11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : A61K 31/ Inventor/es: Oxford, John, Sidney. 74 Agente: Lehmann Novo, María Isabel

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : A61K 31/0 A61K 31/4 // (A61K 31/0 A61K 31:04) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Alcohol 2,4-diclorobencílico y amilmetacresol contra la infección por HIV. Prioridad: GB Titular/es: The Boots Company plc. 1 Thane Road West Nottingham, Nottinghamshire NG2 3AA, GB 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Oxford, John, Sidney 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Lehmann Novo, María Isabel ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Alcohol 2,4-diclorobencílico y amilmetacresol contra la infección por HIV La presente invención se refiere al uso de formulaciones de alcohol 2,4-diclorobencílico (o 2,4-DCBA) y amilmetacresol (o AMC) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de las infecciones víricas por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV). Las infecciones por HIV se encuentran ahora en todos los países del mundo y el método más importante de transmisión es el sexual. El virus está presente como partículas libres de virus o como viriones intracelulares en las células monocíticas del semen. El virus se transmite por ello de modo relativamente fácil de varón a mujer o de varón a varón. Alternativamente, en una mujer infectada, se encuentra virus libre o fijado a células en el fluido vaginal. Se han encontrado agentes antivíricos existentes que inhiben enzimas importantes del virus tales como transcriptasa inversa (RT), proteasa o integrasa. El primer fármaco utilizado clínicamente, a saber el AZT (o zidovudina, Retrovir TM ), inhibe la enzima RT del virus. Sin embargo, AZT no representa una cura de la infección y no se ha demostrado que impida la propagación de persona a persona. De hecho, uno de los problemas clínicos del fármaco, aparte de su toxicidad, es la aparición de virus fármaco-resistentes y la propagación efectiva del virus fármaco-resistente en la comunidad. Por tanto, debe buscarse un nuevo enfoque contra HIV para nuevos compuestos que puedan destruir o desactivar el virus libre y/o el virus asociado a células directamente por contacto. Estos compuestos se denominan compuestos virucidas. Tales moléculas han sido descritas en el pasado (Oxford et al en App. Microbiology (1971)), pero han sido poco investigados últimamente. Dado que el virión de HIV está rodeado por una bicapa lipídica, sería lógico ensayar moléculas comparables a detergentes en cuanto a su capacidad para romper y disolver la membrana lipídica del virus. Por ejemplo, el agente tensioactivo no iónico nonoxinol-9 ha sido utilizado en la práctica clínica como espermicida y posee actividad anti- HIV directa (Malkovsky et al en The Lancet 64 (1988)). Sin embargo, el compuesto tiene un efecto anti-hiv poco selectivo y, dado que causa toxicidad y destrucción celular después de su aplicación a la vagina, su uso puede de hecho aumentar la infección con HIV (Kreiss et al en J.A.M.A. 268: (1992)). El compuesto alcohol 2,4-diclorobencílico es conocido como agente antiséptico, es decir como agente antibacteriano y antifúngico, véase por ejemplo Martindale The Extra Pharmacopoeia, edición 28ª, página 61, The Pharmaceutical Press (1982). El amilmetacresol o 6-pentil-m-cresol es conocido también como desinfectante utilizado en elixires bucales o pastillas en combinación con alcohol 2,4-diclorobencílico para tratar infecciones bucales, véase por ejemplo Martindale The Extra Pharmacopoeia, edición 28ª, página 49, The Pharmaceutical Press (1982). Un antiséptico se define en The Concise Oxford Dictionary (Oxford University Press, Oxford (1982)) como un agente que contrarresta el desarrollo de sepsis, especialmente por prevención del crecimiento de bacterias. La sepsis se define en el Diccionario Médico de Black (A & C Black, Londres, (1990)) como envenenamiento por los productos del crecimiento de micro-organismos en el cuerpo, y los síntomas generales que la acompañan son los de inflamación. No se ha demostrado hasta ahora que el alcohol 2,4-diclorobencílico ni el amilmetacresol exhiban actividad anti-vírica o antiretrovírica y, en particular, actividad anti-hiv. La Solicitud de Patente Europea A se refiere a recubrir un condón con alcohol 2,4-diclorobencílico que es activo contra el virus del SIDA. Inesperadamente, se ha descubierto ahora que una formulación de alcohol 2,4-diclorobencílico y amilmetacresol tiene actividad anti-retrovírica y causa desactivación de la infectividad del HIV. De acuerdo con la presente invención, se proporciona el uso de una composición que comprende alcohol 2,4-diclorobencílico y amilmetacresol en combinación con una base de sacarosa ácida en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de las infecciones víricas de HIV. En una realización particularmente preferida de la presente invención, se proporciona el uso de una formulación semejante a Strepsil TM de alcohol 2,4-diclorobencílico y amilmetacresol en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de las infecciones víricas de HIV. La composición farmacéutica puede adaptarse para administración por cualquier ruta apropiada, por ejemplo por las rutas vaginal, rectal u oral. Tales composiciones se pueden preparar por cualquier método conocido en la técnica de la farmacia, por ejemplo por mezcla del ingrediente activo con el o los vehículos o excipientes en condiciones estériles. Para la preparación de soluciones y jarabes utilizados en la formulación de la composición, excipientes que pueden utilizarse incluyen por ejemplo agua, polioles y azúcares. Para la preparación de suspensiones pueden utilizarse aceites (v.g. aceites vegetales) a fin de proporcionar suspensiones de aceite en agua o de agua en aceite. Otros excipientes adecuados incluyen por ejemplo aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semi-sólidos o líquidos, etc. Alternativamente, la composición puede formularse como un ungüento, crema, suspensión, loción, polvo, solución, pasta, gel, spray, aerosol o aceite. Cuando se formulan en un ungüento, los ingredientes activos pueden emplearse con 2

3 una base de ungüento parafínica o miscible con agua. Los ingredientes activos pueden formularse también en una crema con una base de crema de aceite en agua o una base de agua en aceite. Pueden prepararse adicionalmente composiciones en las cuales los ingredientes activos están disueltos o suspendidos en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de spray. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración rectal pueden presentarse como supositorios o enemas. Se contempla también que las composiciones pueden incluir anti-oxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos, agentes de suspensión y agentes espesantes. Excipientes que pueden utilizarse incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, odorantes, sales (las sustancias de la presente invención pueden proporcionarse en sí mismas en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable), tampones, agentes de recubrimiento o antioxidantes. Aquéllas pueden contener también agentes terapéuticamente activos además de la sustancia de la presente invención. Las dosificaciones de la sustancia de la presente invención pueden variar entre límites amplios, dependiendo de la edad y el estado del individuo a tratar, etc. y un médico determinará finalmente las dosificaciones apropiadas a utilizar. No obstante, sin quedar ligados a ninguna dosificación particular, se cree que, para administración vaginal, rectal u oral, una composición eficaz de acuerdo con la presente invención (presente usualmente como parte de una composición farmacéutica como se ha expuesto anteriormente) puede ser adecuada en tratamientos de la presente invención como sigue: Los intervalos de concentración adecuados para los compuestos presentes en la composición pueden ser los siguientes: el alcohol 2,4-diclorobencílico puede estar presente en la composición en una concentración de µg/ml a mg/ml, preferiblemente de 0,1 mg/ml a mg/ml, y particularmente de 1,0 mg/ml a mg/ml. La concentración de amilmetacresol en la composición puede ser de µg/ml a,0 mg/ml, preferiblemente de 0 µg/ml a 2,0 mg/ml y particularmente de 0,0 mg/ml a 1,0 mg/ml. Si se desarrollan efectos secundarios, la cantidad y/o frecuencia de aplicación de la composición pueden reducirse, de acuerdo con la práctica clínica normal. En el contexto de la presente invención, el término HIV se extiende a HIV-1, HIV-2 y otros virus afines responsables de la afección médica descrita como Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) o la afección descrita como Complejo Afín al SIDA (ARC). El término HIV es la definición aceptada internacionalmente de los virus conocidos anteriormente por los nombres HTLV-III, LAV y ARV. Forma también parte de la presente invención proporcionar el uso de una composición que comprende alcohol 2,4- diclorobencílico y amilmetacresol en una base de sacarosa ácida en la preparación de un agente para el tratamiento o la prevención de las infecciones víricas de HIV. El agente puede ser un dispositivo anticonceptivo de barrera, o puede adaptarse para administración vaginal o rectal. Las composiciones de la presente invención pueden ser adecuadas para administración vaginal, rectal u oral. Cuando la ruta de administración es vaginal, la composición se puede proporcionar en la forma de un pesario, crema, gel, loción o spray. Cuando la ruta de administración es rectal, la composición puede proporcionarse en la forma de un enema. Dado que una formulación idéntica se ha utilizado desde hace dos décadas o más como pastillas orales de Strepsil TM para combatir infecciones bacterianas, se especula que la mezcla tiene poco efecto deletéreo sobre las células mucosales en esta región. Se propone que dicha ausencia de toxicidad celular en una superficie mucosal humana debería ir acompañada por los efectos virucidas ahora descubiertos contra HIV-1, que la formulación o una formulación similar podría utilizarse como aplicación vaginal o rectal, o como un constituyente en un dispositivo anticonceptivo de barrera para desactivar el HIV por contacto, o utilizarse oralmente para destruir el virus extra-celular y por consiguiente reducir o prevenir la propagación del virus. Una composición de este tipo o un dispositivo anticonceptivo de barrera que contenga una composición de este tipo puede contener también otros agentes activos, por ejemplo un espermicida. El dispositivo anticonceptivo de barrera puede estar provisto también de un lubricante, tal como por ejemplo Vaselina TM o Jalea KY TM. Los dispositivos anticonceptivos de barrera incluyen la vaina viril o condón, el diafragma y el condón femenino o Femidom TM. Como se ha descrito arriba, se contempla también que las composiciones de acuerdo con la presente invención podrían aplicarse a tales dispositivos o estar contenidas en ellos. Así, en otros aspectos la invención proporciona (a) una composición de la invención para uso en aplicación vaginal, rectal u oral o para ser aplicada a un dispositivo anticonceptivo de barrera, tal como un condón o diafragma; y (b) un dispositivo anticonceptivo de barrera, tal como un condón o diafragma, que incorpora una composición de la invención. La presente invención incluye también un producto que comprende alcohol 2,4-diclorobencílico y amilmetacresol 3

4 y una base de sacarosa ácida como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento o la prevención de infecciones víricas de HIV. Las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden utilizarse también como parte de un kit que comprende un dispositivo anticonceptivo de barrera, tal como un condón o diafragma, y opcionalmente un espermicida y/o un lubricante, por ejemplo vaselina TM o Jalea KY TM. El espermicida puede formularse también en cualquier forma conveniente tal como un gel, crema o spray para aplicación subsiguiente como parte del kit. Características preferidas de la invención para las características segunda y subsiguientes de la invención son como para el primer aspecto, mutatis mutandis. La invención se describirá a continuación por vía de ejemplo con referencia a los ejemplos que se acompañan. 1 Ejemplo 1 Preparación de mezcla virucida Se preparó una mezcla virucida para uso en los ensayos de actividad in vitro como sigue. Una preparación comercial de una tableta que contenía 1,6 mg de alcohol 2,4-diclorobencílico (alcohol 2,4-DCB) y 0,6 mg de amilmetacresol (AMC) B.P. se mezcló en ml de saliva tamponada. Esta preparación que contenía los factores activos se conoce como la mezcla virucida. Ejemplo 1 2 Actividad in vitro Virus: Material aislado de Laboratorio de HIV-1, MN 3 4 Células: Células C8166. Se añadió una muestra de HIV-1 a una preparación de alcohol 2,4-diclorobencílico (alcohol 2,4-DCB) y amilmetacresol (AMC) en ml de saliva tamponada (la mezcla virucida). Se añadió por separado una muestra correspondiente de HIV-1 a ml de saliva tamponada sin tratar (la mezcla de control). Las dos mezclas que contenían virus se incubaron durante periodos de 2, 4, y minutos a 37ºC. Al cabo de estos periodos de tiempo particulares, se retiró una muestra de virus de cada una de las dos mezclas y se tituló en células C8166 sensibles en cuanto a infectividad del virus residual. El compuesto no era tóxico para las células C8166. Se repitió el experimento cuatro veces utilizando cantidades diferentes de HIV-1 en la mezcla. Resultados Los resultados de los experimentos se muestran a continuación en la Tabla 1 y la Tabla 2. La cantidad de virus infectivo remanente en la mezcla se expresa como unidades inductoras de sincitios de virus por ml. TABLA 1 Concentración inicial de virus = 6 DI 0 /ml 0 6 4

5 TABLA 2 Concentración inicial de virus = DI 0 /ml 1 2 Los experimentos, cuyos resultados se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2, comenzaron por la incubación de 6 o unidades de HIV-1 inductoras de sincitios infectivos con las dos mezclas. La solución que contenía la preparación de 2,4-DCB y AMC causaba una reducción de 3-4 veces de la infectividad (actividad inductora de sincitios) del virus en ambos experimentos. Obsérvese que HIV induce la fusión celular (o sincitios) en las células sensibles y que esto se utiliza como estimación útil y exacta de la capacidad infecciosa del virus. Ejemplo 2 Efecto del ph sobre la actividad in vitro 3 4 En experimentos ulteriores se investigó el efecto del ph sobre el efecto virucida de la mezcla. La incubación del virus con sacarosa al % no exhibía efecto virucida alguno. Los datos in vitro describen la sorprendente capacidad de una mezcla de dos moléculas orgánicas en una solución ácida que contenía sacarosa y constituyentes iónicos adicionales para reducir en un grado muy significativo la infectividad del HIV-1 vivo infeccioso, pero el ph bajo por sí mismo no anulaba la infectividad del virus. Los compuestos contenidos en la preparación pueden actuar juntos con posibles resultados sinérgicos o pueden tener actividades separadas. Es posible que los compuestos ejerzan su actividad por fijarse a las puntas proteínicas exteriores del virus para anular con ello la absorción del virus en una célula indicadora, por aglutinación del virus, por desnaturalización parcial de la proteína de las puntas, por una acción sobre la bicapa lipídica o por estabilización de la estructura del virus (Oxford y Thomas en Principles of Bacteriology, Virology and Immunology 4 (1990), publicado por Edward Arnold). La eficacia anti-hiv de la mezcla puede mejorarse por reformulación o adición de moléculas similares, pero la formulación corriente tiene la ventaja de una base de datos clínica extensa después de la aplicación de la mezcla de alcohol 2,4- diclorobencílico y amilmetacresol sobre superficies mucosales del hombre para prevenir o tratar males de garganta causados por infección bacteriana. Ejemplos 3 0 Actividad virucida de las formulaciones de 2,4-DCBA y AMC Se estudiaron también por separado los efectos anti-hiv de concentraciones variables de AMC y DCBA. Los resultados de estos experimentos se muestran en las Tablas 3 y 4. Materiales y métodos Reactivo de ensayo 6 Se adquirió AMC como una solución de color amarillo oscuro y se disolvió primeramente en DMSO, después de lo cual se hicieron diluciones ulteriores en saliva artificial (2,4 mg/ml, 1,2 mg/ml, 0,12 mg/ml, 0,06 mg/ml, 0,03 mg/ml, 0,01 mg/ml y 0,007 mg/ml). Se adquirió DCBA como un polvo blanco y se disolvió en DMSO (stock de 0 mg/ml) y se realizaron diluciones ulteriores en saliva artificial (4,8 mg/ml, 2,4 mg/ml, 0,24 mg/ml, 0,12 mg/ml, 0,06 mg/ml, 0,03 mg/ml y 0,01 mg/ml). Cultivos de células Se utilizó la línea de células T humanas C8166 para ensayos virucidas y se cultivaron las células en medio RPMI 16 (de Sigma Chemical Company, Reino Unido) complementado con % de suero de ternero fetal (FCS) desacti-

6 vado por calentamiento (6ºC, min), L-glutamina 2 mm, 0 U/ml de penicilina, 0 µg/ml de estreptomicina y x m 2-mercaptoetanol (Sigma Chemical Company, Reino Unido). Stock de virus Se utilizó en los ensayos un stock de la cepa de laboratorio HIV-1 IIIB que contenía el sobrenadante de cultivo de tejidos exento de células, almacenado en nitrógeno líquido. Antes y después de la congelación, el stock de virus se tituló para asegurar el valor TCID 0 correcto requerido para el ensayo particular. Ejemplo 3 Ensayo virucida 1 Se extendieron células linfoblastoides C8166 en placas de 96 pocillos (180 µl/pocillo) a una concentración de x por ml en seis-replicados en medio de crecimiento. Se mezclaron concentraciones diferentes de los compuestos con un título elevado de HIV-1 IIIB ( 6 TCID 0 ) en una relación de 1: (1 ml total) y se incubaron a 37ºC durante 1 ó 1 minutos. Después de la incubación, se añadió la mezcla de virus/compuesto ( µl) a la fila superior de células C8166. Después de la mezcladura, se transfirieron luego µl a la serie siguiente de pocillos, etc., para dar una serie de dilución de diez veces desde 1 a y se incubaron las placas a 37ºC durante días. TABLA 3 Concentración inicial de virus DI 0 /ml MN 2 3 TABLA 4 Concentración inicial de virus TCID 0 /ml MN

7 REIVINDICACIONES 1. El uso de alcohol 2,4-diclorobencílico y amilmetacresol en combinación con una base de sacarosa ácida en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de infecciones víricas de HIV. 2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el medicamento es adecuado para administración vaginal, rectal u oral Una composición adaptada para administración vaginal o rectal que comprende alcohol 2,4-diclorobencílico y amilmetacresol en una base de sacarosa ácida. 4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3 que se encuentra en la forma de un pesario, enema, crema, gel, spray o loción.. Una composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la cual la composición es adecuada para aplicación a un dispositivo anticonceptivo de barrera. 6. Una composición de acuerdo con la reivindicación, en la cual el dispositivo anticonceptivo de barrera es un condón o un diafragma. 7. Un dispositivo anticonceptivo de barrera que incorpora una composición que comprende alcohol 2,4-diclorobencílico y amilmetacresol en una base de sacarosa ácida Un dispositivo anticonceptivo de barrera de acuerdo con la reivindicación 7 que es un condón o un diafragma. 9. Un kit de partes que comprende alcohol 2,4-diclorobencílico y amilmetacresol y una base de sacarosa ácida como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento o la prevención de las infecciones víricas de HIV.. Un kit que comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, un dispositivo anticonceptivo de barrera, y opcionalmente un espermicida y/o un lubricante. 11. Un kit de acuerdo con la reivindicación, en el cual el dispositivo anticonceptivo de barrera es un condón o un diafragma