BANCO NACIONAL DE LÍNEAS CELULARES (TRONCALES)

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1 BANCO NACIONAL DE LÍNEAS CELULARES (TRONCALES) National Bank of Stem Cell Lines IMPRESO DE SOLICITUD DE DEPÓSITO DE UNA LÍNEA Application Form to Deposit a Human Cell Line Documentos que se acompañan: Attached documents: Copia de la autorización de derivación de la línea celular, junto con informe del Comité Ético del centro de procedencia. A copy of the authorization for the derivation of the cell line, with the corresponding ethics committee approval Copia de cualquier publicación científica relacionada con la derivación y/o caracterización de la línea. A copy of any relevant published scientific papers related to the derivation and/or characterization of the cell line C. V. del investigador principal (una página; formato libre). A one page CV for the Principal Investigator Otros (especificar). Others (specify) Anexo 1: Informe independiente del análisis de microsatélites y del tipado HLA Anexo 2: Informe independiente del análisis microbiológico Anexo 3: Fenotipo. Marcadores indiferenciación Anexo 4: Informe independiente de la caracterización cariotípica Anexo 5: Diferenciación in vitro Anexo 6: Diferenciación in vivo. SECCIÓN 1 Section 1 Información General General Information Nombre de la línea: ES[5] Name of the line: Investigador principal: JUAN CARLOS IZPISÚA BELMONTE/ANNA VEIGA LLUCH Principal Investigator: Origen de la línea celular: Origin of the cell line Embrionario Fetal Adulto Embryonic Fetal Adult La línea celular ha sido derivada de un embrión con anomalía genética? Has the cell line been derived from an embryo with genetic anomaly? NO SÍ (especificar) No Yes (specify) Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 1 de 7 Los apartados que requieran entrada de texto, deben rellenarse tanto en Castellano como en Inglés Text items should be filled in both Spanish and English

2 Identificación genética de la línea celular. Método y resultado Genetic identity of the cell line. Method and result Análisis de microsatélites (ver Anexo 1) Microsatellite characterization (see Annex 1) Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 2 de 7 Los apartados que requieran entrada de texto, deben rellenarse tanto en Castellano como en Inglés Text items should be filled in both Spanish and English

3 SECCIÓN 2 Section 2 Investigador Principal: Principal Investigator: JUAN CARLOS IZPISÚA BELMONTE ANNA VEIGA LLUCH Centro de Trabajo: Institution: CENTRO DE MEDICINA REGENERATIVA DE BARCELONA. Center of Regenerative Medicine in Barcelona Dirección Postal: Postal address: Dr. Aiguader Barcelona Teléfono (phone): Fax: blc@cmrb.eu Datos del Depositante Applicant Details SECCIÓN 3 Section 3 Datos de la Línea Celular Details of Cell Line Tipo de muestra biológica (especificar estadio embrionario, semanas de gestación, ) Kind of biological sample (specify embryonic stage, weeks of pregnancy,...) Embrión humano en estadio de blastocisto Blastocyst-stage human embryo Muestra biológica Biological sample Fresco Fresh Crioconservado Cryopreserved Fecha de la obtención del muestra biológica Date of obtaining the biological sample Fecha del uso o descongelación (si congelado) Date used or thawed (if frozen) Fecha de la donación del muestra biológica Date of donation of the biological sample Descripción general del procesamiento previo del muestra biológica utilizado (cultivo embrionario, procesamiento muestra fetal o de tejido adulto) General description of the processing of the biological sample used (embryonic culture, processing of fetal sample or of adult tissue) El embrión criopreservado donado fue descongelado mediante un protocolo lento con PROH y sacarosa. El embrión había sido congelado en el 2º día de desarrollo. Tras 4 días de cultivo, se eliminó la zona pelúcida (ZP) del embrión mediante pronasa. Se sembró y co-cultivó el blastocisto desprovisto de ZP sobre una monocapa de fibroblastos irradiados y medio de cultivo hes. The donated frozen embryo was thawed using a slow protocol with PROH and sucrose. The embryo had been frozen at day 2 of development. After 4 days in culture, the embryo achieved the blastocyst stage. The zona pel lucida (ZP) was removed using pronase. The blastocyst was seeded and cultured in hes medium on top of a irradiated feeder-layer. Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 3 de 7 Los apartados que requieran entrada de texto, deben rellenarse tanto en Castellano como en Inglés Text items should be filled in both Spanish and English

4 En caso de muestra embrionaria, indicar si se utilizaron blastómeros o células de la masa celular interna y el método de aislamiento utilizado If of embryonic origin, indicate whether blastomeres or internal cell mass were used, as well as the isolation method Se sembró el blastocisto entero desprovisto de la zona pelúcida, sin aislamiento de la masa celular interna. The whole blastocyst was seeded without zona pel lucida, without prior isolation of the inner cell mass. Origen del soporte celular o acelular utilizado para la derivación, así como de los componentes de los medios de cultivo (si se describen en publicación, indicar además referencia) Origin of the cellular or cellular free support used in derivation in addition to the components of the culture mediums (if they are described in a publication, please indicate the reference). Support: human foreskin fibroblasts (ATCC, American Type Culture Collection, CCD1112Sk). Culture medium: Knockout Dulbecco s modified Eagle s medium supplemented with 2 mmol/l GlutaMAX (Gibco, InVitrogen corporation), 0,05mmol/l 2-mercaptoethanol (Gibco, InVitrogen corporation), 8 ng/ml basic fibroblast growth factor (bfgf) (Invitrogen), 1% non-essential amino acids (Cambrex), 20% Knockout Serum Replacement (InVitrogen) y 0,5% Penicillin-Streptomycin (Gibco, InVitrogen corporation). Mantenimiento de la línea: Line maintenance Ratio de pase: Passage ratio: 1:2-1:3 cada 6/7 días; 1:2-1:3 every 6/7 days Método de pase: Passage method mecánico; mechanical Xenobióticos si X no Xenobiotics Yes No Descripción de las características morfológicas de la línea en cultivo (forma y tamaño colonias; forma y tamaño células; ratio núcleo/citoplasma; otros) Description of the morphological characteristics of the line in culture (form and size of the colonies; form and size of the cells; nucleus/cytoplasm ratio; others) Colonias grandes poligonales, ligeramente aplanadas, de un tamaño entre 1-3 mm de diámetro de diversas formas con bordes lisos. Células de tamaño uniforme y una elevada relación núcleo/citoplasma. Large and flat polygonal colonies, with uniformly sized cells of 1-3 mm of diameter. They have several forms and smooth edges. High nucleus/cytoplasm ratio. Controles microbiológicos realizados (indicar detalladamente) Microbiological controls carried out (indicate in detail) Análisis de esterilidad, hongos y micoplasma. (ver Anexo 2) Sterility analysis, fungi and mycoplasm. (see Annex 2) Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 4 de 7 Los apartados que requieran entrada de texto, deben rellenarse tanto en Castellano como en Inglés Text items should be filled in both Spanish and English

5 Marcadores: Markers Método nº pase resultado comentarios (ARN/proteínas) Method Passage n. results comments (RNA/proteins) Oct 4 inmunofluorescencia 16 + (ver Anexo 3) Nanog inmunofluorescencia 16 + Rex 1 Sox 2 inmunofluorescencia 16 + SSEA3 inmunofluorescencia 16 + SSEA4 inmunofluorescencia 16 + TRA-1-60 inmunofluorescencia 16 + TRA-1-81 inmunofluorescencia 16 + Telomerasa actividad 22 + Fosfatasa Alk. actividad 22 + Cariotipo 19 46, XY (ver Anexo 4) Otros Capacidad de diferenciación (ver Anexo 5) Differentiation capacity Ectodermo/ Ectoderm Endodermo/Endoderm Mesodermo/ Mesoderm marcador pase resultado marcador pase resultado marcador pase resultado marker passage result marker passage result marker passage result In Vitro β-tubulina 20 + α-fetoproteina 20 + α-actinina 20 + In vitro β-tubulin 20 + α-fetoprotein 20 + α-actinin 20 + In vivo/ in vivo (ver Anexo 6) Método: formación de teratomas en ratones SCID Resultado: + Method: teratoma formation in SCID mice. Result: + Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 5 de 7 Los apartados que requieran entrada de texto, deben rellenarse tanto en Castellano como en Inglés Text items should be filled in both Spanish and English

6 Descripción de las características de diferenciación in vitro Description of the differentiation characteristics in vitro Mesodermo: cultivo de cuerpos embrioides (EBs) en medio de cultivo suplementado con ácido ascórbico. Endodermo: cultivo de cuerpos embrioides en medio de cultivo. Ectodermo: cultivo de cuerpos embrioides en medio N2/B27 suplementado con ácido retinoico. Mesoderm: Embryoids bodies (EBs) cultured in culture medium supplemented with ascorbic acid. Endoderm: EBs culture in culture medium. Ectoderm: EBs culture in N2/B27 supplemented with retinoic acid. Datos de la determinación de pluripotencialidad in vivo o formación de teratomas Data of the pluripotentiality determination in vivo or teratoma formation Se realizaron tinciones histológicas estándar con hematoxilina/eosina y a continuación fueron identificados tejidos procedentes de las tres capas germinales por un histopatólogo. También se realizaron pruebas de inmunohistoquímica para evidenciar la presencia de los mismos marcadores que en la diferenciación in vitro. Standard histological staining was done with hemotoxilin/eosin and tissues derived from all three germ layer were identified by a hystopathologist. Immunohystochemistry staining also was performed to show the presence of the same markers than in vitro differentiation. Datos de la tipificación HLA HLA typification data Ver Anexo 1 See Annex 1 Consistencia celular tras 6 pases de congelación y descongelación. Resultados Cell consistency after 6 passages of freezing and thawing. Results. Se observa consistencia cellular tras 6 pases de congelación y descongelación con crecimiento adecuado y características de indiferenciación. Cellular consistency after 6 procedures of freezing and thawing, with adequate growth and undifferentiation characteristics. Pase en el momento del registro Passage at the time of the recording P 32 Ha sido la línea modificada genéticamente? Has the line been genetically modified? Se llevó a cabo un análisis clonal? Has a clonal analysis been carried out? Sí Yes Comentarios/ Comments: No No Sí/ Yes No Resultado / Result Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 6 de 7 Los apartados que requieran entrada de texto, deben rellenarse tanto en Castellano como en Inglés Text items should be filled in both Spanish and English

7 Otras observaciones o información relevantes (a juicio del Investigador Principal): Other observations or relevant information (to the discretion of the Principal Investigator): La línea ES[5] y la línea ES[6] proceden de dos embriones de la misma cohorte. The ES[5] and ES[6] lines come from two embryos from the same cohort. Otras observaciones o información relevantes (a rellenar por el BNLC): Other comments or relevant information (to be completed by BNLC) Seguimiento de la línea (a rellenar por el BNLC): Follow up of the line (to be completed by BNLC) Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 7 de 7 Los apartados que requieran entrada de texto, deben rellenarse tanto en Castellano como en Inglés Text items should be filled in both Spanish and English

8 SECCIÓN 4 Declaración Confirmo que la información contenida en estos impresos es cierta y asumo total responsabilidad sobre la misma. I confirm that the information contained in this form is true and I assume total responsibility for it. Firma en Representación del Centro / Signature in Representation of the Centre (Representante legal del Departamento/Centro) (Legal Reprentative of the Department/Centre) Firma del Investigador Principal Signature of the Principal Investigator Fecha/ Date: 26/03/2008 Fecha /Date 26/03/2008 Nombre y Cargo de la Persona Representante del Centro: Name and Position of the Person Representing the Centre: Miguel Gómez Clares. Commissioner Comisionado Dirección Postal: Postal Address: DR. AIGUADER BARCELONA Teléfono /Telephone: Fax: com@cmrb.eu Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 8 de 7 Los apartados que requieran entrada de texto, deben rellenarse tanto en Castellano como en Inglés Text items should be filled in both Spanish and English

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19 Anna Veiga PhD. Nacida en Barcelona en Licenciada en Biología. Universidad Autónoma de Barcelona ( ). Dra. en Biología (Cum Laude). Universidad Autónoma de Barcelona Ha dirigido la Sección de Biología del Servicio de Medicina de la Reproducción del Instituto Universitario Dexeus desde 1982 al Su actividad asistencial se ha orientado a las Técnicas de Reproducción Asistida y al tratamiento de la esterilidad. Fundadora y Coordinadora del Master en Biología de la Reproducción y Técnicas de Reproducción Asistida del Servei de Medicina de la Reproducción del Institut Universitari Dexeus junto con el Departamento de Biología Celular y Fisiología de la Universitat Autònoma de Barcelona (desde 1998). Fundadora y Presidente de la Asociación Española para el estudio de la Biología de la Reproducción (ASEBIR) ( ) Miembro de la Comisión Ejecutiva de ALPHA Scientists in Reproductive Medicine ( ). Directora de la Comisión en Biomedicina. Comissió de Bioètica en Recerca Biomèdica, del Departament de Salut, Generalitat de Catalunya (desde 2004). Miembro del Comité Consultivo de Bioètica de Catalunya. Miembro del Consejo Asesor en la Conselleria del Departamento de Salut de la Generalitat de Catalunya. Asesora de la Comisión Europea (Health Directoriate) en temas de Reproducción Asistida (2004- ) Miembro de la Comisión Permanente de la European Assisted Conception Consortium (EACC) ( ) Miembro Comité Ejecutivo de la European Society for Human Reproduction and Embryology (ESHRE) ( ). Coordinadora del Grupo de Interés en Células Madre. Coordinadora científico del Proyecto Europeo Registro Europeo de Células Madre (EU hescreg) (desde 2005 ) Activamente implicada en Técnicas de Reproducción Asistida (ART) desde los inicios de la Fecundación in Vitro. Ha publicado numerosos artículos en Revistas Nacionales e Internacionales y escrito capítulos en libros relacionados con sus áreas de interés. Ha participado en congresos y reuniones nacionales e internacionales así como en la difusión de la Reproducción Asistida en España. Participa en programas de investigación y docencia. Ha recibido la Creu Sant Jordi Generalitat de Catalunya (2004), la Medalla Narcís Monturiol al mérito Científico y Tecnológico. Departament d'universitats Recerca i Societat de la Informació (DURSI) (2005) y el Premi Nacional de Cultura Científica. Generalitat de Catalunya (2006). Posición Actual Directora Científica del Servei de Medicina de la Reproducción del Departamento de Obstetricia y Ginecología de l Institut Universitari Dexeus. Dra. Anna Veiga 1

20 Experta en fertilidad y reproducción asistida, genética de la reproducción, desarrollo del embrión y el estudio de sus anomalías a través del diagnostico preimplantacional. Amplia experiencia en el cultivo prolongado de embriones humanos hasta la etapa del blastocisto, así como en la biopsia láser del embrión y el cultivo y la transferencia de embriones biopsiados. Directora del Banco de Líneas Celulares de Barcelona. Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona CMR[B]. Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona. Desarrollo de investigación en el campo de la derivación de líneas celulares provenientes de embriones normales y anormales, sobrantes de los programas de fecundación in vitro. Las metodologías usadas pretenden evitar el uso de productos del origen animal para permitir un futuro uso clínico de las células derivadas para aplicación humana. Profesora asociada de la Facultad de Ciencias Experimentals i de la Vida de la Universitat Pompeu Fabra Dra. Anna Veiga 2

21 ANEXOS A LA SOLICITUD DE DEPÓSITO DE LA LÍNEA CELULAR ES[5] EN EL BANCO NACIONAL DE LÍNEAS CELULARES.

22 ANEXOS Anexo 1: Informe independiente del análisis de microsatélites y del tipado HLA ES[5] Anexo 2: Informe independiente del análisis microbiológico ES[5] Anexo 3: Fenotipo. Marcadores indiferenciación ES[5] Anexo 4: Cariotipo ES[5] Anexo 5: Diferenciación in vitro ES[5] Anexo 6: Diferenciación in vivo ES[5]

23 Anexo 1 HLA y microsatélites Línea de células madre embrionarias ES[5]

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28 Anexo 2 Informe independiente del análisis microbiológico ES[5]

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30 Anexo 3 Fenotipo. Marcadores de indiferenciación ES[5]

31 Actividad fosfatasa alcalina de la línea de células madre embrionarias ES[5].

32 DIC Sox-2 SSEA4 DAPI Inmuno-reactividad de la línea de células madre embrionarias ES[5] para Sox-2 y SSEA4

33 DAPI TRA1-60 Nanog DAPI Inmuno-reactividad de la línea de células madre embrionarias ES[5] para TRA1-60 y Nanog

34 DIC OCT-4 SSEA-3 DAPI Inmuno-reactividad de la línea de células madre embrionarias ES[5] para OCT-4 y SSEA-3

35 DIC Nanog TRA1-81 DAPI Inmuno-reactividad de la línea de células madre embrionarias ES[5] para Nanog y TRA1-81.

36 Anexo 4 Cariotipo Línea de células madre embrionarias ES[5]

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39 Anexo 5 Diferenciación in vitro ES[5]

40 Diferenciación in vitro a mesodermo: Células positivas para α -actinina Diferenciación in vitro a endodermo: Células positivas para α -fetoproteina Diferenciación in vitro a ectodermo: Células positivas para β -tubulina

41 Anexo 6 Diferenciación in vivo ES[5]

42 Diferenciación in vivo: Cartílago Diferenciación in vivo: tejido epitelial Diferenciación in vivo: tejido muscular liso