCIÓN DE ENDOSCOPIOS La esterilización de endoscopios es muy importante porque pueden ser un elemento de transmisión de procesos infecciosos tales como la hepatitis B o C, VIH o micobacterias. El desinfectante que se emplee debe ser rápido y enérgico, capaz de destruir las micobacterias no tuberculosas y Mycobacterium tuberculosis sin dañar el instrumento. El desinfectante más aconsejado es el glutaraldehído alcalino o la N-duopropenida. 6

7 Antisépticos y Desinfectantes usados en aplicaciones relacionadas con la salud Agente Uso en campos relacionados con la salud Modo de acción Antisépticos Mercuriales orgánicos Piel Se combina con grupos SH de las proteínas Nitrato de plata Ojos de los recién nacidos para evitar la Precipita proteínas ceguera Solución de iodo Piel Ioda los residuos de tirosina de las proteínas Jabones, desodorantes y lociones corporales Agente oxidante Alcohol (etanol al 70% en agua) Piel Disolvente de lípidos y desnaturalizante de proteínas Bifenoles (Hexaclorofeno) Jabones, lociones Rompe la membrana celular Peróxido de hidrógeno (solución al 3%) Piel Agente oxidante Desinfectantes Dicloruro mercúrico Mesas, superficie de los bancos, suelo Se combina con grupos SH Solución de Yodo Instrumental metálico Ioda los residuos de tirosina Gas cloro Depuración de los suministros de agua Agente oxidante Compuestos de cloro Suministros de agua Agente oxidante Compuestos fenólicos Superficies Desnaturaliza proteínas Detergentes catiónicos (compuestos de amonio cuaternario) Instrumental médico Interacciona con los fosfolípidos de la membrana Óxido de etileno Material de laboratorio sensible a la Agente alquilante temperatura como los plásticos Ozono Agua de bebida Fuerte agente oxidante

8 6.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR. MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Los microorganismos mueren rápidamente cuando son sometidos a temperaturas superiores a su óptima de crecimiento. Esto permite utilizar altas temperaturas para eliminar microorganismos por termodestrucción. Los métodos basados en el calor son quizá los más utilizados para controlar el crecimiento microbiano. La sensibilidad de los diferentes tipos de microorganismos a los tratamientos térmicos es distinta. Las esporas y algunos virus son la formas más termorresistentes y las células vegetativas las más sensibles. Por otro lado, los microorganismos Grampositivos tienden a ser más resistentes que los Gram-negativos. Por consiguiente, desde un punto de vista práctico, la esterilización por calor está destinada a matar las esporas bacterianas. El medio en el que se encuentra un microorganismo influye en su sensibilidad al calor. Por lo general, los microorganismos son más sensibles a las altas temperaturas cuando se encuentran a phs ácidos, mientras que las concentraciones altas de proteínas o azúcares en el medio disminuyen la efectividad del calor y protegen a las bacterias. Las altas concentraciones de sal tienen efectos variables según el tipo de microorganismo La esterilización por calor se puede hacer usando calor seco o calor húmedo. ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO Horno Pasteur: usa calor seco transmitido por el aire al objeto en esterilización. En este caso, la temperatura más usual suele ser de 160ºC y durante dos horas. El uso del horno Pasteur está limitado por las características del material a esterilizar y se usa de forma limitada para la esterilización de objetos metálicos y de vidrio y para algunos productos secos que no puden mzclarse con el agua. Flameado: tiene usos muy limitados. ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO El autoclave esteriliza usando el calor húmero transmitido por vapor de agua sobrecalentado debido al uso de altas presiones. El efecto del vapor de agua es facilitar la transmisión del calor al objeto en esterilización. El procedimiento usual es usar 121ºC para lo que es necesaria una presión de 1.1 kg/cm 2. En estas condiciones un tratamiento de 15 min es suficiente para eliminar las esporas de Gram-positivos. También puede usarse un ciclo más rápido de 134ºC y 3 min. En los autoclaves modernos es posible secar el producto una vez esterilizado antes de sacarlo del autoclave. Una versión reducida del autoclave es una olla a presión doméstica que, sin embargo, tiene el inconveniente e que no es posible secar el producto. Para evitar que los productos esterilizados en el autoclave se humedezcan con el vapor de agua se deben empaquetar en bolsas impermeables de papel Kraft o de poliamida.

9 Puesto que el tratamiento térmico puede alterar las características del producto tratado, en el caso de alimentos o de productos termosensibles, se han desarrollado diferentes tipos de tratamiento industriales entre los que destacan: La Pasteurización destinada a reducir las poblaciones bacterianas. Se emplea principalmente en el tratamiento de alimentos (por ejemplo, leche) y tiene muy poca utilidad en clínica. La pasteurización de la leche se realiza a 71ºC durante 15 seg. y el tratamiento UHT consiste en calentar el producto a ºC durante unos pocos segundos. Este tratamiento permite un tiempo de conservación del producto mucho más largo (hasta 8 semanas). CINÉTICA DE TERMODESTRUCCIÓN: VALORES D YZ. La muerte de microorganismos como consecuencia de un tratamiento a altas temperaturas sigue una cinética exponencial. Si representamos la variación del logaritmo del número de células supervivientes a un tratamiento térmico realizado a una temperatura dada en función del tiempo de tratamiento, se obtiene recta cuya pendiente nos indica la velocidad de termodestrucción. Se define el valor D como el tiempo necesario para que el número de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del número de supervivientes se reduzca en una unidad). Si consideramos N 0 como el número de células al inicio del tratamiento y N x el número de células supervivientes después de un tratamiento de t minutos a una temperatura T, el tiempo de termodestrucción se calcula de la siguiente manera:

10 La magnitud de D es tiempo (en muchos casos se usan los min; pero ciertos tratamientos son tan efectivos que resulta más práctico usar los s, que, por otra parte, son unidades del SI). El tiempo de termodestrucción (D) varía para cada temperatura (de ahí el subíndice t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas. Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma logarítmica. De manera análoga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para lograr que el número de supervivientes se redujera al 10% de la población inicial, el valor z indica el incremento en la temperatura (medida en número de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la décima parte del inicial. z = T / [log (D t1 / D t2 )] donde T es el incremento de temperatura, y D T1 y D T2 los valores de D a las dos temperaturas estudiadas. Los valores D y z varían para cada microorganismo y para cada condición. Las esporas, por ejemplo, tienen valores D mucho más altos que las células vegetativas de los mismos microorganismos. Cuando el valor tratamiento se realiza a 121.1ºC (250ºF) al valor D se le denomina D r y, por tanto, representa el tiempo necesario para lograr la destrucción del 90% de las células del microorganismo tratado a esa temperatura. 7.- ESTERILIZACIÓN POR ÓXIDO DE ETILENO Óxido de etileno (OE), agente alquilante que se usa en la esterilización del material de laboratorio, material de plástico y en general para aquellos productos que no pueden ser esterilizados por calor.

11 La esterilización se lleva a cabo en un esterilizador similar a un autoclave que controla la concentración de óxido de etileno, la temperatura (60ºC) y la humedad (esterilización en condiciones de alta humedad). El OE puede usarse puro (la duración del tratamiento en este caso es de 3-4 horas) o como mezcla de OE al 10-20% con CO 2 u otro gas reductor porque el OE es explosivo. El tratamiento dura varias horas. Se usa también en disoluciones de mg/l. El OE es muy tóxico; pero se diluye rápidamente en el aire, lo que permite su eliminación fácil después del tratamiento.

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