Práctica de espectrofotometría UV-Visible (Cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer y análisis de mezclas)

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1 Práctica de espectrofotometría UV-Visible (Cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer y análisis de mezclas) FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA Como es sabido, las técnicas espectroscópicas se basan en la interacción de la radiación electromagnética con la materia. A través de esta interacción las moléculas pueden pasar de un estado energético, m, a otro estado energético distinto, l, absorbiendo una cantidad de energía radiante igual a la diferencia energética existente entre los dos niveles: E l E m. Para conseguir esto, las moléculas absorben un fotón de una radiación tal que: E E l E m E = hν = hc κ h = Constante de Planck= J.s ν = Frecuencia de la radiación= c = velocidad de la luz= cm.s -1 λ = longitud de onda Estos tránsitos energéticos son los que dan origen a los espectros que, en definitiva, no son mas que el registro de las distintas µ(o κ) a las que se producen estos tránsitos energéticos. Debido a la existencia de diferentes tipos de energía: de los electrones en si, de los movimientos vibracionales de las moléculas, de la rotación de las mismas...etc, las moléculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnéticas de un rango muy amplio de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopías según las diferentes regiones. Un esquema podría ser el siguiente: c κ λ / nm Rayos γ Rayos x UV VIS INFRARROJO MICROONDAS ONDAS RADIO Transitos electrones internos electrones Vibraciones Rotaciones RMN nucleares externos violeta añil azul verde amarillo naranja rojo La espectroscopía UV-Visible (espectros electrónicos), se debe a la transición de los electrones mas externos de los átomos de las moléculas, desde niveles fundamentales a niveles mas altos de energía.

2 Espectrofotometría página 2 LEY DE LAMBERT-BEER Si se hace incidir radiación monocromática sobre una muestra con una concentración C de una sustancia que absorbe a esa longitud de onda λ, la intensidad de la radiación que la atraviesa, I, está relacionada con la intensidad incidente I 0 y con el espesor de la muestra,l, por la expresión : I = I 0 10 ε l c aplicando logaritmos: reordenando términos: logi = log I 0 ε l c logi 0 log I = ε l c log I 0 I = ε l c pudiéndose escribir : I Habitualmente, el cociente I 0 se denomina transmitancia de la muestra y se suele expresar como porcentaje de luz transmitida: I I Por otra parte, se define la absorbancia de la muestra como: A = log(1/t). Tanto la absorbancia como la transmitancia son magnitudes que se obtienen directamente en el espectrofotómetro. Segun estas definiciones, queda finalmente la siguiente expresión que se conoce con el nombre de la ley de Lambert-Beer: A = ε l c donde e es la absortividad molar (una medida de la radiación absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda λ y en unas condiciones experimentales determinadas; también se denomina coeficiente de extinción molar si, como es frecuente, la concentración se expresa en moles por litro. Si se opera, por tanto, a una longitud de onda dada y con una cubeta de un determinado espesor, l, la absorbancia A, medible directamente, es proporcional a la concentración molar de la muestra, c, lo que constituye el fundamento del análisis espectrofotométrico cuantitativo. Existen, sin embargo, distintos factores que afectan al cumplimiento de la ley de Lambert-Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes de proceder al análisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente el rango de concentraciones en que dicha ley se cumple, obteniendo la curva de calibrado que relaciona las absorbancias con las concentraciones.

3 Espectrofotometría página 3 La ley de Lambert-Beer puede también aplicarse al análisis cuantitativo de mezclas de dos o más sustancias, siempre que sus respectivos espectros de absorción sean lo suficientemente distintos. El procedimiento se basa en que la absorbancia es una propiedad aditiva, de tal forma que la absorbancia total de una mezcla es la suma de cada uno de los componentes. Así, para una mezcla de dos componentes, 1 y 2, que absorben radiación de una misma longitud de onda, se cumplirá que: A = A 1 + A 2 = ε 1 l c 1 + ε 2 l c 2 Supongamos, entonces, que nuestro problema es el análisis de una mezcla de dos sustancias. En primer lugar se habrá de registrar el espectro de absorción de cada una de ellas por separado, con lo que nos podremos encontrarnos en una de las dos situaciones siguientes: a) Ambos espectros no presentan solapamiento en el margen de longitudes de onda de trabajo. El problema se reduce, entonces, a sendos análisis por separado, cada uno en la zona del espectro en donde cada componente de la mezcla se presenta como único absorbente. b) Ambos espectros presentan solapamiento en una zona determinada de longitudes de onda. En este caso se han de seleccionar dos longitudes de onda diferentes, λ 1 y λ 2, y obtener, con disoluciones de las sustancias puras, las respectivas κ 1, ε 1 κ 2, ε 2 κ 1, ε 2 κ 2. Con estos datos absortividades molares a cada longitud de onda: ε 1 se pueden determinar las concentraciones de los dos componentes de la mezcla a partir de las medidas de la absorbancia de la misma a las longitudes de onda de trabajo seleccionadas, A κ 1 y A κ 2. El cálculo se realiza resolviendo el siguiente sistema de 2 ecuaciones con 2 incógnitas: A κ 1 = ε 1 κ 1 l c 1 + ε 2 κ 1 l c 2 A κ 2 = ε 1 κ 2 l c 1 + ε 2 κ 2 l c 2 CARACTERÍSTICAS DE UN ESPECTROFOTÓMETRO UV-VISIBLE

4 Espectrofotometría página 4 Lámpara P a n t a l l a Fototubo Rendija de salida Lente Rendija de entrada Objetivo (mono ) (multi ) Prisma Filtro Cubeta La medida de la absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotómetro, que en esencia consta de un monocromador (prisma o red de difracción) que controla la longitud de onda de la radiación que se hace incidir sobre la muestra. La radiación no absorbida se detecta y mide convenientemente. La absorbancia de la muestra se compara con la de una referencia que consta estrictamente de disolvente. Las instrucciones generales de manejo de un espectrofotómetro serían: 1.- Encendido de lámparas : 1.1. Lámpara de tungsteno (zona del Visible, 900 a 340 nm), encendido instantáneo Lámpara de Deuterio (zona del UV, 340 a 200 nm aprox.), necesita un calentamiento previo. 2.- Adaptación del espejo a la lámpara adecuada, atendiendo al rango de longitud de onda de trabajo (sólo en los espectrofotómetros no automáticos). 3.- Seleccionar el valor de longitud de onda con el mando correspondiente. 4.- Ajuste del cero de transmitancias (tapa levantada) con ayuda del mando Ajuste del cero, hasta que aparezca CERO en la pantalla. 5.- Ajuste del 100% de transmitancia (0 de absorbancia) con la referencia, que normalmente es el disolvente de la muestra, utilizando para ello el mando A-T. 6.- Leer el valor de Absorbancia/Transmitancia de la muestra. Las cubetas empleadas en el espectrofotómetro (1.00 cm de espesor) deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras esmeriladas u opacas. No es conveniente secarlas o limpiarlas con papel ordinario por el carácter abrasivo de éste sino con un papel suave. APLICACIONES DE LA TÉCNICA Una de las aplicaciones prácticas de mayor interés de la espectrofotometría de absorción UV-Visible es la del análisis cuantitativo, basada en la aplicación de la ecuación de Lambert-Beer OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

5 Espectrofotometría página 5 Se trata de analizar la composición de una disolución que contiene una mezcla del indicador Azul de Bromotimol en su forma molecular HA (ácida) y disociada A - (básica), las cuales presentan absorción en la región VISIBLE del espectro. Las propiedades espectrofotométricas del Azul de Bromotimol en ambas formas son diferentes, lo que permite su cuantificación en disoluciones en las que aparecen mezcladas. Para ello habrá que registrar los espectros de absorción de las dos formas (ácida y básica) y obtener las correspondientes rectas de calibrado a dos longitudes de onda seleccionadas. MATERIALES Y REACTIVOS Espectrofotómetro UV-Visible y 6 cubetas de plástico. Matraces aforados de 10 ml Vasos de precipitados de 100 ml Pipetas graduadas de 10 ml y de 5 ml. 4 Frascos de almacenamiento. Disolución de Azul de Bromotimol en medio ácido (HA) de concentración M Disolución de Azul de Bromotimol en medio básico (A - ) de concentración M Disolución diluyente ácida: HCl 10-2 M. Disolución diluyente básica: NaOH 10-2 M. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL a) Preparación de disoluciones de la forma ácida del Azul de Bromotimol: Tomando como base una disolución de partida, facilitada por el profesor, de Azul de Bromotimol M en medio ácido (HCl), prepárense por dilución las siguientes disoluciones: { Disolución A: En un matraz de 10 ml pipetear 8 ml de disolución de partida y enrasar con diluyente ácido (HCl). { Disolución B: En un matraz de 10 ml pipetear 6 ml de disolución de partida y enrasar con diluyente ácido. { Disolución C: En un matraz de 10 ml pipetear 4 ml de disolución de partida y enrasar con diluyente ácido. { Disolución D: En un matraz de 10 ml pipetear 2 ml de disolución de partida y enrasar con diluyente ácido. Nota: El pka del azul de bromotimol es 7.30, al encontrarse en medio ácido no hay duda de que el indicador se encuentra totalmente bajo su forma ácida: HA λ A + H + (pka=7.30) b) Preparación de disoluciones de la forma básica del Azul de Bromotimol: Tomando ahora como base una disolución de partida, facilitada por el profesor, de Azul de Bromotimol M en medio básico (NaOH 10-2 M), prepárense por dilución las mismas disoluciones que en el apartado anterior pero ahora enrasando con diluyente básico (NaOH).

6 Espectrofotometría página 6 Nota: Como el pka del indicador es 7.30 no hay duda de que éste se encuentra totalmente bajo su forma básica en NaOH 10-2 M. c) Obtención de los espectros de la forma ácida y básica del indicador: Para ello vamos a utilizar las disoluciones A respectivas preparadas anteriormente. En cada caso, llenaremos una cubeta con la referencia adecuada y otra con la muestra a medir. A continuación, iremos midiendo el valor de la absorbancia de la muestra a distintas longitudes de onda entre 400 y 680 nm, haciendo las medidas a intervalos de 10 nm. Es importante tener en cuenta que, cada vez que se modifique el valor de la longitud de onda, hay que ajustar de nuevo el cero de absorbancia con la referencia. Finalmente, se representan los datos en papel milimetrado, de manera que figure la absorbancia A en ordenadas frente a longitud de onda λ en abcisas: A Forma básica Forma ácida Longitud de onda / nm d) Obtención de las rectas de calibrado para las formas ácida y básica del Azul de Bromotimol: A la vista de los espectros de absorción de la forma ácida y básica del indicador, se apreciará un máximo para la forma básica en torno a 620 nm y un máximo para la forma ácida alrededor de 440 nm. Elegidos estos valores de longitud de onda como los mas idóneos, se mide la absorbancia de cada una de las disoluciones preparadas en el apartado a) (disoluciones de la A a la D), ajustando previamente el cero de absorbancia a cada longitud de onda con la referencia adecuada. Con los datos de Absorbancia se elaboran las dos tablas correspondientes, una para la forma ácida y otra para la forma básica, que serán del tipo: Disolución A B C D C / mol L -1 Absorbancia a 440 Absorbancia a 620

7 Espectrofotometría página 7 A continuación se representan en papel milimetrado los datos de las dos tablas anteriores (absorbancia frente a concentración) y se obtienen las 4 rectas de calibrado que confirman el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer: A c /10-5 M Las rectas que se obtienen son del tipo y = ax, de forma que al compararlas con la ley de Lambert-Beer se deduce que: pendiente = y x = y 2 y 1 x 2 x 1 = ε l de donde: ε = pendiente l Como la longitud de la cubeta es de 1.00 cm se obtiene el valor de e en M -1 cm -1. Por tanto habremos determinado las cuatro absortividades molares que estabamos buscando: ε 440 HA, ε 620 HA, ε A, ε A e) Análisis de una muestra desconocida de azul de bromotimol A partir de una muestra facilitada por el profesor se trata de determinar las concentraciones de HA y A - que hay en la muestra. Para ello se medirá la absorbancia de la muestra a 440 y 620 nm y a partir de las ecuaciones correspondientes se obtendrán las concentraciones de HA y A -. f) Comprobación del pka del azul de bromotimol Con los datos obtenidos en el apartado anterior y recordando la ecuación de Henderson-Hasselbalch se puede calcular el valor del pka del indicador: ph = pka + log [A ] [HA] υ pka = ph log [A ] [HA] por tanto sabiendo las concentraciones de HA y A - y midiendo el ph de la muestra se puede calcular el pka.

8 Espectrofotometría página 8 Bibliografía Si la suposición de que la absorbancia era aditiva es correcta, el pka así obtenido ha de cerrar con el pka determinado potenciométricamente para este indicador. Sabiendo que el valor tabulado es de 7.30, podría discutir la validez de nuestras suposiciones y calcular los errores relativos cometidos por el experimentador. CONNOR, K.A., "Curso de análisis farmacéutico", Ed. Reverté MIÑONES, J., "Manual de técnicas instrumentales", Círculo editor Universo

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