Biotecnología microbiana

Transcripción

1 BIOTECNOLOGIA En términos generales biotecnología se puede definir como el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de valor para el hombre. Por tanto, podemos decir que la biotecnología abarca desde la biotecnología tradicional, muy conocidas y establecidas, y por tanto utilizadas, como por ejemplo la fermentación de alimentos, hasta la biotecnología moderna, basada en la utilización de las nuevas técnicas del DNA recombinante (ingeniería genética), los anticuerpos monoclonales y los nuevos métodos de cultivo de células y tejidos. La biotecnología moderna está compuesta por una variedad de técnicas derivadas de la investigación en biología celular y molecular. Estas técnicas involucran la manipulación deliberada de moléculas de DNA con la finalidad de la aplicación comercial de organismos vivos modificados o de sus productos. Pueden ser utilizadas en cualquier industria que utilice microorganismos o células vegetales o animales. 1

2 Biotecnología microbiana Es la disciplina que utiliza los microorganismos vivos o sus productos en procesos industriales. La biotecnología microbiana se puede dividir en dos fases distintas: 1. Tecnología microbiana tradicional, que se refiere a la fabricación a gran escala de productos que los microorganismos son capaces de fabricar. 2. Tecnología microbiana con organismos alterados genéticamente mediante procesos de ingeniería genética. 2

3 Microorganismos Industriales y Productos Industriales Su fuente es la naturaleza No todos los microorganismos (MOs) tienen uso industrial Los hongos (levaduras y mohos) y algunos procariotas (Streptomyces) son los mas usados. Se seleccionan los que producen uno o mas productos de interés Se modifican géneticamente por mutación o recombinación para aumentar el o los metabolitos de interés. Las vías metabólicas menores se reprimen o eliminan. Pueden presentar propiedades de desarrollo pobres, pérdida en la capacidad de esporulación, propiedades bioquímicas y celulares alteradas. Las cepas modificadas son conservadas en los laboratorios de microbiología de las industrias y en distintas colecciones nacionales de microorganismos tipo. 3

4 Colecciones Nacionales de microorganismos tipo Están disponibles para fines docentes, de investigación o industriales. Las cepas que producen los mejores rendimientos (con derechos de propiedad o patentadas) no están en estas colecciones. 4

5 Mejoramiento de la cepa de Penicillum chrysogenum, productora de la penicilina. A través de los años y de numerosos procesos la producción de penicilina por el hongo Penicillum chrysogenum pasó de 1-10 ug/ml a ug/ml. Este incremento de veces se obtuvo por el mejoramiento de la cepa a través de mutación y selección sin incluir manipulación genética y por cambios en el medio y en las condiciones de crecimiento. La introducción de nuevas técnicas genéticas condujo posteriormente a incrementos mucho mas modestos en el rendimiento. Conjunto de mutaciones realizadas por cuatro grupos de investigadores para obtener una cepa de Penicillum chrysogenum capaz de sintetizar penicilina para una exportación comercial. S, mutación espontánea; X, rayos X; UV, radiación ultra violeta; NM, gas mostaza. Los métodos fermentativos habituales rinden más de 20 g/litr 5

6 Requisitos de un microorganismo industrial El microorganismo debe: 1- Producir la sustancia de interés 2- Obtenerse en cultivo puro 3- Ser genéticamente estable. 4- Poder desarrollarse en cultivos a gran escala. 5- Poder mantener el cultivo del MO durante períodos largos en el laboratorio y en la planta industrial. 6- Tener un tiempo de duplicación bajo y fabricar el producto deseado en un período corto. Crecimiento rápido ocupar menos tiempo los equipos industriales disminuir los riesgos de contaminación. mejor control de los factores ambientales 7- Ser susceptible de manipulación genética. 8-Crecer en medio de cultivo líquido relativamente barato y que se obtenga en grandes cantidades. 6

7 Medios de cultivo industriales Se usan muchas veces como medios de cultivo a gran escala desechos carbonados provenientes de otras industrias. -licor de maceración del maíz (rico en nitrógeno y factores de crecimiento). - suero de leche (contiene lactosa y minerales) -otros materiales residuales de la industria con elevado contenido en carbono orgánico. 9- En la industria se prefieren los MOs grandes como los hongos, levaduras y bacterias filamentosas para poder separar las células microbianas del medio de cultivo con facilidad ya que este proceso es muy costoso a gran escala. Es mas económico efectuar la separación por filtración que por centrifugación. 7

8 Condiciones que no debe tener un microorganismo industrial Los microorganismos industriales no deben: 1- ser peligrosos para el hombre, animales y plantas de interés económico. 2- liberar toxinas, o si lo hacen deben poder ser eliminadas fácilmente. 8

9 Los productos industriales de interés pueden ser de varios tipos: 1- Las células propiamente dichas, por ej. las levaduras cultivadas para alimentos, panadería o cerveza. 2- Las sustancias producidas por las células. Ejemplos de estas últimas son: -las enzimascomo la glucosa isomerasa - agentes farmacológicos activos como los antibióticos, esteroides y alcaloides - productos químicos y aditivos alimentarios como el aspartame, edulcorante de alimentos y bebidas de bajas calorías (fabricado a partir de L-fenilalanina mas L-ácido aspártico); el L-glutamato, utilizado para reforzar el sabor y para ablandar las carnes; el L- aspartato y alanina para enriquecer el sabor de jugos de fruta; la glicina para mejorar el sabor de alimentos edulcorados; la L- lisina y la DL-metionina como aditivos nutritivos en alimentos para animales. 9

10 Productos Industriales Varias enzimas importantes de uso comercial son producidas por MOs, incluyendo enzimas que digieren el almidón (amilasas), proteínas (proteasas, renina) y las grasas (lipasas). Penicilina acilasa es usada para producir penicilinas sintéticas. Los metabolitos microbianos son otro grupo importante de productos industriales. Estos metabolitos pueden ser productos de la fermentación como el etanol, ac. acético o ac. láctico; factores de crecimiento claves como los aminoácidos, las vitaminas, antibióticos, esteroides, alcaloides, etc. Los agentes farmacológicamente activos están por lo general en la categoría de metabolitos secundarios. 10

11 Crecimiento y formación de productos en procesos industriales El crecimiento microbiano comprende distintas etapas: fase de latencia, fase exponencial y fase estacionaria. Procesos donde lo que interesa es el metabolito microbiano. Hay dos tipos básicos de metabolito microbiano: 1- metabolito primario es el que se fabrica durante la fase exponencial del crecimiento del microorganismo. 2- metabolito secundario es el que se fabrica cerca del final de la fase logarítmica de crecimiento, con frecuencia, cerca de la fase estacionaria de crecimiento. 11

12 Comparación entre metabolitos primarios y secundarios Metabolitos microbianos primarios Un proceso típico microbiano en el cual el producto de interés se forma durante la fase primaria de crecimiento es la fermentación alcohólica (etanólica). El etanol es un producto del metabolismo anaeróbico de la levadura y de ciertas bacterias, y se forma como parte del metabolismo energético. Dado que el crecimiento sólo se puede dar si se efectúa la producción de energía, la producción de etanol corre paralelamente con el crecimiento. Metabolismo microbiano secundario Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria suelen llamarse metabolitos secundarios y son algunos de los más comunes e importantes de interés industrial. Este es el caso de la mayoría de los compuestos de interés farmacológico como es el caso de los antibióticos por ejemplo. 12

13 Comparación entre metabolitos primarios y secundarios a) Metabolismo primario: formación de alcohol por la levadura. b) Metabolismo secundario: formación de penicilina por el hongo Penicillium chrysogenum, presentando la separación de la fase de crecimiento (trofofase), y la fase de producción (idiofase). Nótese en b) que la penicilina no se produce hasta que el crecimiento ha entrado en la fase media y mayor parte del producto se forma después de que el crecimiento ha entrado a la fase estacionaria. En ambos gráficos a) y b) los ejes son aritméticos y no logarítmicos. a b 13

14 Trofofase e idiofase. En el metabolismo secundario, las dos fases distintas del metabolismo se denominan trofofase e idiofase. La trofofase es la fase de crecimiento (el prefijo trofos, significa "crecimiento" ) mientras que la fase de producción de metabolitos es la idiofase. Si estamos tratando con un metabolito secundario debemos asegurar que durante la trofofase se proporcionen las condiciones apropiadas para un excelente crecimiento y que las condiciones se alteren adecuadamente y en el momento oportuno para que la formación del producto sea excelente. 14

15 Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todas las células, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entre un organismo y otro. Las características reconocidas del metabolismo secundario son: 1- Cada metabolito secundario sólo lo forman relativamente pocos organismos. 2- Los metabolitos secundarios aparentemente no son esenciales para el crecimiento y la reproducción. 3- La formación de metabolitos secundarios depende fundamentalmente de las condiciones de cultivo, sobre todo de la composición del medio. Con frecuencia, se produce la represión de la formación del metabolito secundario. 4- Los metabolitos secundarios se producen como un grupo de estructuras muy relacionadas. Por ejemplo, se ha encontrado que una sola cepa de Streptomyces produce alrededor de 30 antibióticos distintos, pero relacionados, del tipo antraciclina. 5- Se puede incrementar enormemente la sobreproducción de los metabolitos secundarios, mientras que los metabolitos primarios asociados al metabolismo primario, habitualmente no pueden sobreproducirse en la misma medida. 15

16 Las vía metabólicas del metabolismo secundario surgen del metabolismo primario. El metabolito secundario, generalmente se produce a partir de varios productos intermediarios acumulados ya sea en el medio de cultivo o en las células, durante el metabolismo primario. Las enzimas que intervienen en la producción de metabolito secundario se regulan por separado de las del metabolismo primario. En algunos casos se han identificado inductores de metabolitos secundarios por ejemplo, se ha identificado un inductor específico para la producción de estreptomicina, compuesto que se llama factor-a. La mayor parte de los metabolitos secundarios son moléculas orgánicas complejas que requieren una gran cantidad de reacciones enzimáticas específicas para su síntesis, (72 etapas para tetraciclina; 25 etapas para eritromicina). 16

17 Características de la fermentación en gran escala En microbiología industrial, el término fermentación se refiere a cualquier proceso microbiano a gran escala, tanto si se realiza aeróbica como anaeróbicamente, es decir tanto si es o no bioquímicamente una fermentación. De hecho la mayor parte de las fermentaciones industriales son aeróbicas. El tanque en el cual se lleva a cabo la fermentación industrial se llama fermentador y el microorganismo que se utiliza se llama fermento. El fermentador puede variar de tamaño de la escala pequeña de laboratorio (5-10 litros) a la enorme escala industrial ( litros). Las dimensiones dependen del tipo de proceso y de cómo opera. Los procesos manejados en lote o batch requieren fermentadores más grandes que los que operan en forma contínua o semicontínua. Los fermentadores industriales se pueden dividir en dos clase principales, para procesos anaeróbicos y para procesos aeróbicos. Los fermentadores anaeróbicos requieren poco equipo especial, excepto para la remoción del calor generado durante la fermentación, en tanto que los fermentadores aeróbicos requieren equipo mucho más elaborado para asegurar la correcta mezcla y aireación. 17

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19 Construcción de un fermentador aeróbico Los fermentadores a gran escala son casi siempre de acero inoxidable. Es prácticamente un cilindro grande cerrado por arriba y por abajo, dentro del cual se han ajustado varios tubos y válvulas. Tiene una cubierta externa de enfriamiento, a través de la cual se hace pasar vapor o agua de enfriamiento. En el caso de fermentadores muy grandes el intercambio de calor a través de la cubierta es insuficiente de modo que hay que adaptar serpentines internos a través de los cuales se pasa vapor o agua de enfriamiento. En equipos a gran escala se necesita optimizar el sistema de aireación ya que la transferencia de oxígeno del gas al líquido es un proceso muy difícil porque el oxígeno es poco soluble en agua y un fermentador con una gran población microbiana tiene una tremenda demanda de oxígeno para el cultivo. Se necesitan dos dispositivos diferentes para asegurar la adecuada aireación: un dispositivo de aireación llamado difusor, y un dispositivo de agitación llamado impulsor. Para lograr una mezcla más eficiente se utilizan deflectores. El microbiólogo industrial debe conocer muy bien la extremadamente compleja dinámica de los fluidos en los fermentadores para diseñar y operar de un modo eficiente los mismos 19

20 Fermentadores: a) de laboratorio; b) esquema de fermentador industrial; c) interior de un fermentador industrial. 20

21 a) Conjunto de fermentadores pequeños para investigación usado en el desarrollo del proceso. b) Gran batería de fermentadores al aire libre (240 m 3 ) que se utiliza para la fabricación de alcohol en Japón. Dada la gran diferencia de sus tamaños, la misma fermentación microbiana tendría que dirigirse en forma muy distinta en los dos tipos de fermentadores. 21

22 Control y monitoreo del proceso Debido a los altos costos de producción, los fermentadores industriales están cuidadosamente controlados. No solo se controla el crecimiento y la producción del producto, sino que se deben controlar otros factores ambientales a medida que el proceso se efectúa. Los factores ambientales controlados más frecuentes son: la concentración de oxígeno, ph, masa celular, temperatura y concentración del producto. También hay que controlar la formación de espuma. En la actualidad se utilizan computadoras para controlar los procesos de fermentación ya sea en la obtención de datos o en el control de varios factores ambientales. La obtención de datos a medida que el proceso de fermentación tiene lugar se llama adquisición inmediata. Las computadoras también pueden graficar los datos obtenidos permitiendo al operador tener una representación visual del progreso de la fermentación. Las computadoras permiten también almacenar los datos para poder analizarlos. Las computadoras permiten un control inmediato del proceso a través de la modificación de los parámetros ambientales a medida que la fermentación progresa o agregando un nutriente a la velocidad de equilibrio exacto del crecimiento evitando que el mismo sea metabolizado a productos indeseables. 22

23 Los procesos microbianos deben ser controlados en forma continua, usualmente esto se hace por medio de computadoras, a fin de asegurar rendimientos satisfactorios de los productos que se desean. a) Una gran planta de fermentación. Sólo se ve la parte superior de los fermentadores, que pueden tener una altura de varios pisos. b) Habitación de control por ordenador para una gran planta de fermentación 23

24 Escalado de la fermentación Escalado o cambio de escala es la adaptación de un proceso industrial desde las condiciones de un pequeño laboratorio a las de una fermentación comercial a gran escala. La mezcla y la aireación son mucho mas eficientes en el matraz de laboratorio pequeño que en el fermentador industrial grande. A medida que cambia el tamaño del equipo, cambia la relación superficie/volumen. El fermentador tiene un volumen mucho mayor para un área superficial determinada. El escalado de la fermentación en el fermentador industrial es la tarea del ingeniero bioquímico, quien esta familiarizado con la transferencia de gases, la dinámica de fluidos y la termodinámica. El papel del microbiólogo industrial en el proceso de escalado es trabajar estrechamente con el ingeniero bioquímico para asegurar que se han abarcado los parámetros necesarios para una fermentación exitosa y que se dispone de las cepas microbianas apropiadas para una fermentación en gran escala. 24

25 Las distintas etapas de escalado que deben realizarse para llegar de un proceso de laboratorio a un proceso industrial son las siguientes: 1- Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la primera indicación que es posible un proceso de interés industrial. 2- El fermentador de laboratorio, un fermentador a escala pequeña, generalmente de vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En el fermentador de laboratorio es posible ensayar variaciones en el medio de crecimiento, temperatura, ph, etc., ya que los costos son bajos tanto en el equipo como en los medios de cultivo. 3- La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de 300 a 3000 litros. Aquí las condiciones se acercan mas a la escala industrial, pero el costo no es aun un factor de importancia. En el fermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosa instrumentación y un control con computadora, de modo que las condiciones que se obtengan sean lo más similares a las del fermentador industrial. 4- El fermentador industrial mismo, generalmente de a litros 25

26 En los estudios de escalado para los procesos aeróbicos, el parámetro de mayor importancia que se debe controlar durante el aumento de escala es la velocidad de transferencia de oxigeno; se debe mantener la tasa de oxigeno constante al incrementar las dimensiones del fermentador. La tasa de oxigeno expresa el consumo de oxigeno en mmoles de O 2 /l/hora que se requiere para obtener el optimo rendimiento. 26

27 Esquema general de un proceso de fermentación a gran escala. El producto comercial esta usualmente en las células o en la fracción libre de células, pero no en ambas fracciones. De acuerdo a esto una de ambas fracciones debe ser posteriormente procesada (señalada con el símbolo + ) o descartada (señalada con el símbolo - ). 27

28 Antibióticos: aislamiento y caracterización Los antibióticos son sustancias químicas producidas por los MOs que matan o inhiben el crecimiento de otros MOs. Los antibióticos son metabolitos secundarios típicos. Los que se usan comercialmente son producidos por hongos filamentosos y por bacterias del grupo de los actinomicetos. La mayoría se usa para el tratamiento de enfermedades bacteriana y algunos pocos son contra enfermedades fúngicas. Los géneros mas comunes son Streptomyces, Penicillum y Bacillus. Fabricar o producir comercialmente un antibiótico requiere además de un alto rendimiento, desarrollar un método eficiente de purificación. Por ejemplo si el antibiótico es soluble en un compuesto orgánico inmiscible en agua esto implica una purificación sencilla y de bajo costo por la facilidad de poder concentrarlo. Si el antibiótico no es soluble en algún disolvente, hay que separarlo por: a) adsorción; b) intercambio iónico; c) precipitación química. La meta es obtener un producto cristalino de elevada pureza. Para obtener cepas con altos rendimientos el químico debe obtener cepas que no produzcan impurezas indeseables o desarrollar métodos para eliminarlas. 28

29 Aislamiento de antibióticos y método para probar el espectro de actividad antibiótico de un microorganismo La forma tradicional por la que se descubren nuevos antibióticos consiste en el rastreo (screening). Con este tipo de aproximaciones se aísla de la naturaleza, un gran número de posibles MOs productores de antibióticos (a). En estos aislamientos se ensaya la producción de antibióticos viendo si producen cualquier sustancia difusible que inhiba el crecimiento de ciertas bacterias representativas de patógenos bacterianos usadas como control en el test (b). Aquellos aislamientos que sean candidatos de la producción de antibióticos se estudian posteriormente, a fin de saber si los antibióticos que produce son nuevos o no. Cuando se descubre un MO que produce un nuevo antibiótico, éste se produce en cantidades suficientes para poder analizar su estructura y determinar luego su toxicidad y actividad terapéutica en animales infectados. La mayoría de los antibióticos nuevos fallan en el test en animales de experimentación. No obstante la búsqueda continúa ya que se estima que las especies del género Streptomyces producen unos antibióticos diferente. 29

30 Aislamiento de antibioticos Placa de agar Cultivo bacteriano Hongo Halo de inhibición 30

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32 Producción mundial anual y consumo de antibióticos. - Cada año se manufacturan más de 500 toneladas de agentes quimioterapéuticos. - Agente quimioterapéutico es todo compuesto químico que puede usarse por vía interna para controlar las enfermedades infecciosas. Son de gran utilidad en medicina clínica y veterinaria, así como en agricultura. - El elemento clave de todo agente quimioterapéutico es la toxicidad selectiva, es decir, la capacidad de inhibir a las bacterias u otros agentes patógenos sin afectar al hospedador. Se los puede agrupar en dos categorías generales, los agentes sintéticos y los antibióticos. Cefalosporinas inhiben la síntesis de la pared celular. Macrólidos ej. Eritromicina inhibe subunidad 50S (síntesis de proteínas). Quinolonas ej. Ácido nalidíxico interaccionan la DNA girasa. Penicilinas. Inhiben síntesis de pared Aminoglicósidos ej Estreptomicina inhibe subunidad 30S (síntesis de proteínas). 32

33 Modo de acción de los principales quimioterapéuticos antimicrobianos 33

34 Espectro de acción antimicrobiana de algunos agentes quimioterapéuticos seleccionados 34

35 Producción industrial de la penicilina El anillo β-lactámico característico de las penicilinas se muestra en color marrón oscuro. Son producidas por varios hongos de los géneros Penicillum y Aspergillis y por algunos procariotas. La fermentación normal conduce a la producción de penicilinas naturales. Si durante la fermentación de añaden precursores específicos, se forman algunas penicilinas biosintéticas. Las penicilinas semisintéticas se producen añadiendo por métodos químicos una cadena lateral específica al núcleo del ácido 6-aminopenicilánico en la posición R. Las penicilinas semisintéticas son las que tienen la mayor utilidad clínica, puesto que por lo general son activas frente a bacterias Gram negativas y pueden administrarse por vía oral. 35

36 Estructuras de algunas penicilinas importantes 36

37 Cinética de fermentación de la penicilina con Penicillum chrysogenum. La producción de penicilina es un proceso aeróbico, se requiere una aireación muy eficiente. La penicilina es un metabolito secundario. Durante la fase de crecimiento se produce muy poca penicilina, pero una vez que se ha consumido la fuente de carbono casi completamente, empieza la fase de producción de la penicilina. Alimentando el fermentador con diversos componentes del medio de cultivo, se puede alargar por varios días la fase de producción. El licor de maíz es uno de los principales ingredientes de la mayoría de los medios de producción de penicilina. Esta sustancia contiene la fuente de nitrógeno y otros factores de crecimiento. La fuente de carbono es generalmente la lactosa. La penicilina se secreta al medio y una vez que las células se separan por filtración, se baja el ph del medio y se extrae el antibiótico con un disolvente orgánico. Después de concentrarse en el solvente, el antibiótico se vuelve a extraer en medio acuoso a ph alcalino, posteriormente se concentra y cristaliza. Por este método se puede obtener rápidamente penicilina con un alto nivel de pureza. 37

38 Purificación de antibióticos 38

39 Purificación de un antibiótico. Instalación para extraer un antibiótico del caldo de fermentación 39

40 Esquema de la producción de clorotetraciclina con Streptomyces aureofaciens. En su biosíntesis están implicados más de 72 productos intermediarios y los estudios genéticos han mostrado más de 300 genes involucrados en su síntesis. Si bien la regulación de este antibiótico es muy compleja, se sabe que la glucosa y el fosfato reprimen su síntesis. Se utiliza como materia prima el licor de maíz, como en el caso de la penicilina, pero la fuente de carbono es la sacarosa en lugar de la lactosa. Se evita el uso de glucosa porque causa una represión por catabolito en la producción del antibiótico. 40

41 Vitaminas producidas por microorganismos a escala industrial a) Vitamina B 12. Es una cobalamina. b) Vitamina B 2 (Riboflavina) La mayoría de las vitaminas se sintetizan por métodos químicos, sin embargo algunas tienen una estructura muy complicada y se obtienen por procesos biocatalíticos como son la vitamina B 12 y la Riboflavina. En el hombre, una deficiencia importante en la vitamina B12 produce la llamada anemia perniciosa, que se caracteriza por la baja producción de eritrocitos y alteraciones en el sistema nervioso. Los requerimientos de esta vitamina por los animales se realizan a través de la dieta o por la adsorción de la vitamina producida por los microorganismos que colonizan el intestino de los animales. Las plantas no producen ni utilizan vitamina B 12. El rendimiento de esta vitamina se incrementa mucho utilizando cepas sobreproductoras del género Propionibacterium o Pseudomonas y añadiendo cobalto al medio de cultivo. La vitamina B 2 o riboflavina es una coenzima muy importante y es sintetizada por muchos MOs. El hongo Ashbya gossypii produce en forma natural cantidades enormes de esta vitamina (hasta 7g/l). 41

42 Aminoácidos utilizados en la industria alimentaria Los aminoácidos tienen muchos usos en la industria alimentaria, en medicina y como precursores de la industria química. El más importante comercialmente es el ácido glutámico, que se utiliza para aumentar el sabor. Otros aminoácidos importantes son el ácido aspártico y la fenilalanina, que son los ingredientes del edulcorante artificial aspartame, un ingrediente en las bebidas bajas en calorías y en otros productos sin azúcar. 42

43 Si bien la mayor parte de los aminoácidos se puede producir por síntesis química, esta última da como resultado las formas L y D. Si se necesita la forma L, bioquímicamente importante, entonces es necesario aplicar un método de fabricación enzimático o microbiológico. La producción microbiológica de los aminoácidos puede hacerse por fermentación directa, en la cual un microorganismo produce el aminoácido en un proceso estándar de fermentación, o mediante síntesis enzimática, donde el microorganismo es la fuente de una enzima y entonces se utiliza ésta en el proceso de producción. Regulación de la biosíntesis de aminoácidos La síntesis de los aminoácidos se lleva a cabo a través de una serie de etapas en las que intervienen distintas enzimas a partir de precursores de la vía glucolítica o del ciclo del ácido tricarboxílico y su regulación se efectúa por retroalimentación, es decir que la primera etapa enzimática, única para una vía biosintética de un determinado aminoácido suele estar sometida a inhibición por retroalimentación por el producto final de esa vía. Así al aumentar la concentración de un determinado aminoácido, se inhibe la actividad de la enzima que conduce a la biosíntesis de ese aminoácido, dando como resultado una reducción en la síntesis. Una forma de lograr la sobreproducción de un determinado aminoácido es obtener una mutante en la primera y única enzima de esa vía de síntesis del aminoácido, de forma tal que ya no esté sometida a la inhibición por retroalimentación. 43

44 Inhibición de la actividad enzimática por retroalimentación La inhibición por retroalimentación se observa principalmente en la regulación de las rutas biosintéticas complejas, tales como las rutas implicadas en la síntesis de un aminoácido o de una purina. Tales rutas requieren muchas etapas enzimáticas y el producto final, aminoácido o nucleótido, está separado del sustrato inicial por muchas etapas. Aún así el producto final es capaz de retroalimentar la primera etapa de la ruta y regular su propia biosíntesis. En la inhibición por retroalimentación, el aminoácido u otro producto final de la ruta biosintética inhibe la actividad de la primera enzima de esta ruta. Esto se debe a una propiedad de la enzima inhibida conocida como alosterismo. Una enzima alostérica tiene dos sitios de unión importantes, el sitio activo, donde se une el sustrato, y el sitio alostérico, donde se une reversiblemente el inhibidor, llamado a veces efector. Cuando un inhibidor se une, por lo general no covalentemente, al sitio alostérico, la conformación de la molécula de enzima cambia, de manera que el sustrato deja de unirse eficientemente al sitio activo. 44

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46 Mecanismo de inhibición enzimática por un efector alostérico 46

47 Producción de la lisina utilizando Brevibacterium flavum. La lisina es un aminoácido esencial para el hombre y es utilizada como aditivo alimentario. Se produce comercialmente utilizando la bacteria Brevibacterium flavum. La síntesis de lisina, como la de otros aminoácidos se encuentra estrictamente regulada. Para poder obtener los aminoácidos en forma económica es necesario obtener cepas sobreproductoras, es decir que no sufran el fenómeno general de inhibición por retroalimentación. En la vía bioquímica que conduce desde el aspartato a la lisina, esta última puede inhibir por retroalimentación la actividad de la enzima aspartatoquinasa. La sobreproducción de lisina puede obtenerse aislando mutantes en las cuales la aspartatoquinasa no esté sujeta a retroinhibición. Esto se logra aislando mutantes resistentes a un análogo de la lisina, la S- aminoetilcisteína (AEC), que se une al sitio alostérico de la enzima e inhibe su actividad. Las mutantes resistentes a la AEC que se obtienen fácilmente por selección positiva, producen una modificación de la aspartatoquinasa con un sitio alostérico alterado que ya no reconoce la AEC o a la lisina, por lo que la retroinhibición por lisina está muy reducida. Dichas mutantes pueden producir hasta 60 g de lisina por litro en fermentadores industriales. 47

48 Producción de ácido glutámico Un factor muy importante para lograr un proceso de producción comercial de un aminoácido es conseguir la excreción del mismo al medio de cultivo. En general, los organismos no excretan los metabolitos indispensables como los aminoácidos. Aumentando la excreción se evitarían concentraciones relativamente altas dentro de la célula, que podrían ocasionar inhibición por retroalimentación, aún en mutantes resistentes. Una forma de obtener un nivel elevado de excreción de un aminoácido es el que se utiliza en la obtención del ácido glutámico. La producción y excreción del ácido glutámico depende de la permeabilidad celular. El organismo productor del ácido glutámico, Corynebacterium glutamicum, requiere la vitamina biotina, factor indispensable en la biosíntesis de los ácidos grasos. La deficiencia en biotina daña la membrana celular como resultado de una producción deficiente de fosfolípidos y bajo estas condiciones se excreta el ácido glutámico intracelular. El medio empleado para la producción del ácido glutámico contiene en una primera etapa suficiente biotina para obtener un buen desarrollo del microoganismo y en una segunda etapa la deficiencia de biotina asegura la excreción de ácido glutámico al medio. El descubrimiento del papel de la deficiencia en biotina en la producción del ácido glutámico ha permitido el desarrollo de métodos racionales para la formulación de un medio para producir este aminoácido. 48

49 Bioconversión microbiana Los microorganismos pueden usarse para biocatalizar reacciones químicas específicas. Este proceso se denomina bioconversión o biotransformación, e implica el cultivo del MO en fermentadores grandes, seguido de la adición del compuesto químico que ha de ser convertido, en el momento adecuado. Después de un período de incubación, durante el cual el MO actúa sobre el compuesto químico, se extrae el caldo de fermentación y se purifica el producto que se desee. Si bien la bioconversión puede usarse para varios procesos, su principal utilización industrial ha sido la producción de algunas hormonas esteroideas. Producción de cortisona utilizando Rhizopus nigricans Solo la primera reacción es una bioconversión microbiana típica. Esta oxidación altamente específica es realizada por el hongo Rhizopus nigricans y omite una difícil reacción química. Todos los otros pasos se realizan químicamente. 49

50 Enzimas Las enzimas extracelulares (exoenzimas) se secretan al medio de cultivo y son capaces de digerir polímeros insolubles como la celulosa, las proteínas y el almidón; posteriormente, los productos de digestión son transportados al interior de las células donde se utilizan como nutrientes para el crecimiento. Algunas de estas exoenzimas se utilizan en las industrias alimentaria, láctica, farmacéutica y textil, y se producen en grandes cantidades por síntesis microbiana. Las enzimas son biocatalizadores especialmente útiles porque a menudo actúan en grupos funcionales químicos que son únicos, distinguen fácilmente entre grupos funcionales similares de una misma molécula y, en muchos casos, catalizan reacciones de una forma estereoespecífica, produciendo sólo uno de los dos posibles enantiómeros (por ejemplo, el enantiómero-d de un azúcar, o un L-aminoácido. 50

51 Proteasas, amilasas y jarabes ricos en fructosa Las enzimas que más se producen comercialmente son las proteasas, que se usan como aditivos en los detergentes para lavar la ropa. La mayoría de los detergentes que se utilizan actualmente contienen proteasas, amilasas, lipasas, reductasas y otras enzimas. Muchas de estas enzimas se aíslan de bacterias alcalófilas del género Bacillus. Otras enzimas importantes fabricadas comercialmente son las amilasas y glucoamilasas, que se emplean en la producción de glucosa a partir de almidón. La glucosa se convierte luego en fructosa (que es más dulce que la glucosa y la sacarosa) por acción de la enzima glucosa isomerasa. Este proceso lleva a la obtención de un edulcorante rico en fructosa a partir de almidón de maíz, trigo o papa. 51

52 En la conversión del almidón de maíz en el producto llamado jarabe de maíz rico en fructosa funcionan tres reacciones en secuencia, cada una de ellas catalizada por una enzima microbiana diferente. 1- La enzima alfa-amilasa lleva a cabo el ataque inicial sobre el polisacárido almidón, acortando la cadena y reduciendo la viscosidad del polímero. Esta se llama reacción de adelgazamiento. 2-La enzima glucoamilasa produce monómeros de glucosa a partir de los polisacáridos acortados, proceso llamado sacarificación. 3- La enzima glucosa isomerasa lleva a cabo la conversión final de la glucosa en fructosa, proceso que recibe el nombre de isomerización. Las tres enzimas se producen por fermentación microbiana. El producto final de esta serie de reacciones es un jarabe que contiene cantidades aproximadamente iguales de glucosa y fructosa, el cual se puede adicionar directamente a bebidas refrescantes y a otros productos alimenticios. Esto permitió a Estados Unidos usar el almidón de maíz en lugar de importar la sacarosa y ahorrar millones de dólares por años. 52

53 Enzimas microbianas y sus aplicaciones 53

54 Extremoenzimas: enzimas de procariotas que viven en ambientes extremos. Algunos procariotas llamados hipertermófilos, tienen un crecimiento óptimo a temperaturas muy altas y producen proteínas termoestables que funcionan a altas temperaturas. El término extremoenzimas se refiere a enzimas que funcionan en condiciones muy altas o muy bajas de temperatura, ph, salinidad, etc. Los organismos que las producen se denominan extremófilos. 54

55 Enzimas inmovilizadas En algunos procesos biocatalíticos se desea convertir enzimas solubles en enzimas inmovilizadas. La inmovilización no solo facilita la reacción enzimática en condiciones de producción continua a gran escala, sino que también contribuye a la estabilización de las enzimas evitando su desnaturalización. Existen tres aproximaciones básicas para la inmovilización de enzimas. 1- Polimerización (entrecruzamiento, cross-linkage) de las moléculas de enzima. El enlace de unas moléculas de enzima con otras se hace a través de una reacción química con un agente bifuncional de entrecruzamiento como el glutaraldehido. 2- Unión de la enzima a un soporte. La unión puede hacerse por adsorción, enlace iónico, o enlace covalente. Los soportes usados son celulosas modificadas, carbón activado, arcillas minerales, óxido de aluminio y bolitas de vidrio. 3- Inclusión enzimática, que comprende la inclusión de la enzima en una membrana semipermeable. Las enzimas pueden encerrarse en microcápsulas, geles, membranas semipermeables de polímeros, o polímeros fibrosos como el acetato de celulosa. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas y el procedimiento utilizado depende de la enzima y de la aplicación industrial particular. 55

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57 Células inmovilizadas En algunos casos no es necesario utilizar la enzima purificada. Se pueden utilizar células inmovilizadas para utilizarlas en procesos industriales. En general se utilizan para procesos de flujo continuo. Se utilizan instalaciones mucho mas económicas. Un ejemplo es la utilización de células de Bacillus cuagulans inmovilizadas para la conversión continua de jarabe de glucosa en jarabe de fructosa. Este microorganismo es productor de glucosa isomerasa, la enzima que convierte la glucosa en fructosa. 57

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59 Producción de productos de mamíferos por microorganismos modificados por ingeniería genética. El mayor interés esta en la producción de proteínas y de péptidos de mamíferos por medios microbianos, ya que muchos de estos compuestos tienen un alto valor farmacéutico, son costosos y difíciles de obtener por otros métodos. A pesar de la excitante promesa de la ingeniería genética en la biotecnología, lograr la comercialización de un producto es una empresa gigantesca. Además de la correcta clonación y expresión del gen de interés en una bacteria o levadura, y de la purificación del producto deseado, se deben tomar en consideración otros aspectos como las pruebas clínicas y permisos gubernamentales. Cualquier producto sintetizado microbiológicamente, que se intente utilizar en el hombre, debe pasar pruebas clínicas exhaustivas. Por ej., la insulina producida microbiológicamente mediante la tecnología del DNA recombinante ha tenido que pasar pruebas clínicas estrictas con voluntarios humanos, a pesar de que se ha demostrado que la insulina producida microbiológicamente es idéntica a la proteína fabricada por humanos. Si todo va bien en las pruebas clínicas, se puede pedir el permiso oficial, pero esto puede ser un proceso que consume mucho tiempo. 59

60 Ejemplos de productos biotecnológicos importantes, fabricados por medio de DNA recombinante. 60

61 Producción de insulina La insulina es un hormona. Es una proteína pancreática que regula el metabolismo de los carbohidratos en mamíferos. La diabetes es una enfermedad caracterizada por una insuficiencia de insulina y afecta a millones de personas. El tratamiento estándar consiste en la administración de ésta hormona periódicamente en forma oral o inyectable. La hormona proveniente de páncreas de terneros o de cerdos no resulta tan eficaz como la insulina humana y, además, el proceso de aislamiento es caro y complejo. Por esta razón se ha llevado a cabo la clonación del gen de la insulina humana en bacterias. La insulina humana consta de dos polipéptidos (A y B) conectados por puentes disulfuro. Estos dos péptidos están codificados por partes separadas del mismo gen de la insulina. El gen de la insulina codifica la preproinsulina, un péptido más largo que contiene una secuencia señal (implicada en la secreción de la proteína), los polipéptidos A y B de la molécula de insulina activa, y un polipéptido de unión que está ausente en la insulina madura. La proinsulina se forma a partir de la preproinsulina, y la conversión de proinsulina en insulina implica la ruptura enzimática del polipéptido de unión entre las cadenas A y B. 61

62 Procesamiento de la preproinsulina La metionina inicial es eliminada de la cadena antes de que se sintetice la molécula completa de preproinsulina. Tras la eliminación del péptido líder, la molécula de insulina se pliega y el péptido C se elimina originando las cadenas A y B de la insulina. Estas cadenas quedan unidas por puentes disulfuro. 62

63 Hasta el momento se han utilizado dos métodos para la producción de insulina humana en bacterias: (1) producción de proinsulina y conversión en insulina mediante métodos químicos, y (2) producción de las cadenas A y B en dos cultivos bacterianos separados, así como unión de las dos cadenas mediante procedimientos químicos para producir la insulina. Para sintetizar insulina, la secuencia de DNA adecuada se realizó en forma química. La cadena A consta de 63 bases y la cadena B de 90 bases. En la proinsulina existen otras 105 bases adicionales que codifican el péptido C que conecta las cadenas A y B. Se añadieron bases en los extremos para el corte con enzimas de restricción adecuadas que permitieran clonar los fragmentos dentro de un plásmido vector. Para obtener una expresión eficaz, los genes se insertaron debajo de un promotor adecuado de Escherichia coli, pero de manera que el fragmento de insulina se sintetizara como parte de una proteína de fusión para que fuera más estable. Se colocó también un triplete que codifica para metionina en el punto que unía el gen de la insulina con la parte superior del gen de fusión para poder cortar luego el producto formado con bromuro de cianógeno aprovechando la propiedad de que la insulina no tiene residuos metionina en su molécula y el bromuro de cianógeno corta específicamente por los residuos metionina. 63

64 Cuando se utiliza el método de la proinsulina, la proinsulina aislada de las bacterias por el tratamiento con bromuro de cianógeno, se convierte en insulina cuando se forma el enlace disulfuro y se produce la eliminación enzimática del péptido de unión el cual se hace por tratamiento con las proteasas tripsina y carboxipeptidasa B, que no tienen efecto sobre la molécula de insulina. Cuando la insulina se produce mediante los péptidos separados A y B, cada uno de los péptidos se aíslan de un cultivo independiente y las cadenas se separan mediante el corte con bromuro de cianógeno. Las cadenas cortas se conectan luego mediante un tratamiento químico que permite la formación de los puentes disulfuro. En los dos casos el producto final es idéntico a la proteína purificada del páncreas humano y los costos son menores que los requeridos para la purificación de la insulina de cerdos o de terneros. 64

65 Ingeniería genética para la producción de insulina humana en bacterias 65

66 Ingeniería genética aplicada a la producción de xantano Xantomonas campestris es una bacteria Gram negativa del suelo aeróbica obligada que produce el biopolímero xantano de importante valor comercial. Es un exopolisacárido que se produce como un subproducto del metabolismo secundario. El xantano tiene un alto PM y esta compuesto por un esqueleto de celulosa (glucosa-β1,4-glucosa) que tiene el trisacárido manosa-ácido glucurónico-manosa como rama lateral en forma alternada sobre dicho esqueleto. Posee además los sustituyentes acetato y piruvato sobre la primera y tercera manosa lateral. 66

67 El xantano tiene una viscosidad alta, es estable en ambientes físicos y químicos extremos y tiene propiedades similares a las de un plástico. En particular las propiedades físicas lo hacen útil como estabilizante, emulsionante, adelgazante o agente para suspender otros compuestos. Para la obtención exitosa del xantano en forma comercial se deben bajar los costos para lo cual se debe disponer de una fuente de carbono de costo bajo o nulo. Xanthomonas campestris puede utilizar en forma eficiente glucosa, sacarosa y almidón, pero no puede usar lactosa como fuente de carbono. El suero es un subproducto de la manufactura de los quesos. Este consta de 94% a 95% de agua, 3,4 a 4% de lactosa, pequeñas cantidades de proteínas, minerales y compuestos orgánicos de pajo PM. Diariamente se producen enormes cantidades de suero por la industria y son un problema importante. La liberación de este suero a ríos o lagos puede disminuir la cantidad de O 2 disponible y por ende matar a muchos organismos acuáticos. El transporte de estos sueros a distintos sitios para su degradación puede ser extremadamente costoso y puede ser una fuente potencial de contaminación subterránea. Por otra parte los costos para remover los componentes sólidos del suero son prohibitivos. En consecuencia, se han desarrollado muchos esquemas para deshacerse de los sueros en forma creativa. Teóricamente el suero puede ser usado como fuente de carbono para el crecimiento industrial de microorganismos importantes. 67

68 Con esto en mente X. campestris fue modificado genéticamente para crecer sobre suero. Los genes laczy de Escherichia coli, los cuales codifican para la β-galactosidasa y la lactosa permeasa fueron clonados en un plásmido de amplio rango de huésped bajo el control transcripcional de un promotor de un bacteriófago de X. campestris. Esta construcción fue introducida en E. coli y luego transferida de E. coli a X. campestris por conjugación triparental. Los transformantes que mantuvieron el plásmido y que expresaron niveles altos de β-galactosidasa y de lactosa permeasa, utilizan la lactosa como fuente de carbono y produjeron altos niveles de xantano usando como fuente de carbono glucosa, lactosa o suero. 68

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70 Tipos de fermentadores El objetivo de la biotecnología es obtener productos metabólicos útiles a partir de materiales biológicos. La biotecnología comprende dos fases distintas: la fermentación y la recuperación de los productos. Procedimientos de fermentación consisten en: 1- el desarrollo de cepas mediante manipulación genética y/o la regulación del metabolismo 2- la optimización del medio de cultivo 3- el control adecuado de los factores físico-químicos que afectan al rendimiento de las fermentaciones industriales (0 2, Tª, ph, etc.). Recuperación del producto o "procesamiento posterior" (del inglés downstream processing) consiste en: 1- la extracción de los productos 2- la purificación de los productos biológicos 70

71 Cambio de escala Las condiciones para obtener los mejores rendimientos a gran escala no son en general las mismas que las encontradas en pequeña escala. Ej. Un cultivo de 200 ml en un erlenmeyer requieren un motor de 300 w para agitarlo; entonces un cultivo de litros requerirían un agitador con un motor de 15 megawatios. Esto no es cierto ya que el motor sería tan grande como una casa y el calor generado herviría a los microorganismos. 71

72 Proceso típico de fermentación Formulación y esterilización del medio de cultivo. Esterilización del equipamiento. Crecimiento del cultivo de mantenimiento (5 a 10 ml). Crecimiento posterior en un matráz de laboratorio ( 200 a 1000 ml) Prefermentador (10 a 100 litros) Fermentador de producción (1.000 a litros). Al terminar la fermentación las células se separan del cultivo líquido. - Si el producto es intracelular, las células se rompen, se recupera el producto del fluido celular libre de restos celulares. - Si el producto es extracelular, se purifica del sobrenadante libre de células. 72

73 Criterios mas importantes para el diseño de un fermentador 1.- El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante numerosos días, así como para las operaciones de más larga duración. 2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir las necesidades metabólicas de los microorganismos. 3.- El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible. 4.- Debe tener un sistema para el control del ph. 5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras. 6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura. 7.- Las pérdidas por evaporación no deben ser excesivas. 8.- El diseño del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el funcionamiento, recolección, limpieza y mantenimiento sean mínimas. 9.- El tanque debe ser versátil para la aplicación de diversas modalidades de procesos. 73

74 10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea posible, soldaduras La geometría del fermentador debe ser similar a otros tanques más pequeños o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos a diferentes escalas deben emplearse los materiales más baratos que proporcionen resultados satisfactorios Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador. De los 13 puntos mencionados anteriormente, los dos puntos de mayor relevancia que hay que considerar son probablemente: 1- El mantenimiento de un ambiente aséptico. 2- Las condiciones aeróbicas adecuadas. Los fermentadores más ampliamente utilizados a nivel industrial están provistos de mecanismos de agitación, dispersión y aireación así como de sistemas para el control de la temperatura, ph y formación de espuma. 74

75 Tipos de fermentaciones 1.- Fermentación discontinua 2.- Fermentación alimentada (fed-batch) 3.- Fermentación continua 4.- Reactores de enzimas o células inmovilizadas 75

76 1.- Fermentación discontinua Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema cerrado". Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el ph. La composición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa y la concentración de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo de las células observándose las cuatro fases típicas de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte. En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos secundarios). 76