PROCEDIMIENTOS BASICOS DE MICROBIOLOGÍA Y MORFOLOGIA BACTERIANA

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1 PROCEDIMIENTOS BASICOS DE MICROBIOLOGÍA Y MORFOLOGIA BACTERIANA I.- INTRODUCCIÓN DEFINICIONES: La esterilización: elimina todas las formas viables de las bacterias, virus y hongos, así como de sus formas de resistencias (esporas). La desinfección: sólo elimina las formas patógenas. Asepsia: condiciones en las cuales hay ausencia de patógenos. Sustancias bacteriostáticas: aquéllas que inhiben el desarrollo de bacterias. Sustancias bactericidas: aquéllas que matan bacterias. La esterilización y desinfección conllevan generalmente a la destrucción, eliminación o inhibición de los microorganismos y constituyen los principales medios para prevenir infecciones en los hospitales. Generalmente se realiza ésto mediante tres tipos de agentes: 1) Agentes Físicos 2) Agentes Químicos 3) Agentes Mecánicos ESTERILIZACION La esterilización se define como la destrucción completa o eliminación total de los microorganismos patógenos y saprófitos que se encuentran en el interior o en la superficie de objetos y sustancias. El criterio práctico de la esterilidad es la ausencia de crecimiento microbiano en un medio adecuado. La eliminación de los microorganismos puede efectuarse mediante procesos físicos, mecánicos o químicos. Los métodos físicos y mecánicos se incluyen en el término esterilización y los métodos químicos en el concepto de desinfección. El método escogido para esterilizar un producto depende fundamentalmente de su naturaleza y estabilidad frente al calor u otros agentes esterilizantes. Así por ejemplo, cuando necesitemos agregar suero equino a un medio de cultivo líquido, para enriquecerlo, no podemos aplicar calor para esterilizarlo, ya que se produciría la coagulación de las proteínas del suero alterando su composición. Situación semejante ocurre con otras sustancias o materiales termolábiles, para los cuales se utilizan métodos de esterilización que no alteren su estabilidad, uniformidad o identidad de dichas sustancias o materiales. CLASIFICACION DE LOS METODOS DE ESTERILIZACION

2 1. METODOS FISICOS: se basan en la aplicación de agentes físicos naturales como por ejemplo temperatura ( calor ), luz, radiación UV, radiación ionizante, etc. Los métodos físicos conducen a lo que se designa con el nombre de asepsia, es decir ausencia total de microorganismos patógenos y saprófitos. 2. METODOS QUIMICOS: se consigue detener el metabolismo bacteriano a través de sustancias químicas como por ejemplo óxido de etileno, fenol, alcohol, halógenos, tensioactivos, etc. Los métodos químicos conducen a la antisepsia ( impedimento o retraso del desarrollo de microorganismos patógenos en relación con organismos vivos ) y/o a la desinfección (destrucción de microorganismos patógenos y saprófitos sobre objetos o superficies inanimadas ) 3. METODOS MECANICOS: las sustancias que no se pueden esterilizar por métodos físicos ni químicos, se pueden esterilizar por un método mecánico como es la filtración. Se basa en procesos físico-químicos observados entre los cuerpos microbianos o elementos en suspensión y una sustancia semiporosa. Así se consigue separar y retener los microorganismos de los líquidos que los contienen. Los líquidos a filtrar deben atravesar por presión o vacío pequeños canalículos a nivel de cuyas paredes los microorganismos son retenidos por adsorción. En el mecanismo de adsorción influyen los siguientes factores: viscosidad del líquido, ph, cargas eléctricas, tiempo y temperatura. Los filtros ( de asbesto, vidrio, porcelana, celulosa ) tienen un diámetro de poro inferior al diámetro de las bacterias. Un tamaño de poro de 0.22 um es capaz de retener bacterias y sus esporas ( no retienen virus ) Métodos Físicos I. CALOR SECO - El mecanismo de esterilización del calor seco es producir un aumento de las reacciones de oxidación de los microorganismos. A. A la llama La destrucción de los microorganismos mediante la llama es un procedimiento muy eficaz cuando el material a esterilizar es indestructible o se va a inutilizar. Se usa para esterilizar el asa de platino que se calienta al rojo blanco ( C ), espátulas, pinzas, pipetas, bocas de tubo o matraces, etc., empleando la llama del mechero Bunsen por un tiempo de exposición de 10 segundos ( también se denomina flameado ) Cuando además de matar las bacterias, se destruye mediante el fuego el material que las contiene, se habla de incineración. Este procedimiento se utiliza para destruir animales muertos de enfermedades contagiosas, ropa, vendas y objetos altamente contaminados. B. Por aire caliente El aire caliente confinado a temperatura de 160 a 180 C mantenido durante 1 hora, destruye con seguridad todas las bacterias y sus esporas. Para su aplicación se recurre al uso del horno de aire caliente, siendo el más usado el horno Pasteur que tiene como fuente calórica una resistencia eléctrica que esta ubicada en la parte inferior de la cámara.

3 - El horno Pasteur se utiliza para esterilizar material de vidrio ( tubos, placas Petri, matraces, etc ), de porcelana, de acero y otros materiales inalterables a esa temperatura. - Nunca se emplea para esterilizar material plástico ni medios de cultivo. II. CALOR HUMEDO - El mecanismo de esterilización del calor húmedo es producir la coagulación de las proteínas del protoplasma bacteriano y de los ácidos nucleicos, destruyendo las membranas celulares. Se considera un método más efectivo que el calor seco por su mayor poder de penetración Por agua en ebullición El agua en ebullición ( 100 C ) es suficiente para matar formar vegetativas de bacterias, pero no sus esporas. Se utiliza para esterilizar jeringas, agujas, pinzas, etc. que se sumergen en una baño con agua a ebullición por aproximadamente 10 a 20 minutos. 2.2 Por vapor fluente Se utiliza para la esterilización de instrumentos de cirugía, equipos de lechería, equipos de la industria de alimentos, etc. Se alcanza una temperatura de aproximadamente 100 C si se mantiene sin presión y a nivel del mar. Una exposición por 15 minutos es suficiente para destruir la forma vegetativa de las bacterias, pero no sus esporas Por vapor de agua a presión Las esporas de algunas bacterias son capaces de resistir los 100 C. La esterilidad completa sólo se alcanza con el uso de calor húmedo a temperaturas más altas, en la forma de vapor saturado bajo presión. En ausencia de aire, el vapor a presión tiene una temperatura constante. Por lo tanto, si conocemos la presión podemos fácilmente saber la temperatura que alcanza el vapor: * vapor a 121 C se obtiene con 1 atmósfera o 15 libras /(pulgada) 2 - En el laboratorio el vapor a presión se utiliza para esterilizar medios de cultivo, artículos de plástico o polipropileno, soluciones, etc. para los cuales no se puede utilizar calor seco. - Los equipos empleados para la esterilización, bajo estas condiciones, se denominan Autoclaves. - Existen distintos modelos ( de carga vertical u horizontal ), pero en general todos tienen las siguientes partes: fuente calórica ( gas, resistencia eléctrica o red de vapor ), manómetro ( con una escala lb/in 2 o Kg/cm 2 o atmósferas ), termómetro, llave de escape de vapor, válvula de seguridad, llave de descarga de agua, llave de entrada de agua. III. RADIACIONES - La radiación es absorbida por el ADN de los microorganismos, produciendo mutaciones letales o modificaciones químicas del ADN de manera de interferir con su multiplicación. También inducen la formación de sustancias químicas como oxhidrílos y

4 átomos de hidrogeno, altamente reactivos con los procesos celulares vitales. La radiación ultravioleta actúa directamente sobre el ADN, por producción de peróxidos orgánicos en los líquidos que contienen oxígeno y compuestos orgánicos. A. Luz solar La luz solar tiene una propiedad bactericida muy eficaz, especialmente entre longitudes de onda de a Angstroms. Las bacterias esporógenas son más resistentes que las asporógenas. Lo mismo sucede con las bacterias fluorescentes que convierten las ondas cortas ( germicidas ) en ondas largas de menor actividad. No es de mucha utilidad su acción esterilizante en el laboratorio. B. Radiación ultravioleta Los rayos UV tienen escaso poder de penetración, lo que hace que ejerzan su acción principalmente sobre la superficie del material expuesto a la irradiación, lo que explica su baja utilidad en el laboratorio. Generalmente se utilizan lámparas que emiten luz con longitud de onda entre y Angstroms en la esterilización de aire, de ambientes y superficies de trabajo, campo quirúrgico, etc. Debe mantenerse un registro de las horas de esterilización de cada tubo, ya que tienen una vida útil limitada que debe ser controlada. C. Radiaciones ionizantes Se utilizan preferentemente rayos gama, que son radiaciones de alta energía emitidas por un isótopo radioactivo de Cobalto 60 o Cesio 137. Dado su alto poder de penetración y la no generación de calor, se emplean en la esterilización de material termosensible como el plástico ( tubos, placas, jeringas y bolsas desechables ), hilos de sutura, etc. Métodos Mecánicos I. FILTRACION Los filtros de uso corriente en el laboratorio son: a) Filtros Seitz: son discos de asbesto de diferentes diámetros y diferente porosidad. Estos discos se montan en un aparato metálico donde se coloca el líquido a filtrar. Los discos se desechan después de un uso. Los filtros y sus soportes se deben esterilizar en autoclave. b) Filtros de vidrio poroso: Se fabrican en base a vidrio finamente pulverizado y comprimido. c) Filtros de membrana: son discos de ésteres de celulosa ( acetato o triacetato ) con 12 porosidades distintas, según su uso. Los discos de poros con 0.22 um de diámetro son esterilizantes ( para las bacterias ). Métodos Químicos Los antisépticos y desinfectantes son sustancias químicas ampliamente utilizadas. De acuerdo a su acción se pueden clasificar en Bactericidas ( destruyen las bacterias ) o Bacteriostáticos ( inhiben el desarrollo bacteriano, pero éste se reanuda cuando se retira el agente, tiene una acción reversible ).

5 La actividad germicida de los desinfectantes depende de: las condiciones de uso, concentración, tiempo, temperatura, ph, cantidad y calidad de la materia orgánica presente, características de la superficie, tipo y concentración de microorganismos, entre otros. Los más frecuentemente usados en el laboratorio son los siguientes: 1. ALCOHOLES: El alcohol etílico es no tóxico, incoloro e inodoro. Es útil contra las formas vegetativas pero ineficaz contra las esporas. Actúa por desnaturalización de las proteínas. La concentración óptima es al 70% ( 4 volúmenes de alcohol volumen de agua destilada ). El alcohol isopropílico es más bactericida que el etanol y ha tendido a desplazar al primero ya que esta libre de las restricciones legales de la ley de alcoholes. Los demás alcoholes no son de uso práctico debido a su insolubilidad, olor y alto costo. Se usa como antiséptico y desinfectante. 2. CLORO: el Hipoclorito de Sodio comercial viene e una concentración del 10%. Para su uso en el laboratorio se debe diluir al 1 %. Es un desinfectante de acción bactericida por oxidación de los grupos sulfhidrilos libres. 3. YODO: tiene una acción bactericida sobre formas vegetativas y esporas, sobre hongos y algunos virus. Actúan directamente por proceso de yoduración y oxidación, interfiriendo los procesos de óxido reducción y fosforilación bacterianos. Se utiliza como tintura ( solución alcohólica al 2% o 3% ), Lugol ( solución acuosa al 5% ) o para aumentar la acción bactericida del alcohol etílico ( alcohol yodado al 2% ). 4. YODOFOROS: es una asociación de yodo con polímeros ( polivinil pirrolidina ) generalmente al 10% que permite una liberación lenta de yodo ( 1% ). Tiene acción bactericida y se utiliza como antiséptico y desinfectante. 5. FENOL : al 0.2% tiene una acción bacteriostática, al 1% es letal para la mayoría de las bacterias y al 1.5% es fungicida. Se usa en soluciones acuosas, es de bajo costo tiene un gran poder de penetración aún en la piel intacta. 6. IONES DE METALES PESADOS: sales de mercurio ( Timerosal, Mercurio cromo ), plata ( Nitrato de plata ), Zinc ( Sulfato de zinc ) y cobre ( Sulfato de cobre ) en concentraciones altas desnaturalizan las proteínas. Actúan combinándose a los grupos sulfhidrilos. Se inactivan fácilmente en presencia de materia orgánica y no actúan sobre las esporas. 7. AGENTES ALQUILANTES: sustituyen átomos lábiles de hidrógeno con radicales alquilo. Un ejemplo es el Oxido de etileno que se usa para esterilizar materiales plásticos. Tiene una gran penetración, muy activo contra esporas y virus. Es extremadamente tóxico y forma mezclas explosivas con el aire. 8. DETERGENTES: son sustancias tensioactivas que disminuyen la tensión superficial, modificando la barrera osmótica y permeabilidad de la membrana celular, de manera que la célula no puede mantener su integridad. Pueden ser sustancias no iónicas ( sin efecto antimicrobiana ), aniónicas ( bactericidas ) y catiónicas ( anomios cuaternarios ). 9. FORMALDEHIDO: puede utilizarse en solución ( Formalina ) o al estado gaseoso como gas Formol para desinfectar ambientes de trabajo ( aire ). Al mezclar

6 Permanganato de potasio ( 1 parte ) con Formalina ( 2 partes ), se libera gas formol que es altamente bactericida y viricida. Esterilización de virus La velocidad de inactivación de los virus se relaciona con la concentración del agente y la duración de la exposición. - Los agentes inactivantes que son nucleotrofos son el formaldehído, la luz ultravioleta, la hidroxilamina y los elementos radioactivos - Los agentes activos contra las proteínas virales son calor, enzimas proteolíticas, ácidos débiles, luz ultravioleta, compuestos sulfhidrilos y detergentes - Agentes lipotróficos virales son solventes (cloroformo, etc.) MEDIOS DE CULTIVO Los microorganismos en general pueden vivir y multiplicarse sobre substratos nutritivos preparados en el laboratorio, que son denominados medios de cultivo. Los Medios de Cultivo son preparados estériles que contienen sustancias necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Todos los microorganismos requieren agua, carbono, nitrógeno, hidrógeno, calcio, fósforo y hierro como elementos vitales. Los microorganismo exigentes requieren además factores de crecimiento como aminoácidos, vitaminas, purinas y otras sustancias que no son capaces de sintetizar. CONDICIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 1. Contener sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos ( tales como aminoácidos, carbohidratos, polialcoholes, vitaminas, minerales ) 2. Tener un ph que permita un desarrollo óptimo, por lo general las bacterias patógenos necesitan un ph neutro o ligeramente alcalino ( ), en cambio las levaduras y hongos requieren un ph ácido ( 5.0 ). 3. Estar previamente esterilizados o preparados en condiciones asépticas 4. Estar protegidos de la contaminación ambiental por tapones de algodón cardé, tapones de goma, tapas metálicas o roscas. UTILIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 1. Aislamiento de bacterias desde un muestra o material patógeno ( secreción purulenta, orina, órgano, fecas, etc. ) o de un alimento ( leche, carne, etc. ) 2. Estudio morfológico de las colonias 3. Conservación de cepas identificadas ( colección de cepas microbianas o cepario ) 4. Clasificación y tipificación de bacterias por estudio de sus propiedades bioquímicas en medios diferenciales 5. Obtención de toxinas o investigación de sus características 6. Cultivo y cosecha de bacterias para la elaboración de productos biológicos ( vacunas, antígenos, bacterinas, toxoides, etc. ) CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: SEGÚN SU ESTADO FISICO

7 1. Medios Líquidos: se utilizan preferentemente para favorecer el desarrollo bacteriano de células estresadas. En determinadas ocasiones no se pueden sustituir por los medios sólidos, por ejemplo en la síntesis de exotoxinas, pigmentos, enzimas, etc. - Ejemplo: Agua peptonada, Caldo nutriente, Caldo Cerebro Corazón, Caldo Saboureaud, etc. 1. Medios Sólidos: se utilizan para obtener bacterias aisladas por la formación de colonias sobre la superficie del medio de cultivo y para el estudio de la morfología de las colonias, lo que no permiten los medios líquidos. Se diferencian porque tienen una sustancia de sostén, que puede ser agar-agar o gelatina - Ejemplo: Agar corriente, Agar SS, Agar Cerebro Corazón, Agar Saboureaud, etc. 2. Medios Semisólidos: se utilizan para estudiar la motilidad de las bacterias. Tienen un menor porcentaje de agar, de modo que no siendo completamente sólidos, no solidifican totalmente a la temperatura ambiente. - Ejemplo: Agar MIO Los medios sólidos tienen generalmente agar agar como agente solidificante, espesante o gelificante. El agar-agar es una sustancia hidrofílica de carácter coloidal procedente de diversas especies de algas marinas, especialmente del tipo gelidium, que tiene la propiedad de formar un gel. Químicamente el agar-agar es un polisacárido de cadena larga, dependiendo de su tamaño el poder gelificante. El agar-agar se expende en forma granulada o en polvo, es insoluble en agua fría, se disuelve solamente a temperatura de ebullición, se mantiene en forma viscosa a C y solidifica en forma de un gel estable a C. Resiste perfectamente la esterilización a 121 C y por su capacidad de retener agua no se deshidrata fácilmente, lo que permite almacenar los medios por un largo período de tiempo a 5 C. La gelatina no puede reemplazar al agar en la preparación de medios sólidos, ya que es atacada y descompuesta por muchos tipos de bacterias. Se añade a los medios de cultivo para estudiar si las bacterias son capaces de atacarla ( presencia de enzimas gelatinasas ). SEGÚN SU UTILIDAD PRACTICA I. Medios corrientes, comunes o básicos II. Medios especiales Medios mejorados Medios selectivos o de diagnóstico Medios diferenciales o indicadores MEDIOS CORRIENTES: son aquellos medios apropiados para el cultivo y mantención de la mayoría de las bacterias. Sirven de base para la preparación de los medios especiales. - Ejemplo: Caldo nutriente, Agua peptonada, Agar nutritivo, etc. MEDIOS ESPECIALES: son aquellos medios de cultivo que por su riqueza nutritiva, sirven para el cultivo de bacterias muy exigentes. Contienen en su formulación sustancias inhibidoras para ciertas bacterias, que permiten el aislamiento y diagnóstico precoz de aquellas bacterias que nos interesan por ser los agentes

8 etiológicos de las enfermedades infecciosas. También pertenecen a este grupo aquellos medios que por adicción de sustancias químicas determinadas, facilitan el diagnóstico por características bioquímicas de algunas especies microbianas. Los medios especiales se clasifican en : A. Medios Mejorados: se obtienen añadiendo a los medios corrientes sustancias de mayor valor nutritivo, que tienen el efecto de proporcionar condiciones favorables para el cultivo de bacterias exigentes ( Ej Estreptococos, Corynebacterium ). - Las sustancias añadidas pueden ser: sangre desfibrinada ( conejo, cordero o caballo ), suero sanguíneo ( equino ), suero fetal bovino, huevo, cerebro, corazón, trozos o extracto de hígado, carne o levadura, etc. - La mayoría de estas sustancias por ser proteicas coagulan con el calor, lo cual impide que sean esterilizadas en autoclave. Deben por lo tanto ser esterilizadas por filtración o ser agregadas a los medios previamente esterilizados, en condiciones de rigurosa asepsia. - Ejemplo: Agar Sangre, Agar Cerebro Corazón, caldo de tetrationato (empleado en el aislamiento de Salmonella typhi y otros grupos de Salmonella de los excrementos, orina, aguas residuales). B. Medios Selectivos: generalmente el microorganismo patógeno causante del cuadro infeccioso que se desea aislar a partir de la muestra, no se encuentra puro sino que convive con otras especies sin interés diagnóstico. Así por ejemplo es frecuente que las fecas, orina, exudados, alimentos, agua, etc. estén altamente contaminadas con bacterias saprófitas que por su desarrollo exuberante en los medios de cultivo corrientes, inhiben el crecimiento o enmascaran la presencia del agente patógeno buscado. Los medios selectivos se caracterizan por estimular el desarrollo de ciertas especies bacterianas y a la vez inhibir el desarrollo de otras especies, lo que permite el aislamiento y diagnóstico de las bacterias con facilidad y rapidez. Estas características se obtienen por la adición de sustancias tales como colorantes de anilinas, sales biliares, antibióticos, etc. - Ejemplo: Agar Brucella, Agar McConkey, Caldo Selenito Cistina, etc. C. Medios Indicadores o Diferenciales: son medios comunes o mejorados, con adicción de ciertas sustancias que ponen de manifiesto determinadas propiedades bioquímicas, inherentes a algunas especies bacterianas, como por ejemplo: producción de gas, H 2 S, de ácidos, de sustancias alcalinas, acción proteolítica, acción lipolítica, etc. Estas sustancias o indicadores permiten diferenciar rápidamente una especie microbiana de otra semejante; por este motivo se denominan medios indicadores o diferenciales. - Ejemplo: Agar Baird Parker, Agar Rambach, etc. En este curso se usarán principalmente tres medios de cultivo que son: - Agar nutriente (corriente): es un medio básico usado con propósitos generales para el cultivo de muchos tipos de bacterias. Puede ser enriquecido o hacerse selectivo por la adición de sustancias adecuadas.

9 - Agar sangre: es un medio en base a agar nutriente enriquecido con 5-10% de sangre. Es usado para el cultivo de bacterias nutricionalmente exigentes, como Bordetella pertussis (agente causal de tos convulsiva) y también para detectar hemólisis. Al calentar el agar sangre a 70-80ºC hasta obtener un color café se obtiene otro medio de cultivo denominado agar chocolate, que es más apropiado que el agar sangre para el crecimineto de ciertos patógenos, como por ejemplo Neisseria gonorrhoeae. - Agar McConkey: es un medio selectivo y diferencial, ya que contiene sales biliares y cristal violeta para inhibir el crecimiento de Gram + (selectivo) y lactosa para distinguir aquellas bacterias que la fermentan de las que no (diferencial). En agar McConkey las bacterias entéricas que utilizan lactosa (tales como E.coli) forman colonias rojas debido a que los productos acídicos que se forman a partir de lactosa afectan el indicador de ph del medio (rojo neutro); en cambio, las especies entéricas que no usan lactosa (por ejemplo muchas cepas de Salmonella) forman colonias incoloras. Los medios de cultivo comerciales deshidratados son productos a los cuales se le ha eliminado el agua y todas las interferencias de tipo químico, con un ph ajustado, que se han controlado física, química y bacteriológicamente. Es decir es un producto estandarizado. NOTAS TEÓRICAS SOBRE ALGUNOS PROCEDIMIENTOS BÁSICOS a.- Esterilización de ASAS y PIPETAS. Cada vez que se desee utilizar asas de platino, pipetas capilares o aforadas, deben esterilizarse a la llama del mechero. Para esterilizar el asa, se coloca el alambre en posición semivertical sobre la llama hasta que se ponga color rojo vivo, inmediatamente se completa la esterilización flameando la parte metálica del mango. La esterilización de asas y pipetas capilares se realiza antes y después de haberlas usado con bacterias. Para tomar bacterias es preciso esterilizar previamente el asa y esperar hasta que esté totalmente fría. El asa se enfría tocando las paredes de vidrio del tubo, la tapa de la placa de Petri, o bien la zona del medio en que no haya bacterias. Luego se procede a tomar la muestra. En el caso de las pipetas, la de tipo capilar debe ser rota en el extremo para luego deslizarla sobre la llama girándola suavemente en una extensión muy superior a la que se introducirá en el tubo, luego se enfría del mismo modo que el asa de platino. Las pipetas aforadas pueden estar en cilindros metálicos o envueltas en papel ya estériles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparlo y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta, de manera de no tocar su extremo inferior, luego se pueden parar por la llama como en el caso de la pipeta capilar. b.- Esterilización de TUBOS DE ENSAYO. Cada vez que se destape un tubo estéril, se debe flamear su boca y repetir la operación inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este

10 procedimiento pretende evitar la entrada de microorganismos del aire al interior del tubo. c.- Técnicas de Siembra: La siembra o cultivo consiste en colocar a los microorganismos en un medio ambiente adecuado para que se desarrollen y multipliquen. Esta operación debe realizarse en forma aséptica sobre un medio de cultivo, mediante alguna de las siguientes técnicas. A. De medios sólidos a sólidos. a) En tubo de agar tendido: 1) Rotule el tubo con los datos correspondientes (microorganismos, fecha, nombre o grupo, mesón). 2) Flamee el asa para su esterilización. 3) Enfríe el asa en las paredes internas del tubo o en el líquido de condensación. 4) Tome un inóculo del tubo problema. 5) Destape el tubo estéril e introduzca el asa cargada sin tocar las paredes, hasta el fondo. Ascienda el asa imprimiéndole un movimiento de zig-zag tocando superficialmente el medio de cultivo, procurando no romper ni arrastrar el agar. 6) Flamee la boca del tubo y tápela. 7) Flamee el asa para su esterilización. 8) Incube el tubo sembrado a la temperatura adecuada. b) En Placa de Petri. 1) Rotule la placa con los datos correspondientes. 2) Flamee el asa para su esterilización. 3) Enfríe el asa en las paredes internas del tubo o en el líquido de condensación. 4) Tome un inóculo del tubo problema. 5) Efectúe la siembra del tubo problema a la placa de Petri estéril; para ello: - Levante la tapa de la placa lo necesario para introducir el asa. - Imprima al asa un movimiento de zig-zag, tocando superficialmente el medio de cultivo, procurando no romper el agar. 6) Tape la placa y flamee el asa para su esterilización.

11 7) Incube la placa sembrada a la temperatura adecuada. c) En tubo de agar profundo (Por picadura). 1) Rotule el tubo con los datos correspondientes. 2) Flamee el asa para su esterilización 3) Enfríe el asa en las paredes internas o en el líquido de condensación. 4) Tome un inóculo del tubo problema. 5) Efectúe la siembra del tubo problema al tubo estéril; para ello: - Destape el tubo estéril e introduzca el asa cargada sin tocar las paredes, picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo. - Retire el asa con precaución para producir el menor desgarro posible. 6) Flamee la boca del tubo y tápelo. 7) Flamee el asa para su esterilización 8) Incube el tubo sembrado a la temperatura adecuada. B. De medios líquidos a líquidos a) Con asa 1) Rotule el tubo con los datos correspondientes. 2) Homogenice el tubo problema por agitación. 3) Flamee el asa para su esterilización 4) Enfríe el asa en las paredes internas del tubo. 5) Tome un inóculo del tubo problema procurando que quede una película en el asa. 6) Destape el tubo estéril e introduzca el asa cargada sin tocar las paredes, agítela en el medio de cultivo y retírela con cuidado. 7) Flamee la boca del tubo y tápelo. 8) Flamee el asa para su esterilización. 9) Incube el tubo sembrado a la temperatura adecuada. b) Con Pipeta Pasteur. 1) Rotule con los datos correspondientes.

12 2) Confeccione una pipeta Pasteur estéril y manténgala al lado del mechero. 3) Homogenice el tubo problema por agitación. 4) Tome con la pipeta Pasteur un volumen pequeño del tubo problema. 5) Destape el tubo estéril y vierta en él el contenido de la pipeta Pasteur, sin introducir ésta en el medio de cultivo. Retírela con cuidado. 6) Flamee la boca del tubo y tápelo. 7) Selle la pipeta Pasteur en el mechero y proceda a su eliminación. 8) Homogenice el tubo sembrado e incúbelo a la temperatura adecuada. C. De medios líquidos a sólidos. a) Con asa. 1) Rotule con los datos correspondientes. 2) Homogenice el tubo problema. 3) Flamee el asa para su esterilización 4) Enfríe el asa en las paredes del tubo problema. 5) Tome un inóculo del tubo problema, procurando que quede una película en el asa. 6) Destape el tubo estéril e introduzca el asa cargada sin tocar las paredes, hasta el fondo. Ascienda el asa imprimiéndole un movimiento de zig-zag, tocando superficialmente el medio de cultivo, procurando no romper ni arrastrar agar. 7) Flamee la boca del tubo y tápela. 8) Flamee el asa para su esterilización. 9) Incube el tubo sembrado a la temperatura adecuada. b) Con pipeta Pasteur (Siembra en superficie) 1) Rotule la placa de agar nutricio con los datos correspondientes. 2) Confeccione una pipeta Pasteur estéril y manténgala al lado del mechero. 3) Homogenice el tubo problema. 4) Levante la tapa de la placa lo necesario para introducir la pipeta Pasteur. Vierta el contenido de la pipeta en el centro de la placa, sin tocar el medio de cultivo. 5) Tape la placa y descarte la pipeta Pasteur.

13 6) Flamee un rastrillo de vidrio. 7) Enfríelo en la cara interna de la tapa de la placa. 8) Con el rastrillo, distribuya homogéneamente el inóculo en toda la superficie del medio. 9) Tape la placa y esterilice el rastrillo. 10) Incube la placa sembrada a la temperatura adecuada. c) Con pipeta Pasteur a Placa (Siembra en profundidad) 1) Rotule una placa vacía con los datos correspondientes. 2) Funda un tubo de agar a baño maría y déjelo enfriar a 45ºC. (Temperatura que resista en la palma de la mano sin tener la sensación de quemarse). 3) Siembre en este tubo y a esa temperatura 0,5 a 1 ml del medio problema que ha tomado con la pipeta. Homogenice por giro rotatorio entre las palmas de la mano y vierta el contenido en la placa de Petri. 4) Reparta uniformemente el agar sembrado en la placa y déjelo solidificar. 5) Esterilice la pipeta y descártela. 6) Incube a temperatura adecuada. D. De medio sólido a líquido. En tubo: 1) Rotule el tubo con los datos correspondientes. 2) Flamee el asa para su esterilización. 3) Enfríe el asa en las paredes internas del tubo o en el líquido de condensación. 4) Tome el inóculo del tubo problema. 5) Destape el tubo estéril e introduzca el asa cargada sin tocar las paredes. Agítela en el medio de cultivo, golpeando ligeramente contra las paredes del tubo, para que se desprenda el inóculo. Retire el asa con cuidado. 6) Flamee la boca del tubo y tápelo. 7) Flamee el asa para su esterilización. 8) Incube el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

14 d.- Aislamiento de Bacterias: Cuando se realiza una siembra en medios sólidos es deseable obtener las bacterias en forma asiladas. Sin embargo, generalmente las muestras tienen una flora mixta, que se manifiesta por el desarrollo de distintas especies bacterianas: algunas son saprófitas ( flora normal ) o contaminantes del proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patógeno. Para realizar diagnósticos microbiológicos el organismo debe ser primero aislado y mantenido puro en condiciones de laboratorio. Si en la placa de agar ha crecido más de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento de 1 colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos con fines diagnósticos. En el caso de los medios líquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se debe realizar un aislamiento de 1 gota o 1 asada del cultivo a un medio sólido para obtener colonias aisladas y puras. Si fuese necesario las colonias se someterán a uno o más re-aislamientos, hasta obtener cultivos puros, es decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma morfología y microscópicamente correspondan a un solo tipo de bacteria. Sólo en este momento se puede proceder a la identificación de la especie bacteriana mediante el traspaso de 1 sola colonia a una batería de medios diferenciales. Aislar una cepa bacteriana significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado de pureza, condición indispensable para poder estudiar sus características morfológicas y bioquímicas y lograr así su identificación correcta. Técnicas de Aislamiento De medio sólido, de mezcla bacteriana o de muestra patológica a Placa de Petri. Se puede efectuar de varias maneras; acá presentamos tres de ellas. 1.- Se toma el asa con la muestra y se procede a hacer una estría en zig-zag desde un extremo a otro de la placa. Sin esterilizar el asa se puede repetir la misma operación en una segunda o tercera placa para llegar a obtener colonias aisladas. Es preciso actuar con rapidez para evitar la contaminación con microorganismos presentes en el aire. Esta técnica es poco recomendable para personas que poseen poca práctica en laboratorio microbiológico. (Figura A). 2.- Se toma la placa con la mano izquierda y se distribuye la siembra en una pequeña área junto a su borde. Se esteriliza el asa, se enfría y se arrastra un poco de la bacteria ya sembrada hasta otra zona de la placa, deslizando el asa con movimiento en zig-zag, evitando tocar nuevamente la siembra original. Se continúan los movimientos hasta ocupar toda la superficie de la placa. (Figura B). 3.- Se marca la parte inferior de la placa para dividirla en 8 sectores. Se siembra el primero con el asa que posee la muestra, efectuando movimientos en zig-zag. Se esteriliza el asa, se enfría, se arrastra bacterias del primer sector ya sembrado y

15 se esparcen en los demás mediante movimientos en zig-zag. Es una técnica fácil que da muy buenos resultados a personas con poca experiencia microbiológica. (Figura C). ANALISIS MACRO Y MICROSCOPICO Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria, es la observación directa de su morfología macroscópica y microscópica. En microbiología debido a que las bacterias no se pueden ver a simple vista, no se puede trabajar con ellas en forma individual, sino que con poblaciones bacterianas que se observan macroscópicamente, llamadas colonias. Para obtener estas colonias es necesario proporcionarles a las bacterias los requerimientos necesarios de materia orgánica, iones inorgánicos, factores de crecimientos, etc. a través de un medio de cultivo. Cada colonia corresponde en su origen a una sola bacteria que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo sólido, hasta formar una colonia visible. Por lo tanto una colonia esta formada por millones de bacterias. La bacteria única que origino una colonia se denomina unidad formadora de colonia. Cuando se realiza un recuento bacteriano por ml o gramo de muestra, este se expresa como unidades formadoras de colonias, lo que en teoría equivale al número de bacterias originalmente presenten en la muestra, al momento de realizar la siembra. El crecimiento de las bacterias en medios líquidos, no da origen a la formación de colonias. El desarrollo se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras características. Cabe destacar que la morfología macroscópica de las colonias (análisis macroscópico) permite un acercamiento en la identificación de los géneros bacterianos que poseen características propias de desarrollo de sus colonias, según su forma, elevación,margen, superficie, brillo, color y hemólisis (en agar sangre).

16 Por otro lado, y como ya se mencionó antes, para el análisis microscópico de las bacterias se requiere de variadas técnicas tintoriales que se basan en ciertas características estructurales de estas. la tinción más importante en bacteriología es la tinción de gram, pues divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram + y Gram -. Además permite conocer la forma (cocos, bacilos) y la disposición bacteriana (diplos, cadenas, racimos). Un género bacteriano que representa una excepción a la tinción de Gram (no se tiñen) es Mycobacterium (bacilos ácido-alcohl resistentes), cuyas especies, como M.tuberculosis deben ser teñidos con la tinción de Ziehl Neelsen (fucsina como colorante primario, ácido clorhídrico-alcohol como decolorante y azul de metileno como contraste). Entonces, el estudio macro y microscópico de una muestra bacteriana permite obtener una orientación preliminar de su identidad y dirije el desarrollo de pruebas bioquímicas que permitan una identificación más certera y precisa.

17 COLONIAS DESARROLLADAS EN AGAR Puntiforme Circular 1. FORMA Irregular Filamentosa Rizoide Fusiforme Plana Levantada 2. ELEVACION Convexa Cóncava Pulvinada Umbilicada

18 Liso Ondulado 3. BORDE Lobulado Desgastado o Dentado Filamentoso Lisa 4. SUPERFICIE Rugosa Escamosa Transparente o Cérea 5. CARACTERES Brillante u Opaca FISICOS Con color ó Sin color

19 TINCIONES Para observar claramente forma, tamaño y agrupación bacteriana, es necesario usar diversos colorantes. La tinción puede hacerse con un solo colorante (tinción simple) o con mezcla de ellos (tinción diferencial). Estos últimos se basan en la afinidad relativa de distintas bacterias o de sus estructuras, por los agentes empleados. Entre los métodos diferenciales, la tinción de Gram es la más usada en bacteriología básica. TINCIÓN DE GRAM 1.- Aplicación del colorante. El colorante básico difunde por todo el organismo. La especificidad del colorante primario reside en la habilidad de los trifenil-metanos de teñir la pared celular de los organismos Gram positivos. Correlativamente el carácter de Gram negativos, yace en la relativa incapacidad de su pared celular de retener el colorante primario. 2.- Aplicación del mordiente. Donde sea que penetre el yodo y encuentre colorante, forma un complejo insoluble en agua. No se sabe si el mordiente penetra igualmente a través del organismo. Teóricamente la formación del complejo en la estructura externa constituirá una barrera de permeabilidad a la penetración posterior de mordiente en el resto de la estructura del organismo. 3.- Aplicación del decolorante. A diferencia de los organismos Gram positivos, en los organismos Gram negativos ocurre un verdadero lavado del complejo colorante-yodo al tratarlo con la solución de solvente orgánico. La presencia de agua aumenta la decoloracón, presumiblemente por aumento en la penetración del solvente orgánico. 4.- Tinción de contraste. En general, los mejores colorantes de contraste son aquellos colorantes básicos que no sean trifenilmetanos. Estos colorantes reemplazan al colorante primario en los Gram Negativos, el que había sido removido por el solvente. Los Gram positivos son resistentes a este lavado, por lo tanto, no se tiñen con el colorante de contraste TECNICAS DE TINCION Un procedimiento previo a la tinción, cualquiera que esta sea, es la fijación de las bacterias al portaobjeto. Para esto se procede del modo siguiente: a) Flamee la lámina rápidamente. b) Coloque una gota de agua en el centro de la lámina. (Sólo si la muestra o cultivo es sólido).

20 c) Transfiera con un asa estéril una pequeña cantidad de cultivo o de muestra y mézclelo con la gota de agua formando una suspensión, apenas opalescente. d) Fije el frotis exponiéndolo brevemente a la llama de un mechero hasta que esté completamente seco. Pruebe el calor de la lámina sobre el dorso de su mano (si está demasiado caliente se alterará la morfología bacteriana). 1. Tinción simple: i) Cubra el frotis con azul de metileno y deje reposar por 3-4 min. ii) iii) Lave con un chorro suave de agua. Seque su frotis con papel absorbente y observe con aceite de inmersión. NOTA: ACUERDESE DE LAVAR TAMBIEN EL DORSO DE LA LAMINA 2. Tinción de Gram. i) Cubra el frotis con cristal violeta (1) y déjelo en reposo por 1-2 min. ii) iii) Lávelo con solución de lugol (2) y déjelo escurrir suavemente hasta que se hayan desprendido unas laminillas de aspecto metálico. Déjelo con lugol por 30 segundos. Decoloree rápidamente, dejando escurrir en forma alternada alcohol-acetona (3) y agua de la llave (chorro suave), hasta que se desprenda todo el colorante violeta. iv) Cubra su frotis con el colorante de contraste, safranina al 1% (4), por 1 min. v) Lávelo suavemente con agua de la llave, séquelo con papel suavemente y obsérvelo con inmersión. Caracterice el frotis de acuerdo a: forma, agrupación bacteriana y afinidad a la tinción de Gram. 3. Tinción de Esporas: i) Realice un frotis en la forma habitual. ii) Cubra con verde de malaquita y caliente suavemente durante 1-2 min. (sólo emisión de vapores, evite que hierva). iii) Lave con agua de la llave. iv) Contratiña con safranina por 30 seg.

21 v) Lave, seque y observe con inmersión. 4. Tinción para cápsula: i) Coloque una gota moderada de tinta china sobre una lámina y emulsione sobre ella la bacteria en estudio. ii) Extienda la suspensión de manera que el frotis resulte delgado. iii) Deje secar y fije. iv) Cubra con fucsina. v) Lave, seque y observe con inmersión ALGUNAS INDICACIONES PARA EL MANEJO CORRECTO DEL MICROSCOPIO Una etapa importante en el estudio de las características de una bacteria, es la observación directa de su morfología microscópica. a) Iluminación correcta del microscopio con luz artificial. Coloque el espejo cóncavo frente a la fuente de luz. Proceda a centrar la fuente luminosa, para ello retire el ocular del tubo y coloque el objetivo Nº 3. Observando a través del tubo, aprecie el instante en que al mover el espejo, obtenga una iluminación, accionando el diafragma del condensador y mirando por el tubo, note el momento en que la luz proyectada cubra toda la lente posterior del objetivo, una vez obtenida ésta, coloque el ocular en su sitio. Ahora está en condiciones de observar. b) Para enfocar una preparación. Una vez colocado el frotis sobre la platina, accione el macrométrico y mirando por el lado, baje el tubo hasta el momento en que el obejtivo casi toque la lámina portaobjeto; en este instante, mirando por el ocular, vuelva el macrométrico al revés hasta que aparezca la imagen en el foco, en ese momento, accionado el micrométrico, enfóquela. c) Cuando use inmersión. Coloque el aceite de inmersión sobre el frotis antes de colocarlo sobre la platina, para evitar ensuciar con gotas de aceite. Luego, una vez sobre la platina, ponga en posición de observación el objetivo de inmersión y siempre mirando por fuera, ajuste la altura con el macrométrico hasta que entren en contacto aceite y objetivo. Observando por el ocular, ajuste la imagen con el micrométrico. II.- OBJETIVOS 1. Identificar material empleado en la práctica bacteriológica. 2. Adquirir destreza para manipular materiales y cultivos, cuidando la esterilidad. 3. Considerando las instrucciones del ayudante, practicar diferentes tipos de siembra.

22 4. Según instrucciones previas, practicar diferentes tipos de aislamiento bacteriano. 5. Comparar colonias bacterianas desarrolladas en placas de agar. 6. Dada una serie de preparaciones microscópicas, identificar diferentes formas y agrupaciones de microorganismos teñidos con el método de Gram. 7. Practicar tinción de frotis bacterianos: tinción simple, tinción de Gram, tinción de cápsula y esporas. III.- MATERIALES - Asas de siembra. - Pipetas Pasteur. - Tubos con caldo corriente. - Placas de agar corriente. - Placas de agar sangre - Tubos de agar semitendido - Portaobjetos - Azul de metileno - Tubos con cultivos bacterianos (Bacillus Cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli) - Microscopios - Aceite de inmersión - Xilol; paño de microscopio - Set de preparaciones fijadas - Láminas - Batería para tinción de Gram (cristal violeta, lugol, alcohol-acetona, safranina) - Cultivos bacterianos (Colección de muestras teñidas de microorganismos Gram positivo, Gram negativo, Mezcla Gram positivo y negativo, Estafilococos, Levadura, Estreptococos, Micobacteria, Esporas, Cápsula) - Tinta china - Verde de malaquita - Estufa incubadora IV.- PROCEDIMIENTO Práctica Nº 1 El estudio de las bacterias en el laboratorio implica el empleo de diversos métodos. Algunos de éstos serán conocidos y practicados a continuación. 1. Esterilización:

23 El conocimiento de las características de una especie determinada de bacterias, se logra si previamente ésta se estudia en un cultivo puro, para esto es necesario e indispensable emplear material completamente estéril Infórmese acerca del concepto de esterilización Averigue y anote el nombre de los medios de esterilización más comúnmente empleados en Bacteriología Siguiendo las indicaciones de su ayudante, practique la esterilización del siguiente material de laboratorio: asa de platino, pipeta Pasteur, pipetas, tubos de ensayo. 2. Siembra o cultivo: Consiste en colocar a los microorganismos en un ambiente adecuado para que se desarrollen y multipliquen. En el laboratorio este medio ambiente lo constituyen los medios de cultivo corriente o básico y especial. 2.1 Observe y reconozca los medios de cultivo más frecuentemente usados en el laboratorio de Microbiología: - agar corriente - agar sangre - agar McConkey - caldo corriente 2.2 Comente con su ayudante cómo se preparan los medios de cultivo: - placa de agar corriente - placa de agar sangre - tubo de agar semitendido 2.3 Realice los siguientes tipos de siembras: En tubos: Sólido a líquido (asa de platino) Líquido a sólido (asa o pipeta Pasteur) 3. Aislamiento: En placa: Sólido a sólido. El material que se siembra puede contener varias especies bacterianas, por lo tanto, para estudiar las características de una especie, es necesario obtenerla aislada en un cultivo puro Según instrucciones, practique uno de los aislamientos indicados a continuación en placa de agar: a) Estrías en zig-zag. b) Estrías con movimientos de lateralidad. c) Estrías en diferentes sectores de la placa.

24 Nota: Siempre debe rotular adecuadamente placas y tubos (con plumón permanente). Las placas se rotulan en la base donde está el medio de cultivo y se dejan con la tapa hacia abajo y el agar hacia arriba. 4.- Estudio de colonias: Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria, es la observación directa de su morfología macroscópica y microscópica. Análisis Macroscópico: a) Siembre una de las bacterias disponibles en su mesón con técnica de aislamiento, en los siguientes medios de cultivo: agar nutriente, aagar sangre, agar McConkey y agar manitol salado. b) Rotule sus placas con su nombre, Nº de mesón y nombre de la bacteria que sembró. Incube por 24 horas a 37ªC.

25 Práctica Nº 2 Análisis Macroscópico: a) Observe si hubo crecimiento bacteriano en los distintos medios de cultivo y describa lo que ocurrió en cada uno de ellos. b) Observe y describa las colonias desarrolladas en los distintos medios, considerando los siguientes aspectos: forma, borde, elevación, superficie, características físicas (textura, color y brillo). c) Averigue qué es exactamente una colonia. Análisis Microscópico: a) Observe las preparaciones teñidas (colección en caja) e identifique la forma, agrupación y afini dad tintorial: Tinción de Gram Tinción de Ziehl Neelsen Gram positivo Gram negativo Mezcla Gram positivo y negativo Estafilococos Levadura Estreptococos Micobacteria Tinción con verde de malaquita Esporas Tinción con tinta china Cápsula b) Para observar claramente forma, tamaño y agrupación bacteriana, es necesario usar diversos colorantes. La tinción puede hacerse con un solo colorante (tinción simple) o con mezcla de ellos (tinción diferencial). Estos últimos se basan en la afinidad relativa de distintas bacterias o de sus estructuras, por los agentes empleados. Entre los métodos diferenciales, la tinción de Gram es la más usada en bacteriología básica. b.1. Prepare un frotis con alguna de las bacterias presentes en su mesón. Para esto proceda del modo siguiente: 1.- Flamee la lámina rápidamente. 2.- Coloque una gota de agua en el centro de la lámina. (Sólo si la muestra o cultivo es sólido). 3.- Transfiera con un asa estéril una pequeña cantidad de cultivo o de muestra y mézclelo con la gota de agua formando una suspensión, apenas opalescente. 4.- Fije el frotis exponiéndolo brevemente a la llama de un mechero hasta que esté completamente seco. Pruebe el calor de la lámina

26 sobre el dorso de su mano (si está demasiado caliente se alterará la morfología bacteriana). b.2 Tiña el frotis empleando la tinción de Gram. 1.- Cúbralo con cristal violeta (1) y déjelo en reposo por 1-2 min. 2.- Lávelo con solución de lugol (2) y déjelo escurrir suavemente hasta que se hayan desprendido unas laminillas de aspecto metálico. Déjelo con lugol por 30 segundos. 3.- Decoloree rápidamente, dejando escurrir en forma alternada alcohol-acetona (3) y agua de la llave (chorro suave), hasta que se desprenda todo el colorante violeta. 4.- Cubra su frotis con el colorante de contraste, safranina al 1% (4), por 1 min. 5.- Lávelo suavemente con agua de la llave, séquelo con papel suavemente y obsérvelo con inmersión. b.3 Caracterice el frotis de acuerdo a: forma, agrupación bacteriana y afinidad a la tinción de Gram. c) En el estudio de la morfología microscópica bacteriana, también se incluye la visualización de ciertas estructuras que pueden o no existir en bacterias. c.1. Observe con lente de inmersión las preparaciones de esporas y cápsula c.2. Con las cepas que se le indiquen, realice tinciones para visualizar las estructuras bacterianas. Tinción de Esporas: 1.- Realice un frotis en la forma habitual. 2.- Cubra con verde de malaquita y caliente suavemente durante 1-2 min. (Sólo emisión de vapores, evite que hierva). 3.- Lave con agua de la llave. 4.- Contratiña con safranina por 30 seg. 5.- Lave, seque y observe con inmersión. Tinción para cápsula: 1.- Coloque una gota moderada de tinta china sobre una lámina y emulsione sobre ella la bacteria en estudio. 2.- Extienda la suspensión de manera que el frotis resulte delgado.

27 3.- Deje secar y fije. 4.- Cubra con fucsina. 5.- Lave, seque y observe con inmersión. En el anexo 1, se encontrarán algunas características de microorganismos gram positivos y gram negativos.