UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA EFECTO DE LA PROPORCIÓN DEL AGUA DE COCO EN LA MADURACIÓN Y FERTILIZACIÓN IN VITRO DE OVOCITOS DE VACUNOS TESIS PRESENTADO POR: Bach. GABY DIESE MAMANI BARRANTES PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE: MEDICO VETERINARIO Y ZOOTECNISTA PUNO PERÚ

2 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO - PUNO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA EFECTO DE LA PROPORCIÓN DEL AGUA DE COCO EN LA MADURACIÓN Y FERTILIZACIÓN IN VITRO DE OVOCITOS DE VACUNOS TESIS PRESENTADO A LA DIRECCIÓN DE INVESTIGACIÓN DE LA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA, PARA OPTAR EL TÍTULO DE: MÉDICO VETERINARIO Y ZOOTECNISTA APROBADO POR: PRESIDENTE : DR. NATALIO LUQUE MAMANI. PRIMER MIEMBRO : MG SC. ROLANDO DANIEL ROJAS ESPINOZA. SEGUNDO MIEMBRO :.. ING. ALFREDO DURAND ZUÑIGA. DIRECTOR DE TESIS: DR. MANUEL GUIDO PEREZ DURAND. ASESOR DE TESIS : DR. JORGE MARCELINO ARANIBAR ARANIBAR. 2

3 DEDICATORIA A DIOS, QUIEN ME DIO LOS DONES COMO SON SABIDURÍA, INTELIGENCIA, SENSATEZ, AMOR Y BUENA CONDUCTA. A MIS QUERIDOS PADRES EULOGIO MAMANI Y BENITA BARRANTES ME EDUCARON CON TODOS LOS VALORES, DÁNDOME SU INFINITO AMOR, FORTALEZA EN LOS MOMENTOS MÁS DIFÍCILES Y LA CONFIANZA PARA EL LOGRO DE MÍ PERSONA. A MI HERMANA LIC. ENF. FANNY MARISOL AGRADEZCO POR SER LA RAZÓN DE MI SUPERACIÓN Y POR APOYARME DURANTE MIS ESTUDIOS UNIVERSITARIOS. GABY DIESE 3

4 AGRADECIMIENTOS A DIOS, YA QUE SIN SU BUEN GUIAR NO HUBIERA SIDO POSIBLE EL DESARROLLO DE ESTE TRABAJO. A LA GLORIOSA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO POR LA FORMACIÓN PROFESIONAL RECIBIDA. MI ESPECIAL RECONOCIMIENTO Y GRATITUD AL DR. MANUEL GUIDO PÉREZ DURAND, DR. JORGE MARCELINO ARANIBAR ARANIBAR, DR. NATALIO LUQUE MAMANI, MS. SC. DANIEL ROLANDO ROJAS ESPINOZA Y MG. SC. ALFREDO DURAND ZUÑIGA QUIENES ME BRINDARON SU APOYO ABSOLUTO, VALIOSO APORTE INTELECTUAL, POR SUS CONSEJOS Y ORIENTACIÓN ACERTADA EN LA PRESENTE TESIS. AL DR. CIRO TRAVERSO, DR. JUAN ZEVALLOS, DR. MÁXIMO MELO, DR. BERNARDO ROQUE, DR. JESUS QUISPE, CLEMENTE VILCA Y A TODOS LOS DOCENTES POR SUS ENSEÑANZAS Y ORIENTACIONES ACERTADAS DE LA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA. A MIS AMIGOS/AS ANGEL, FIORE, ABEL, ADE, ADO, ANDER, PERALTA, LUIS ANGEL, LUICEÑO, DARCY, JORGE, WILAR Y SRA. ELY A LA PROMOCIÓN MAMANI DEL INTERNADO CHUQUIBAMBILLA 2011 ME COMPARTIERON SU AMISTAD Y COMPAÑERISMO EN LA VIDA UNIVERSITARIA. A LOS ADMINISTRATIVOS DE LA CIUDAD UNIVERSITARIA, CIP. CHUQUIBAMBILLA Y LA RAYA DE LA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA. AL PERSONAL DEL CAMAL, BETO, SR. EDGAR, JULIO, EVER, RICHARD, ETC. QUE CONTAGIABAN SU CARISMA DE TRABAJO. 4

5 INDICE Pág. I. INTRODUCCIÓN. 2 II. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA Ovarios Ovogénesis Foliculogénesis Desarrollo folicular Fluido folicular Maduración de ovocitos Maduración in vivo Maduración in vitro Obtención de ovocitos Selección de ovocitos Evaluación de ovocitos. 15 a. Descripción del ovocito inmaduro. 15 b. Descripción del ovocito maduro Fertilización 17 Fertilización in vivo 17 Fertilización in vitro Obtención del espermatozoides Factores que influyen en la capacitación in vitro Etapas de la FIV Medios de incubación 22 5

6 Preparación del ovocito para la fecundación Preparación de medios PBS TCM Agua de coco 26 a) Principales componentes del agua de coco.. 27 III. MATERIALES Y METODOS LUGAR EXPERIMENTAL MATERIAL EXPERIMENTAL METODOLOGIA Técnica de recuperación de ovarios y ovocitos Evaluación y selección de ovocitos Maduración de ovocitos.. 30 a) En tubo 30 b) En placa Evaluación de maduración en tubo y placa Capacitación de los espermatozoides Fertilización in vitro Evaluación de fertilización método estadístico 36 IV. RESULTADOS Y DISCUSION V. CONCLUSIONES VI. RECOMENDACIONES.. 48 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 49 VIII. ANEXOS 58 6

7 CUADROS Cuadro 1. Categorías de complejo cúmulus ovocitos (COC).. 11 Cuadro 2. Principales componentes del agua de coco.. 27 Cuadro 3. Distribución de ovocitos para la maduración de ovocitos 28 Cuadro 4. Distribución de ovocitos maduros del mejor tratamiento TCM-199 fertilizados en tubo

8 IMÁGENES IMAGEN 1.Los ovarios de las vacas sacrificadas fueron colectados en bolsas de polie tileno que contenían solución salina (0.9 % Na Cl) + antibióticos (100 ul/ml de penicilina + 1 mg de estreptomicina), dentro de un termo con agua caliente a 35 0 C, fue transportado al Laboratorio de Reproducción Animal en 3 a 4 horas 66 IMAGEN 2. La recolección de los ovocitos se realizó por el método de aspiración folicular, mediante la punción de los folículos de 2 a 8 mm con ayuda de una aguja 21 G X 1 ½ adosado a una jeringa de 5 ml y se aspiró los mismos con una presión de 12 ml/ minutos (velocidad del embolo de la jeringa). 66 IMAGEN 3 y 4. Para la maduración de ovocitos en tubo se utilizó un tubo de ensayo de vidrio de capacidad de 12 ml, se le colocó 0.7 ml de medio de maduración (2.5% ó 5.0% de agua de coco ó TCM-199) 2 h antes en la incubadora a C y 5% de CO2 para recibir a los ovocitos. 67 IMAGEN 5 y 6. Materiales en la platina térmica y cultivo en placa el envase se sumergió completamente baño maría y asegurándose adecuadamente, dejándose por 24 h a una temperatura de 38.5 C para su correspondiente maduración, con una permanente supervisión. 67 IMAGEN 7. Los ovocitos madurados en tubo y placa después de 24 h de incubación, fueron evaluados en una placa petri tomando en cuenta el grado de expansión de las células del cúmulus del ovocito en el microscopio estereoscopio a un aumento de 400 X. 68 IMAGEN 8. En la placa petri, los ovocitos fueron evaluados con ayuda de microscopio estereoscopio a un aumento de 400 X. 69 IMAGEN 9. Una vez vorterizado los ovocitos fueron depositados en una placa petri con la finalidad de visualizar el primer corpúsculo polar, a través del microscopio estereoscopio invertido a un aumento de 400 X, donde el ovocito con presencia del corpúsculo polar fue considerado maduro. 69 IMAGEN 10. Los ovocitos maduros de grado de expansión 3 se colocó en un tubo de ensayo de vidrio con 0.5 ml de fluido folicular agregándolo 2 a 5 x 10 6 espermatozoides/ml. 71 IMAGEN 11. Los ovocitos incubación en tubo por 41 h, fueron evaluados en una placa petri tomando en cuenta el grado de expansión de las células del cúmulus del ovocito en el microscopio estereoscopio a un aumento de 25 X. 71 IMAGEN 12. Evaluación en el microscopio. 72 IMAGEN 13. Se observó los probables cigotos pronúcleo masculino y pronúcleo femenino. 72 8

9 RESUMEN El presente trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio de Reproducción Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNA-Puno. El objetivo fue determinar la efectividad en la maduración de ovocitos en el método tubo y placa aplicando medios de agua de coco 2,5 y 5% y TCM-199 y evaluar el porcentaje de fertilización in vitro con el mejor tratamiento de maduración de ovocitos. Se utilizaron ovarios obtenidos de vacas del camal Municipal de Juliaca, los folículos mayores de 2 a 8 mm de diámetro fueron aspirados utilizando una jeringa de 5 ml adosado a una aguja de 20 G x 1.5 pulgadas. Los ovocitos fueron madurados de acuerdo al número de capas de células de los cúmulus y la apariencia del citoplasma. La fertilización se realizó con el medio TCM-199 por el método de tubo. Los resultados obtenidos fueron en tubo 71.30%, 61.55% y 58.99% con los medios de maduración TCM-199, 2.5% Y 5.0% agua de coco respectivamente (P< 0.05), comparado con el método placa que solo se obtuvo 45,08%, con el agua de coco al 2,5% (58.33%), mientras con 5% de agua de coco, el porcentaje fue menor (39,34%), siendo diferentes (P< 0.05). La fertilización in vitro fue de 23.5%. En conclusión, el mayor porcentaje de maduración in vitro de ovocitos de vacunos se obtuvo por el método de maduración en tubo, siendo los mejores medios el TCM- 199 y 2.5% agua de coco en la maduración de ovocitos de vacas. Palabras claves. Agua de coco, Cúmulus, fertilización in vitro, Maduración in vitro, ovocitos. 9

10 I. INTRODUCCION Las tecnologías reproductivas tienen gran valor sobre el control endocrino de los cambios moleculares y los procesos metabólicos que regulan el desarrollo temprano de los folículos ováricos como las tecnologías aplicadas como la fertilización in vitro; ofrece la oportunidad de aumentar el número de descendientes de genotipos superiores la biotecnología permite la producción de embriones en gran escala de hembras bovinas faenadas de alto valor productivo. Los indicadores y la eficiencia reproductiva de los bovinos dependen del nivel cultural técnico de los ganaderos hasta generar y consolidar criterios como los principios sostenibles fundamentales en los aspectos ecológicos, económicos y sociales así mismo crear una conciencia capaz de dar visión sistemática de lo que se pierde por cada día improductivo en una vaca y el impacto social que genera (Xu et al., 1986). Tradicionalmente se han usado para madurar ovocitos bovinos medios complejos suplementados con albumina, sueros y/u hormonas (hormona gonadotropina equina y hormona gonadotropina humana), los ovocitos bovinos reinician la meiosis en una gran variedad de medios que van desde una solución salina simple (Leibfried et al., 1989), se ha comprobado que el medio utilizado afecta no solamente a la capacidad posterior de maduración y fecundación sino que también al desarrollo embrionario (Schvellander et al., 1990 y Bavister, 1992). El agua de coco viene a ser una solución estéril, ligeramente acida natural conteniendo proteínas, sales, azucares, vitaminas, factores de crecimiento (fitohormonas) y extractos de fosfolípidos, además en su composición electrolítica se aproxima más al fluido intracelular que al plasma extracelular estos cationes predominantes son el potasio, calcio, 10

11 magnesio, sodio, cloro, y fosfatos pero en concentraciones más bajas dentro de las principales vitaminas de agua de coco está presente el complejo B y ácido ascórbico y por ultimo antioxidante (vitamina C) (Gopikrishna et al., 2008). La finalidad de este trabajo fue investigar parte de los problemas que se tiene en la ganadería del como vacas con problemas reproductivos que se destinan al sacrificio; Aprovechar la técnica de recuperación de ovocitos de los ovarios de las vacas sacrificadas en el camal, para su posterior maduración, fertilización, cultivo y transferencia de embriones producidos in vitro. Los objetivos fueron: Determinar la efectividad de la maduración de ovocitos según el método tubo y placa aplicando medios como agua de coco 2,5 y 5.0% y TCM -199 y evaluar el porcentaje de fertilización in vitro con el mejor tratamiento de maduración de ovocitos. 11

12 II. REVISION BIBLIOGRAFICA 2.1 Ovarios Son los órganos principales del aparato reproductor de la hembra tienen forma oval con un tamaño de 1,5-5 cm de largo y 1-3 cm de ancho está constituido por medula y corteza posee una potencialidad de ovocitos al nacimiento de además contiene el patrimonio genético en miles de folículos primordiales desde el nacimiento algunos de ellos inician el desarrollo en sucesión hasta convertirse en folículos cavitarios de 10 mm las arterias están dispuestas en una espiral bien definida. Las fibras de colágena y reticulares, vasos sanguíneos, vasos linfáticos, nervios y fibras de músculo liso (Hafez, 1996; Massimiliano, 2005; Peters y Ball, 1991). En la superficie del ovario se pueden encontrar dos estructuras diferentes: folículos y cuerpo lúteo; Los folículos son estructuras llenos de fluidos que contienen los óvulos en desarrollo. Se pueden encontrar varios folículos en cada ovario que varían en tamaño desde apenas visibles hasta 20 mm en diámetro. El folículo más grande sobre el ovario es considerado "el dominante" y es el que probablemente ovule cuando el animal entre en celo más del 95% de los otros folículos entran en regresión y mueren sin ovular siendo reemplazados por una nueva generación de folículos en crecimiento y las funciones del ovario son exocrinas liberación del ovulo y endocrinas esteroidogenesis. En bovinos tienen la forma de almendra constituido por medula y corteza; corteza ovárica contiene folículos ováricos, el cuerpo lúteo es el segundo más irrigado después del cerebro (Hafez, 2000). 2.2 Ovogénesis Es el proceso de formación y desarrollo del ovocito, comienza con las ovogonias que se derivan de las células germinales primordiales en el embrión este proceso 12

13 comienza antes del nacimiento cuando células del origen epitelial se van agrupando alrededor de la membrana limitante del ovocito. Las células germinales primordiales se diferencian del epitelio del saco vitelino durante el desarrollo embrionario migran a través del mesenterio y se exteriorizan en las crestas genitales. Todos los óvulos potenciales alcanzan la gónada primitiva en esta fase temprana y prolifera alrededor del día 50 hasta el día 130 de la gestación. La célula germinal del primordio se convierte en una ovogonia cuando la gónada primitiva se diferencia en ovario (Salisbury et al., 1987; Alvaro, 2003; Gigli et al., 2006). Desarrollo de óvulos y folículos; comienzan la meiosis durante el desarrollo fetal las ovogonias sufren una serie de divisiones mitóticas que finalizan en la formación de ovocitos en el bovino se observan figuras meióticas a partir del día 82 de gestación (Gigli et al., 2006). El núcleo de estos ovocitos es casi esférico y su crecimiento es proporcional a la variación de tamaño de todo el ovocito. En esta fase hay un cuerpo vitelino junto al núcleo una zona mitocondrial que rodea a la centrosfera, núcleo y un citoplasma periférico. Poco después conforme se produce el crecimiento las mitocondrias se fragmentan y se dispersan por todo el citoplasma o en su periferia. Los cuerpos de Golgi se hallan al principio reunidos a un lado del núcleo y alrededor de la centrosfera y m ás tarde se diseminan por todo el citoplasma (Salisbury et al., 1987). La ovogénesis comienza en la vida intrauterina entendiendo como tal el proceso que permitirá a una célula llegar a ser el gameto femenino con plena capacidad de ser fecundado a partir de unas células indiferenciadas se producen las células germinales primordiales (Byskov, 1982). 13

14 2.3 Foliculogénesis La foliculogénesis ocurre en estado fetal, animales prepúberes y durante la gestación. Un folículo primordial está compuesto por un ovocito con crecimiento detenido antes del nacimiento en la fase de diploteno de la profase I de la meiosis rodeado por una sola capa de células de la pregranulosa, la formación de folículos primordiales ocurre durante el periodo fetal (Roberts, 1971) también refiere que el crecimiento folicular desarrollo a un folículo de graaf y ovulación ocurre solamente en hembras vacías después de la pubertad y durante el ciclo reproductivo. Estudios realizados por (Hafez, 2000) indican que los folículos primordiales inician su crecimiento y diferenciación en un proceso aparentemente continuo pero irreversible que es conocido como foliculogénesis y cuando un folículo primordial entra al grupo de crecimiento este será conducido a uno de dos hechos: la degeneración por atresia (sufrida por el 99% o más) o la ovulación alcanzada por muy pocos. El intervalo requerido para la activación de un folículo primordial durmiente hasta su ovulación ha sido estimado en 180 días (Liebfried et al., 1987) aparentemente son necesarios 60 días. Cuando la capa de células de la granulosa se transforma de aplanadas a cuboidales y la teca interna comienza su diferenciación al folículo en desarrollo se le denomina folículo primario; su crecimiento al siguiente estadio que es el de folículo secundario, se completa por la proliferación de las células de la granulosa. Los folículos en estos dos estadios se describen colectivamente como preantrales (Fernández, 2003). La formación de la cavidad del folículo que forma el antro líquido es el siguiente estadio en su desarrollo y los folículos antrales existen en el ovario bovino con diámetros comprendidos en el rango de 0.1 a 20 mm generalmente se acepta que la formación del antro es un evento influenciado por las gonadotropinas y que la FSH es la principal hormona responsable (Hafez ESE y Hafez, 2000). 14

15 2.4 Desarrollo folicular Las hembras de las especies domesticas nacen con un número determinado de ovocitos gran parte de los cuales sufrirán atresia y nunca serán ovulados. A lo largo de la vida de la hembra los folículos primordiales permanecen en un estado de reposo y cada cierto tiempo algunos son seleccionados para desarrollarse. La onda folicular es un proceso continuo que culmina ya sea con la ovulación del folículo maduro o con la regresión del mismo (Galina y Valencia, 2008). El crecimiento y maduración folicular representa una sucesión de transformaciones subcelulares y moleculares de diversos componentes del folículo: el ovocito, granulosa y teca regidas por varios factores intraovaricas e intrafoliculares y señales hormonales que conducen a la secreción de andrógenos y estrógenos principalmente estradiol. En el crecimiento folicular intervienen la proliferación y la diferenciación de células de la teca y de la granulosa lo que finalmente causa un incremento en la capacidad de los folículos de producir estradiol y de reaccionar gonadotropinas. La producción de estradiol determina cual folículo adquirirá los receptores de LH necesarios para la ovulación y luteinización. Las perturbaciones en la respuesta de la granulosa y teca a las señales gonadotropinas interrumpen el crecimiento folicular e inician la atresia (Hafez, 2000). Esta discrepancia entre in vivo e in vitro indica que son necesarias las inter acciones entre las células de la granulosa y otros tipos de células ováricas intersticiales o tecales para la estimulación óptima de las células de la granulosa por la FSH por (Fernández, 2003). Prácticamente todos los folículos de los ovarios de la hembra sufren atresia evento que puede ocurrir en el periodo prenatal, porque una vaca de 10 a 14 años tiene hasta 15

16 25000 ovocitos presentes (cerca del 99,9% de los folículos no llegan a la ovulación) también una vaca a los 10 años teniendo un parto al año tan solo puede ovular de 30 a 50 ovocitos. Además esto puede ser demostrado si se calcula que un animal ciclando normalmente en un periodo de 15 años va a ovular menos de 300 ovocitos (ovulando cada 21 días o 17.4 veces al año en 15 años igual a 260 ovulaciones y que por cada folículo que llega a término 12 folículos sufren atresia) dentro de los 0.7 millones existentes al nacimiento (Liebfried et al., 1987) 2.5 Fluido folicular El fluido folicular es una solución ligeramente que se origina de trasudación de la sangre a través de las capas de la granulosa tiene un ph de 7.4 similar al plasma (Salisbury et al., 1978). El fluido folicular cumple diferentes funciones por sus compo nentes que posee y son esenciales para la fisiología del ovario esteroriogenesis, crecimiento folicular que se le conoce como maduración de los ovocitos en la ovulación y transporte del ovocito por el oviducto (Gordon, 1999). El fluido folicular también provee otras funciones al ovocito y granulosa facilitando el transporte de los nutrientes del plasma sanguíneo (Hafez ESE y Hafez, 2000). Los componentes básicos del FF con actividad fisiológica: Proteínas (albuminas, globulinas, IgA, IgM, fibrinógeno, lipoproteínas y péptidos), Aminoácidos; asparagina, treonina, glutamina, glicina y alanina. Enzimas (intra-extracelulares), Carbohidratos (glucosa, fructuosa, galactosa y manosa), Glucoproteinas (glucosamina, galactosamina, ácido hialuronico, sulfoglucosaminoglucanos, heparina y plasminogeno), Gonadotropinas (FSH, LH y prolactina), Esteroides (colesterol, andrógenos, P 4 y E2), Prostaglandinas; 16

17 PGe y PGF2, Iones (Na, K, Mg, Zn, Cu, Ca, S, Cl y P), Inmunoglobulinas (IgG, IgA) (Salisbury et al., 1978). También es muy útil para la capacitación in vitro para espermatozoides. 2.6 Maduración de ovocitos Maduración. Consiste en propiciar la progresión en el desarrollo del óvulo de la vaca o novilla, una vez obtenido de ovarios de matadero o animales vivos por aspiración folicular y transvaginal respectivamente. Esto se logra colocando estos óvulos en medios enriquecidos y suplementados con hormonas, como la hormona folículo estimulante (FSH), su sintético ecg la hormona luteinizante (LH) su sintético hcg durante un periodo de 24 horas (Hafez, 2000) Maduración in vivo El ovocito del folículo preovulatorio se encuentra en profase meiotica hasta la ovulación. Debido al pico de LH que se produce previo a la ovulación se activa la continuación de la meiosis, de manera que horas antes de la ovulación se rompe la vesícula germinal, se forma el primer cuerpo polar y la meiosis prosigue hasta la metafase II. La meiosis no se completa hasta luego de la fertilización cuando penetra el espermatozoide (IRAC 2004) Maduración in vitro Entre las nuevas tecnologías desarrolladas durante la pasada década esta la producción en el laboratorio de embriones de vacuno a partir de ovocitos recuperados de ovarios obtenidos en el camal, estos ovarios proporcionan una adecuada y abundante fuente de ovocito ovocitos a bajo costo, los cuales son susceptibles de madurar y fecundar in vitro, el acceso a tal producción de embriones hace 9 años en Dublín fue gracias a un medio indefinido de maduración in vitro (IVM) con fecundación in vitro (IVF) en solución de Tiroides modificada (TALP) conseguir en el laboratorio que el ovocito siga los mismos pasos similar 17

18 al periodo de maduración folicular previo a la ovulación in vivo (Gordon, 1996). La maduración del ovocito abarca 3 maduraciones como: madurac ión nuclear, maduración citoplasmática y maduración de las células foliculares; el aumento de la producción de gonadotropinas durante el período preovulatorio estimula la reanudación de la meiosis se requieren unas 6-8 horas más para la maduración del citoplasma en este momento ocurren con rapidez dos divisiones celulares una inmediatamente antes de la ovulación la otra antes de la fertilización. La primera división tiene carácter mitótica en la que el complemento cromosoma del ovocito reduce por la mitad a 30 en vez de las cuatro células producidas por estas divisiones solo se forma una más pequeño cuerpo polar en cada división: estos cuerpos polares son la otra mitad de la división celular pero carecen de la mayor parte de su citoplasma estos cuerpos polares se degeneran (Peters y Ball, 1991) Obtención de ovocitos Pero el método más usado es el de la obtención de ovocitos desde ovarios de vacas de matadero. Uno a través de la aspiración de folículos de un determinado diámetro (2-6 mm), ya sea con jeringa el principal inconveniente de la aspiración de folículos además de la baja tasa de recolección, es el daño ocasionado al cúmulus ophoforus durante la aspiración, pero tiene la ventaja de ser tres veces más rápido que otros procedimientos. El efecto de la temperatura sobre el ovocito en el período que va desde la obtención de los ovarios en el matadero hasta que ellos son procesados para extraer los ovocitos tiene consideraciones importantes. Generalmente los ovocitos son recuperados 1-2 horas después del sacrificio de los animales. (Lonergan, 1991) Selección de ovocitos. El uso de técnicas in vitro para producir embriones luego de la maduración, 18

19 fecundación y cultivo, ha estimulado a varios grupos de investigación a buscar métodos no invasivos al momento de seleccionar ovocitos aptos para su maduración (Madison et al., 1992).La idea de seleccionar ovocitos en base a una evaluación visual fue realizada por Leibfried-Rutledge y First (1979). Sus resultados sugirieron la importancia de las células foliculares para completar la maduración nuclear y citoplasmática de ovocitos de bovino basándose en la compactación y cantidad de células que rodean al ovocito (First, 1995), además de la homogeneidad del citoplasma, los ovocitos de mamíferos son dependientes del aporte de diversos factores por parte de las células foliculares y la presencia de múltiples conexiones directas de éstas con el ovocito. Este sistema facilita la producción de nutrientes y su transporte hacia el ovocito y genera señales que controlan y regulan el metabolismo del ovocito, así como también la maduración nuclear y citoplasmática (Madison et al., 1992). Cuadro 1. Categorías de Complejo Cúmulos Ovocito (COC). CATEGORIA Nro. de células Cúmulus Citoplasma A Capas múltiples, compactas de Homogéneo y células de cúmulus (> 4). transparente B Capas múltiples, compactas de Homogéneo con células de cúmulus (1 a 3). zonas periféricas oscuras. C Desnudados Irregular con zonas oscuras. D Células expandidas Irregular con zonas oscuras. Fuente: Lonergan et al., Al cúmulus se le ha atribuido una serie de funciones tanto mecánicas como fisiológicas entre las cuales se describen: o Proporciona al ovocito de sustancias nutritivas durante su estadía en el folículo (Hyttel, 1986). o Luego de la ovulación, actúa como medio de protección para e l ovocito durante el transporte de éste desde el folículo hacia la ampula del oviducto (Austin, 1982). 19

20 o Incrementa el área de contacto entre el ovocito y espermatozoide (Cox, 1993). o Actúa como barrera para espermatozoides parcialmente capacitados (Gandarillas, 1996). o Tiene un efecto positivo sobre la capacitación del espermatozoide (Hyttel,1989) o Influye sobre el espermatozoide para producir reacción del acrosoma (Chian y Okuda, 1994). o Controla la poliespermia (Cox y Hormazaba, 1993). Blume et al. (1997) realizaron el estudio de sistemas de incubación y medios de cultivo para producción in vitro de embriones bovinos obteniendo en grupo control TCM-199, agua de coco natural, agua de coco SFB y agua de coco BSA con 66%, 80 %,60 % y 54 % respectivamente de maduración. Mostrando similitud con resultados de agua de coco. Kurtz et al. (2002) Donde obtuvieron 71.50% utilizando para la maduración de ovocitos en tubo el medio de TCM-199, se le adiciono 220 mg de piruvato de sodio, 10% SFB, los tubos ensayo de material vidrio de 5 ml se llenaron con el medio TCM-199, luego fueron colocados en baño maría a C para adquirir la temperatura adecuada previo a ser utilizados para el cultivo. Comparado al método placa lograron 58.76% en incubadora convencional y baño maría, respectivamente. Larocca, (2008) evaluaron el efecto de la adición de líquido folicular bovino (FF) para los medios de cultivo en la maduración in vitro (MIV). El FF fue extraído de folículos de 15 mm de diámetro y obtuvo 72.5 % un medio de maduración (95% de Fluido folicular + 5% de suero fetal bovino) a 22 y 24 horas. La obtención de un porcentaje 20

21 similar de maduración puede deberse a que este autor realizo la maduración en placa e incubadora con gasificación controlada este resultado similar se sustenta a que encontraron evidencia de una relación inversa entre el tamaño del folículo y la capacidad del fluido folicular para inhibir la maduración nuclear el fluido folicular de folículos de más de 8mm no tuvo una acción inhibitoriasuplementado con piruvato de sodio más LH mas SFB. Cañon et al. (2010) De total de 588 ovocitos fueron evaluados citogenética de ovocitos maduración in vitro en vacas criollas con TC M -199, se clasificaron según su calidad en categorías A, B, C y D para madurar se dividieron en tratamientos fueron madurados por 24 horas a 39 0 C en 5% de CO2 y ambiente húmedo el TCM- 199 fue suplementado con piruvato de sodio, antibiótico, LH, 17β estradiol y 10% de SFB y para control TCM-199. La tasa de maduración in vitro de ovocitos bovinos en tratamiento hormonal 81 (30.8%) y 182 (69.2%) la diferencia significativa encontrada (P 0.05, respectivamente). Báez et al. (2010) El objetivo fue evaluar la capacidad de desarrollo in vitro de ovocitos bovinos, los ovocitos fueron recuperados de un matadero comercial, se realizó por la técnica de corte los ovocitos tenían al menos una capa de células de cúmulos y un citoplasma homogéneo. La tasa de maduración de ovocitos fue 66.17% de maduración de ovocitos. Hernández Fernández (2010) Con el objetivo de evaluar el efecto de la suplementación con L-cisteína sobre la maduración in vitro de ovocitos bovinos, se llevó a cabo un experimento con ovarios obtenidos de vacas mestizas beneficiadas en una sala de matanza local. Se utilizaron tres tratamientos con diferentes concentraciones T1: 0 mm; T2: 0,1 mm y T3: 1,0 mm. Aproximadamente 400 Complejos Cumulus Ovocito (COCs) por tratamiento se maduraron en pozos de 500 µl del medio de maduración (TCM-199), 21

22 distribuyéndose 50 COC por pozo en una incubadora a 5% de CO2, a 38,5 C y con humedad saturada. No se observaron diferencias significativas entre los tratamientos en el porcentaje de ovocitos que llegaron a Metafase II (MII, T1: 72,77%, T2: 67,47% y T3: 70,43%). Los resultados indican que la suplementación con L-cisteína durante la maduración ejerció un efecto sobre el porcentaje de ovocitos bovinos que alcanzaron el estado de MII, sin embargo se deben realizar otras investigaciones para determinar el efecto ulterior que tiene la L- cisteína adicionada en la maduración sobre la fecundación y el desarrollo embrionario in vitro. De los Reyes M, et al., Determinaron la Evaluación de ovocitos de vaca para maduración en cultivo, cada categoría se incubó en forma separada depositando 10 ovocitos por gota de 50ul de medio TCM-199, suplementado por 24 horas a 39ºC en aire con 5% de CO2, fueron las que obtuvieron las tasas de categoría A y B de maduración de ovocitos in vitro, 75,3% y 68.6% (P 0.05, respectivamente) no difiriendo entre ellas. Se concluye que la selección de los ovocitos previo a la maduración, incrementara maduración de ovocitos. Lonergan et al. (1991) realizaron por el método de aspiración con un total de 289 ovarios se obtuvo 74 % de maduración in vitro. Ocoña et al.,(1999) estudiaron producción in vitro de embriones de bovinos influencia de la suplementación sérica y hormonal los índices de maduración ovocitaria en presencia de los suplementos y hormonas fueron superiores significativamente (P 0.001, respectivamente) fueron madurados por 24 horas con TCM-199, ECS+TCM, FCS+TCM 4 IU/mL ecg + 2 IU/mL hcg mas TCM-199 y para control fueron 80.4 %, 78.3 %, 85.0 % y 51.9 % respectivamente donde concluyeron que la adición de suplementos séricos y hormonales al medio de maderación mejora los índices de maduración ovocitaria y subsiguiente índices de fecundación y división in vitro de ovocitos bovinos. 22

23 Fukui et al., (2009) evaluaron folicular para la maduración y fertilización de in vitro de bovinos la recuperación de ovocitos por los métodos reportaron 57.9 % y 52.2 % de maduración intrafolicular y extrafolicular respectivamente porque utilizaron TCM-199 cultivando por 28 horas de maduración con un ph 7.1 donde es el adecuado según otros autores. Fernández (2010) se recuperaron 670 ovocitos de ovarios obtenidos del camal, fueron cultivados con TCM-199 la maduración fue 32.1% de maduración, estos valores al presente trabajo posiblemente debido a otros factores que no son considerados como la composición de los gases y el ph de medios de maduración Evaluación de ovocitos a) Descripción del ovocito inmaduro El ovocito aislado de su folículo presenta un núcleo grande situado periféricamente rodeado de la membrana nuclear y con un nucléolo apenas visible en los ovocitos bovinos (De Looset al., 1992). El espacio perivitelino no existe o es muy pequeño y la zona pelúcida se encuentra atravesada por las prolongaciones de las células de la corona radiada constituyéndose como uniones intercelulares. Estas uniones llegan incluso hasta el interior del ovocito y sirven como puente de unión entre éste y las células del cumulo que le rodean y también entre ellas mismas. Estas vías de comunicación celular pueden ocupar hasta el 1% de la superficie total de la membrana plasmática del ovocito (Moor y Gandolfi, 1987).El ovocito inmaduro presenta el cumulo células compacto e incluso dificulta la visión del propio ovocito (Leibfried y First, 1979). 23

24 b) Descripción del ovocito maduro Se caracteriza por la expansión total del cumulo celular y por la presencia del primer corpúsculo polar en el espacio perivitelino (Leibfried y First 1979, Xu et al., 1986). A nivel nuclear los cromosomas presentan la configuración de metafase II. Los cambios citoplasmáticos no se completan hasta las 30 horas de haber comenzado la maduración aunque nuclearmente la maduración finaliza a las 24 horas (Hyttel, 1988). Estos cambios citoplasmáticos incluyen sobre todo dos procesos: la colocación de los gránulos corticales a la periferia, situándose bajo la membrana plasmática (Ducibella et al., 1988) y el agrupamiento de mitocondrias y retículo endoplasmatico rugoso en cisternas de gran tamaño (De Loos et al., 1992). En esta fase final de la maduración sigue existiendo una alta actividad de síntesis proteica con el fin de preparar al ovocito nuclear y citoplasmática para la fecundación (Moor y Gandolfi, 1987; De Loos et al., 1992). Las diferencias más notables entre ambos tipos de maduración estriban fundamentalmente en que los ovocitos madurados in vitro sufren por un lado un retraso en la migración de los gránulos corticales a la perifiere del ovocito (Hyttel et al., 1986) presentan un mayor número de prolongaciones celulares provenientes de las células de la corona radiada en el espacio perivitelino (De Loos et al., 1992).Por lo tanto los criterios que se aseguran que ha ocurrido la maduración según (De Loos et al.,1992). Extrusión del primer corpúsculo polar y llegada al estadio de metafase II. Expansión y musificación del cumulo celular. Traslado de gránulos corticales a la periferia del ovocito. Desaparición de las uniones intercelulares. 24

25 Aunque estos criterios de maduración son aceptados por la mayoría de los autores; todos ellos están de acuerdo en que el mejor criterio de una correcta maduración es comprobar la capacidad del ovocito para ser fecundado y seguir su desarrollo embrionario de una manera completamente normal (Hyttel, 1988; De Loos et al., 1992) Fertilización Consiste en la conjunción de la célula masculina y femenina, la unión de la cabeza del espermatozoide a la zona pelúcida es regulada por receptores en la zona pelúcida (Hafez, 2000). Al penetrar el espermatozoide a la membrana vitelina, el ovulo activada completa la meiosis y expulsa el primer y/o el segundo corpúsculo polar en el espacio perivitelino, los cromosomas haploides maternos restantes son rodeados entonces por un pronúcleo después de la etapa pronúcleo (Hafez, 2000). a) Fertilización in vivo La fecundación es el proceso en el cual un nuevo individuo se forma por la unión de un gameto masculino y uno femenino. Se define como los cambios que ocurren luego de la interacción del ovocito con el espermatozoide lo que lleva a la unión de ambos pronúcleos (Croz et, 1993). La fecundación como evento fisiológico continuo está determinado en su inicio por la singamia; la fusión de ambos pronúcleos. Aunque previamente la fusión de la zona pelúcida con la membrana plasmática del espermatozoide haya ocurrido, el punto más claro de fecundación se evidencia en la singamia. Este evento, tanto in vivo como in vitro requiere de ovocitos previamente madurados y espermatozoides capacitados, in vivo en la especie bovina la fecundación ocurre casi inmediatamente posterior a la ovulación a medida que el ovocito avanza por el oviducto que contiene espermatozoides ya capacitados. Poco tiempo después de la penetración de la zona pelúcida y la fusión de los gametos la cabeza del espermatozoide se decondensa dentro del citoplasma del ovocito, se forma el envoltorio 25

26 nuclear y es posible observar el pronúcleo masculino. Simultáneamente en el ovocito la meiosis se reinicia con la extrusión del segundo cuerpo polar y la formación de un envoltorio nuclear alrededor de la cromatina femenina que está en proceso de decondensación. La formación de los pronúcleos masculino y femenino ocurren sincrónicamente y pueden ser fácilmente observados dentro de las primeras 2-4 horas postpenetración tanto in vivo como in vitro (Barnes, 1990). b) Fertilización in vitro. El primer ternero procedente de fecundación in vitro (FIV) nació en el año 1981 (Brackett et al., 1982). Años antes Chang (1959) consiguió el primer éxito de esta tecnología al obtener una camada de conejos tras la FIV y transferencia embrionaria posterior. Los fenómenos de FIV en el ganado bovino mayor éxito del procedimiento de FIV se demuestra al producir individuos vivos procedentes de FIV, utilizando tanto ovocitos madurados in vivo (Brackett et al., 1982) Aunque la eficacia de los procesos de FIV disminuye respecto a la fecundación natural de igual modo que cuando se utilizan ovocitos madurados in vivo frente a los madurados in vitro (Leibfried-Rutledge et al., 1986). En general según (First y Parris, 1987) todos los sistemas de FIV requieren los siguientes puntos: 1.- Utilización de un sistema que asegure la maduración del ovocito. 2.- Obtención de los espermatozoides. 3.- Métodos de capacitación in vitro del espermatozoide. 4.- Factores que influyen en la capacitación in vitro del espermatozoide. 5.- Establecer las condiciones de inseminación. 26

27 1. Obtención de los espermatozoides. El origen de los espermatozoides utilizados para la fecundación in vitro puede ser de dos tipos: obtenidos de la cola del epidídimo o eyaculados. Estos últimos a su vez pueden utilizarse directamente en fresco (diluidos o no) o se pueden emplear inmediatamente después de su descongelación (First y Parris, 1987). 2. Factores que influyen en la capacitación in vitro. Temperatura.- Habitualmente se utiliza una temperatura de C teniendo en cuenta que variaciones de tan solo C afectan seriamente a la capacitación (First y Parris, 1988). ph.- Para efectuar el lavado y la preincubación de los espermatozoides, el ph se mantiene a 7,4 (Parris et al., 1986; Fukui et al., 1990) o a 7,6 (Younis et al., 1989). Concentración espermática.- Durante el periodo de preincubación para inducir la capacitación, la concentración espermática se mantiene entre 25 y 50 millones de esperm/ml (Lu et al., 1987; Fukui et al., 1990). Tiempo de capacitación.- Los distintos autores indican un tiempo necesario distinto según la metodología empleada desde 4 horas hasta las 18 horas de incubación empleadas por (Parris et al., 1986) En cuanto a algunos de los componentes de los medios la mayor de ellos lleva una suplementación de B.S.A. que favorece la capacitación ya que elimina colesterol y ácidos grasos de la membrana plasmática los cuales impiden la capacitación y además de mantener la motilidad espermática (Parris et al., 1986). Parris et al. (1988) señalan que concentraciones de glucosa superiores a 5 mm en el medio, inhiben la capacitación espermática inducida por la heparina sódica. Según estos 27

28 mismos autores este hecho es similar a lo que ocurre in vivo, ya que las concentraciones de glucosa en el oviducto bovino son muy pequeñas (del orden de 100 a 200 gm). Por ello, la mayoría de autores no utilizan concentraciones superiores a 5 mm de glucosa en sus medios de capacitación. La heparina induce la capacitación del espermatozoide por varios mecanismos (First y Parris, 1987): Desplaza las proteínas de capacitantes de la membrana espermática. Estimula la apertura de los canales para el ión calcio, comportándose como un ionóforo. Activa la acción del AMP-c y de la fosfolipasa A 2 (que aumenta la concentración de fosfolípidos como la fosfatidilcolina en presencia de Ca 2 induce la reacción acrosómica). La heparina actúa en este caso inmovilizando el ión Zn, que se comporta como inhibidor de la fosfolipasa A 2. Favorece la conversión de proacrosina en acrosina. La capacitación por heparina se inhibe en presencia de concentraciones superiores a 5 mm de glucosa, aunque este efecto es reversible si los espermatozoides se incuban con dosis de 200 g/ml de heparina o se añade AMPc (First y Parris, 1988). La mayoría de los autores que emplean espermatozoides provenientes de eyaculado utilizan heparina ya que como indican First y Parris (1988) y la utilización de heparina sódica ha demostrado ser el mejor método para inducir la capacitación y reacción acrosómica in vitro en los espermatozoides bovinos (Gordon, 1990) 3. Etapas de la FIV La FIV comprende tres etapas: 1. Maduración del óvulo o gameto femenino. 28

29 2. Fecundación propiamente dicha. Fukui et al. (2009) evaluación folicular para la maduración y fertilización de in vitro de bovinos reporto una tasa de fertilización in vitro 35.2 %porque utilizo semen fresco diluido. Kurtz et al. (2002) evaluaron producción in vitro de embriones bovinos en tubo controlando la atmosfera con TCM-199 más mg/ml de piruvato de sodio más suero de vaca en celo en baño maría por 24 horas, reporto 50 % de fertilización porque cultivaron en tubos protegidos con papel aluminio contra la luz a 39 0 C por 9 días Del Campo (1994).) Estudios sobre Fertilización in vitro señalan una tasa de desarrollo del 29.2 y 57.1 % con dos diferentes dosis de heparina (2 y 5 ug/ml), luego de 9 días de cultivo. Salgado (2004) En el experimento, los ovocitos obtenidos de ovarios de matadero fueron madurados in vitro y distribuidos al azar en seis tratamientos para fertilización in vitro, de acuerdo a las concentraciones de heparina (2, 4, 8, 10, 16, 20 μg/ml). En el experimento dos, una vez seleccionada la concentración de heparina en experimento 1, se evaluaron tres dosis de espermatozoides en el medio de fertilización (0.5 x 10 6 espermatozoides/ml, 1 x 10 6 espermatozoides/ml y 2 x 10 6 espermatozoides/ml). La concentración de heparina tuvo efecto (p<0.05) en el porcentaje de ovocitos fertilizados encontrándose los mejores resultados en la concentración de 10 μg/ml, con una tasa de penetración del 67% fertilización in vitro. Baez, contreras, (2010) evaluación de la capacidad de desarrollo in vitro de ovocitos bovino, se utilizó semen de toro brahmán puro. En cuanto a la tasa de 29

30 fecundación se obtuvo un % ovocitos penetrados normales. Porque el medio de maduración ph aumento. Hernández (2010) En Venezuela determinaron de un total de 748 ovocitos fueron aspirados de folículos de diferentes diámetros de ovarios de vacas y novillas cebú postmortem. De los 748 ovocitos, 344 estaban rodeados de las células de los cúmulus y 404 ovocitos no presentaban células de los cúmulus (desnudos). Se maduraron en el medio TCM-199 suplementado con estradiol, suero fetal bovino y gonadotrofina coriónica humana equilibrado en una atmósfera con 5% de CO 2, 5% de 02 y 90% de N2. Un total de 360 ovocitos se maduraron en el medio suplementado con 0.8 μg/ml de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH) y 388 ovocitos se maduraron en su ausencia. Semen congelado procedente de cuatro toros de fertilidad comprobada fue capacitado con heparina (10 μl/ml). Una tasa d e fertilización del 70 % (522/748), la cual no estuvo influenciada (P > 0.05) por la presencia o ausencia de las células del cúmulos rodeando al ovocitos. 4. Medios de Incubación En los últimos años se desarrollaron técnicas de co-cultivo utilizando diferentes tipos de células somáticas que son capaces de promover la división de embriones desde etapas tempranas hasta mórula y blastocisto. El tipo de medio de cultivo no sólo puede afectar la maduración del ovocito en relación a la proporción de ellos que alcanzan la etapa de placa metafásica II y son fecundados sino que también puede influir en el posterior desarrollo embrionario. Los medios utilizados para IVF se pueden clasificar en simples y complejos. Los medios simples corresponden a sistemas tamponados con bicarbonato, con solución salina fisiológica adicionado con piruvato, lactato y glucosa. Y las principales diferencias entre ellos radican en la distinta concentración iónica y la concentración de las sustancias que actúan 30

31 como fuente energética. Además se han descrito algunos medios que simulan el fluido oviductal, conocidos como SOF (syntheticoviduct fluid) (Rorie, 1994) y msof (modifiedsyntheticoviduct fluid) (Takahashi y First, 1993).Uno de los más utilizados en el CE es conocido como CRl-aa (Bavister et al., 1992). En forma rutinaria se han usado medios complejos como el TCM-199 tanto como para mantener la viabilidad de las células somáticas, así como permitir la maduración de los ovocitos. Tales medios contienen sales inorgánicas, aminoácidos, vitaminas, substratos energéticos, y otros componentes (Gordon, 1994; Rorie y Lester, 1994). PREPARACIÓN DEL OVOCITO PARA LA FECUNDACIÓN A partir de la ovogénesis el núcleo del ovocito diploténico permanece en la etapa de reposo llamada de núcleo reticular o dictiado normalmente nunca se reinicia la meiosis antes de la oleada ovulatoria de gonadotropina el incremento de la concentración de gonadotropina durante el periodo preovulatorioestimula la reanudación de la meiosis. Se requiere unas 6-8 horas más para la maduración del citoplasma del ovocito al acercarse el momento de la ovulación cuando se aflojan las células del cúmulos, comienzan las fases finales de maduración, impulsadas por una fuerte descarga de LH de la pituitaria (Salisbury et al., 1978; Peters y Ball, 1991; Hafez, 1996).En primer lugar desaparece la membrana nuclear y los cromosomas se desplazan hacia la superficie del óvulo. La centrosfera se divide se separan los dos centriolos resultantes y se forma un huso entre ellos el huso se halla siempre junto a un lado del óvulo y esta superficie del óvulo junto con parte del citoplasma llega a sobresalir del huso. Esta parte del citoplasma que sobresale de la superficie del óvulo sobre el huso se desprende y se convierte en el primer corpúsculo polar. Una parte de las fibras del huso 31

32 persisten para una segunda fase de división adhiriendo el corpúsculo polar al vítelo. La división meiotica y da lugar al primer corpúsculo polar y al ovocito secundario cada uno de ellos provistos de un miembro de cada pareja de los cromosomas originales. En ocasiones el primer corpúsculo polar sufre otra división pero a menudo se desintegra (Salisbury et al., 1978) Interacción entre complejo cumulus-ovocito y espermatozoide Cox et al. (1993) señalan que en el bovino el tiempo desde que se inicia el co-cultivo de ovocitos y espermatozoides hasta que se produce la fecundación no cambia con la presencia o ausencia del cúmulus. Se ha descrito que el cúmulus puede tener un efecto negativo o al menos selectivo sobre la motilidad espermática. Se sugiere que éste actuaría como una trampa para los espermatozoides tanto in vivo como in vitro (Cox et al., 1993). Otros investigadores creen que el complejo cúmulus oophorus podría tener un efecto estimulatorio sobre la tasa de fecundación ya que proveería un mecanismo inductor de capacitación y a la vez facilitaría la interacción entre el espermatozoide capacitado y la superficie de la zona pelúcida por medio de una proteína que es capaz de inducir la reacción acrosómica en espermatozoides capacitados de varias especies de mamíferos (Cox et al., 1993; Kikuchi et al., 1993). Sugieren que aunque la presencia del cúmulus intacto alrededor del ovocito no es absolutamente necesaria para una exitosa fecundación in vitro sí mejoraría la tasa de fecundación (Chian et al., 1995). 32

33 2.7. Preparación de medios PBS La ventaja del tampón fosfato; los medios de comunicación para el trabajo a corto plazo con ovocitos y embriones es que no requieren un CO2en la fase gaseosa controlada para mantener una relativamente ph constante (Gordon, 2003). Diversos autores han establecido que el ph óptimo en el medio de maduración debe mantenerse entre 7.2 y 7.4 (Sato et al., 1977; Fukui y Sakuma, 1980; Brackett, 1986). El control del ph en el medio de maduración se realiza gracias a la concentración de CO 2 en la atmósfera del incubador, bicarbonato de sodio en el medio u otro tipo de sustancias tampón adicionadas al medio de cultivo como las sales de Hepes (Lu et al., 1987) TCM-199 El TCM-199 es un medio de maduración que es utilizado para cultivos celulares donde tiene mayor cantidad de sustancias nutritivas, presentando una composición de una mezcla de sales inorgánicas, vitaminas, aminoácidos, piruvato de sodio, hipoxantina, timidina, rojo fenol como indicador la coloración para el medio de maduración (Leibfried Rutledge, 1989). Los medios son preparados según recetas estandarizadas que han sido comprobadas como extraordinariamente adecuadas por profesionales independientes en una gran cantidad de artículos y publicaciones(rorie y Lester, 1994). Las soluciones madres pueden conservarse hasta por 6 meses a +4ºC - 8ºC; las soluciones de trabajo sólo por algunos días (Rorie y Lester, 1994). 33

34 Las soluciones de trabajo pueden ser preparadas individualmente según necesidad. La calidad alta y constante de nuestros medios ofrece un estándar óptimo para la producción in vitro de embriones en su laboratorio(rorie y Lester, 1994).. Todas las partidas son certificadas para la producción in-vitro en base a pruebas de toxicidad sobre maduración, fertilización y transferencia de embriones (Rorie y Lester, 1994) Agua de coco El fruto del cocotero (Cocus nucifera), es explotado comercialmente para aprovechar la cáscara (exocarpio y mesocarpio) y la nuez (endocarpio) con la finalidad de obtener una serie de productos de interés comercial como el aceite, la pulpa deshidratada, etc. El agua contenida en la nuez, const ituye actualmente un subproducto que no es utilizado por las industrias y es eliminado de los procesos, sin ningún tipo de tratamiento que permita reducir los problemas de contaminación ambiental, muestran que el fruto está constituido por un 35 % de cásca ra, 60 % de pulpa y un 8 % de agua. El agua de coco contiene sustancias como azúcares, proteínas, minerales y vitaminas, que la convierten en un sustrato potencialmente bueno para la producción de biomasa o para otros fines. Algunos elementos trazas, encont rados en el agua de coco son: potasio, 312 mg/ml; fósforo 37 mg/ml; sodio 105 mg/ml y calcio 29 mg/ml. El agua de coco viene a ser una solución estéril, ligeramente acida natural conteniendo proteínas, sales, azucares, vitaminas, factores de crecimiento (fitohormonas) y extractos de fosfolípidos (Laguna, 1996). Además en su composición electrolítica se aproxima más al fluido intracelular que al plasma extracelular, estos cationes predominantes son el potasio, calcio, magnesio, sodio, cloro, y fosfatos, pero en concentraciones más bajas (Gopikrishna et al., 2008). 34