Docente: Carla De Angelis Curso: T.I.A. 5º

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1 ESPECTROFOTOMETRÍA Desde hace muchos años se ha usado el color como ayuda para reconocer las sustancias químicas; al reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiación se puede estudiar la absorción de sustancias, no solamente en la zona del espectro visible, sino también en ultravioleta e infrarrojo. Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación. La teoría ondulatoria de la luz propone la idea de que un haz de luz es un flujo de cuantos de energía llamados fotones; la luz de una cierta longitud de onda está asociada con los fotones, cada uno de los cuales posee una cantidad definida de energía. La espectrofotometría es una técnica analítica rápida, sencilla y relativamente de bajo costo, ya que se requiere muy poca cantidad de sustancia a analizar. Para comprender que ocurre en el seno de una solución cuando un haz de luz la atraviesa, consideremos una cubeta de material transparente y no absorbente que contiene la solución con el analito cuya concentración se desea conocer. Si se ilumina la solución con una con luz monocromática (luz de una sola longitud de onda), ocurrirá que parte de la intensidad de esa luz (Io), será absorbida por las moléculas que están en dicha solución (Ia), parte se reflejará (Ir) y parte será transmitida (It). Podemos representarlo esquemáticamente como: Para que se cumpla el principio de conservación de la energía, la intensidad luminosa incidente (Io) debe repartirse exactamente entre la radiación reflejada, la absorbida y la transmitida, o sea: Io = Ir + Ia + It Si consideramos la luz reflejada despreciable debido a que la incidencia del haz de luz es normal a la superficie del tubo que contiene la solución, nos queda Io = It + Ia Dividiendo esta expresión por Io, obtiene la expresión: 1 = T + S Donde se llama absorción, S a la relación Ia / Io y transmitancia, T a la relación It / Io Esta es la expresión matemática de la ley de Grotthus - Draper. Cómo resultará la intensidad transmitida respecto de la incidente si aumenta o disminuye la intensidad de la fuente? Y si aumenta o disminuye el espesor del material interpuesto? A través de un tratamiento matemático se deduce que la variación de la intensidad es directamente proporcional al espesor o ancho de la cubeta y a una constante k propia de cada analito, llamada coeficiente de absorción. Como resultado se obtiene la siguiente relación: Esta fórmula es la expresión matemática de la ley de Lambert, que dice que la intensidad de la luz monocromática transmitida decrece en forma geométrica cuando el espesor del medio absorbente (de la cubeta) crece en forma aritmética. Qué ocurre si se mantienen la intensidad incidente y el espesor constantes, y se aumenta o disminuye la concentración de la solución atravesada por la luz? 1

2 Un desarrollo matemático análogo lleva a la siguiente expresión matemática La intensidad de luz monocromática transmitida por la solución de una sustancia determinada decrece en forma geométrica cuando su concentración aumenta en forma aritmética. No existe relación lineal entre la transmitancia (T) y concentración (c); T decae en forma exponencial con la concentración. Variando a la vez el espesor bajo el cual se observa y la concentración de la solución, el valor de It estará dado por: Esta expresión se conoce con el nombre de Ley de Lambert - Beer, donde a es una constante denominada absortividad. Reordenando la fórmula y aplicando logaritmo se puede comprender mejor el significado de la absortividad. El valor del logaritmo (Io/It) recibe el nombre de absorbancia (A). Entonces, la absortividad también se puede definir como la absorbancia A que presenta una solución de concentración c unitaria de la sustancia problema, observada bajo un espesor l unitario. A/ (l.c) = a Evidentemente el valor numérico de a depende de las unidades de concentración empleadas. Siendo [l]= cm; si c se expresa en g %, se obtiene [a] = (cm.gr %) -1.Si c se expresa en g/cm 3, se obtiene a 0 (absortividad específica). Si c se expresa en M (moles por litro), se obtiene ε (absortividad molar o coeficiente de extinción molar), y sus unidades serán L.(mol.cm) -1. Relacionando las ecuaciones anteriores se obtiene: A = a.l.c = - log T = - log It / I 0 y T = 10 -A Representando gráficamente la absorbancia en función de la concentración del analito, el gráfico que se obtiene establece la relación lineal entre las variables. Si, trabajando con la solución de una sustancia determinada, e iluminando con luz monocromática, se obtiene una representación lineal, se dice que la sustancia cumple la Ley de Lambert Beer. 2

3 Medición de transmitancia y absorbancia La transmitancia y la absorbancia se miden en un instrumento llamado espectrofotómetro, la solución del analito se debe contener en algún recipiente, denominado celda, transparente a la longitud de onda utilizada. Los espectrofotómetros, están a menudo equipados con un dispositivo que tiene una escala lineal que se extiende de 0 a 100%. De manera de hacer tal instrumento de lectura directa en porcentaje de transmitancia, se efectúan dos ajustes preliminares, llamados 0%T y 100%T. El ajuste del 0%T se lleva a cabo mediante un cierre mecánico del detector. El ajuste de 100%T se hace con el cierre abierto y el solvente en el camino de la luz. Normalmente el solvente está contenido en una celda que es casi idéntica a las que contienen las muestras (idealmente se utiliza siempre la misma celda). Cuando la celda del solvente es reemplazada por la celda que contiene la muestra, la escala da la transmitancia porcentual. Los instrumentos actuales poseen un sistema electrónico que realiza la operación matemática y da la respuesta directamente absorbancia. También hay que hacer una calibración previa con el solvente o blanco. Curva de calibración Denominamos espectro de una sustancia a la representación de absorbancia (A) en función de longitud de onda (λ), este gráfico presenta ondulaciones con máximos y mínimos característicos. Para hacer las determinaciones cuantitativas se elige, en general, la longitud de onda correspondiente a un máximo; este máximo no debe ser un pico sino que debe ser una curva suave, pues el error de medición es mínimo y la sensibilidad máxima. Para verificar el cumplimiento de la ley de Beer, se debe realizar la curva de calibración, graficando absorbancia (A) en función de concentración (c), para lo cual se preparan soluciones de la sustancia de concentraciones conocidas y se mide la absorbancia a la longitud de onda elegida. Si es válida la ley de Beer, para esa sustancia a esas concentraciones, la relación debe ser lineal, que pase por el origen de los ejes cartesianos; a menudo se observan desviaciones debidas a diversos factores. Aplicaciones de la ley de Beer a mezclas La ley de Beer también se aplica a una solución que contiene más de una clase de sustancia absorbente. Siempre que no haya interacción entre las varias especies, la absorbancia total para un sistema multicomponente está dada por la suma de las absorbancias de cada componente. A t = ΣA n Limitaciones a la aplicabilidad de la Ley de Beer Se encuentran pocas excepciones a la generalización que la absorbancia está relacionada linealmente a la longitud del camino óptico. En cambio, las desviaciones de la proporcionalidad directa entre la absorbancia medida y la concentración, para l constante, son más frecuentes. Estas desviaciones son fundamentales y representan limitaciones reales de la ley. 3

4 Algunas ocurren como una consecuencia de la manera en que las mediciones de absorbancia se hacen, o como un resultado de cambios químicos asociados con cambios en la concentración. Otras ocurren a veces como desviaciones instrumentales. Limitaciones propias de la Ley de Beer La ley de Beer es exitosa en describir el comportamiento de absorción de soluciones diluidas solamente. A concentraciones altas (generalmente mayores que 0,01 M), la distancia promedio entre las especies responsables de la absorción está disminuida hasta el punto que cada una afecta la distribución de cargas de sus vecinas. Esta interacción, a su vez, puede alterar la habilidad de las especies para absorber en una longitud de onda de radiación. Debido a que la extensión de la interacción depende de la concentración, la ocurrencia de este fenómeno provoca desviaciones de la relación lineal entre absorbancia y concentración. Un efecto similar se encuentra a veces en soluciones que contienen altas concentraciones de otras especies, particularmente electrolitos. La proximidad de iones a la especie absorbente altera la absortividad molar de la última por atracciones electrostáticas, este efecto se disminuye por dilución. Se encuentran algunas excepciones entre ciertos iones o moléculas orgánicas grandes, que presentan interacciones significativas a concentraciones debajo de 0,01 M. Desviaciones de la ley de Beer también surgen porque ε es dependiente del índice de refracción de la solución; entonces, si cambios de concentración provocan alteraciones en el índice de refracción de la solución, se observan desviaciones de la ley. Desviaciones químicas aparentes Surgen cuando un analito se disocia, se asocia, o reacciona con el solvente para producir un producto teniendo un espectro de absorción diferente del analito. Por ejemplo CrO 4 2- en función del ph va a absorber diferente. Componentes básicos de un espectrofotómetro: La fuente de luz proporciona un haz policromático que es colimado al atravesar la ranura de entrada. Este haz llega al selector de longitud de onda, el cual permite generar un haz monocromático de la longitud de onda deseada. El rayo de luz monocromático atraviesa la segunda ranura e incide perpendicularmente sobre la cara lateral de la cubeta, la cual contiene la muestra. El haz de luz transmitido por la muestra es detectado al impactar sobre el detector. Los espectrofotómetros son una herramienta importante del laboratorio, y de su buen funcionamiento depende la calidad de los resultados que se obtienen. Por lo tanto es importante conocer y controlar determinados parámetros, analizarlos y verificar si se encuentran dentro de los rangos de aceptabilidad permitidos y en caso contrario, proceder a calibrar, reparar, llamar el servicio técnico, etc. Algunos controles espectrofométricos se les realizan a los equipos cada vez que se los usa, y otros periódicamente. 4

5 Controles Control de luz espuria La luz espuria o errática es toda luz que llega al detector sin haber atravesado la muestra cuya absorbancia queremos medir, pudiendo ser de la misma o de diferente longitud de onda que la seleccionada. La luz que llega al detector puede provenir de reflexiones internas dentro del tubo; puede pasar por arriba del menisco de la solución a medir cuando se trabaja con un volumen inferior al volumen mínimo; o en otros casos puede llegar por los costados del tubo cuando la cubeta es de un tamaño menor al que le corresponde. La luz espuria también puede deberse a un inapropiado cierre del compartimiento donde se ubica el tubo con la muestra, o a la presencia de goteras dentro del aparato. Estas últimas pueden detectarse iluminando el instrumento desde el exterior con una linterna, cuando el mismo está siendo usado en la zona del visible. La gotera puede corregirse tapándola con cinta negra. Otra causa de producción de luz espuria puede ser el mal alineamiento de la cubeta o del sistema portacubeta, como también una falta de alineación de la fuente de luz; también puede deberse a fallas en el sistema de monocromación. La luz espuria se mide en porcentaje de transmitancia y es importante que sea bajo, pues de lo contrario, se producen desviaciones negativas de la ley de Lambert-Beer, dado que llega al detector más luz de la que debería (por lo tanto la absorbancia medida es menor). El porcentaje máximo aceptado de luz espuria es del 1 %. Los métodos para detectar la luz espuria incluyen filtros o soluciones que son opacos en los rangos habituales de trabajo. Así se puede utilizar una cubeta de obstrucción de paso de luz (una cubeta pintada de negro o sea de cuerpo negro); o bien una solución híperconcentrada de colorante. En todos los casos se leerá la transmitancia contra blanco de agua, a cualquier λ de la zona del visible. El valor leído representa directamente el % de luz espuria. Es muy importante no confundir luz espuria con luz parásita; ésta última es un caso particular de Luz espuria. La luz parásita es la radiación electromagnética de longitud de onda distinta a la seleccionada por el monocromador que llega al detector, pasando o no por la muestra. Es decir es luz de distinto color (distinta λ) que la seleccionada. Como consecuencia de ello, hay un aumento no deseado de transmitancia (o, una disminución de la absorbancia), dado que la luz parásita no es absorbida por la solución como lo hace con la seleccionada. Este control de luz parásita debe hacerse con una solución concentrada (absorbancia mayor a 2) en una zona de máxima sensibilidad y el detector debe recibir luz, o sea que la solución contenida en el tubo debe permitir el pasaje de luz. Por ello no puede emplearse un cuerpo opaco pues obstruiría el pasaje al detector de cualquier tipo de luz (parásita o no). Control de centro de banda: Este control analiza la correlación entre la longitud de onda seleccionada por el operador (leída en la pantalla) y la que efectivamente llega a la muestra (real). Si existe diferencia entre la real y la leída, a esa diferencia se la conoce como desplazamiento o corrimiento de la longitud de onda y se mide en nm. Hay que tener presente que en las determinaciones donde no se lee a la correcta longitud de onda correspondiente al máximo de absorción del cromógeno, se pierde sensibilidad, lo cual puede constituirse en una fuente de error. Para realizar este control se pueden utilizar sustancias de referencia que presenten uno o más picos de absorción característicos de su espectro. Estos picos deben ser estrechos, deben estar distribuidos dentro de todo el intervalo espectral del instrumento y además deben estar definidos con extrema exactitud. Las soluciones de dicromato de potasio, y los filtros de holmio y didimio cumplen estos requisitos. Para efectuar este control debe hacerse un barrido espectral de una de las sustancias de referencia. Si efectivamente la máxima absorbancia se obtiene a la longitud de onda esperada para la sustancia de referencia empleada, podemos asegurar que en esa zona el aparato trabaja a las longitudes de onda seleccionadas. Ahora bien, ello no asegura que en otros rangos de longitud de onda exista igual correlación, por ello se utilizan otras sustancias con máximos a otras longitudes de onda para poder comprobarlo. 5

6 Otro método de control de centro de banda es el método del punto isosbéstico. El punto isosbéstico se define como la longitud de onda a la cual las formas ácida y básica de una misma sustancia, en concentraciones equivalentes, tienen igual absorbancia. Las sustancias que cumplen esta condición son algunos indicadores colorimétricos de ph tales como el rojo congo, rojo fenol, azul de bromofenol, entre otros. La importancia del método radica en que el punto isosbéstico es independiente de la concentración absoluta de la sustancia y de la temperatura entre 4º y 45º C. Hay que tener presente que una cosa es el barrido espectral de una sustancia, el cual se hace con la finalidad de conocer su espectro de absorción, y otra cosa muy distinta es el control de centro de banda, en donde se emplea una sustancia de espectro conocido, con el objetivo de verificar si la longitud de onda informada por el instrumento se corresponde con la que recibe la muestra. Control de volumen mínimo Este control asegura que toda la luz pase por la solución y no por arriba o por el menisco, lo que produciría resultados erróneos. Desde el punto de vista económico, este control es importante ya que cuanto menor sea el volumen mínimo, más economía se puede lograr en el uso de reactivos. Puede realizarse con agua o con una solución coloreada transparente. Se considerará volumen mínimo aquel en el cual la lectura no varía con el agregado de más líquido. Control de cubetas Se realiza para comprobar las cualidades ópticas y de construcción de las cubetas de medida. Se realiza midiendo la T % de las cubetas llenas de agua o solución diluida de colorante, tomando una cubeta como referencia y verificando las desviaciones de las demás con respecto a ésta. No debería existir una variación superior al 1% de T. En el caso de no conseguir varias cubetas que reúnan esta condición se deberá trabajar siempre con la misma y en la misma posición respecto de la luz incidente. Teniendo varias cubetas de iguales características el proceso de medir varias muestras resulta más ágil. Control de linealidad fotométrica: Indica la linealidad de respuesta del sistema de detección, y por ende el rango de utilidad para la longitud de onda de trabajo seleccionada. En espectrofotómetros de alta calidad se obtienen respuestas lineales hasta valores de absorbancia cercanos a 2,000. Éste es un control de gran importancia sobre todo para medidas absolutas o cuando se usan factores de cálculo. Se realiza midiendo la absorbancia de soluciones de concentraciones crecientes de un colorante que se sabe cumple con la ley de Lambert-Beer, es decir que presenta un comportamiento lineal entre absorbancia y concentración. Por lo tanto si al hacer el control, el gráfico de absorbancia en función de concentración deja de ser lineal en cierto valor de absorbancia, este será el máximo valor de absorbancia aceptable en cualquier otra medida a esa longitud de onda. Es importante no confundir linealidad fotométrica, que es la que se verifica con este control, con el cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer por parte de una sustancia dentro de un determinado rango de concentraciones. Con este control se verifica si efectivamente el aparato responde linealmente. Por ello deberemos trabajar con una sustancia que sepamos de antemano que en los rangos de concentración utilizados, presenta linealidad ( cumple Lambert-Beer). Si el aparato presenta linealidad fotométrica, esto nos permitirá afirmar con seguridad el no cumplimiento de Lambert-Beer por parte de una sustancia en estudio (en determinado rango de concentración) cuando no obtengamos un resultado lineal para la misma, aseveración que solo podremos mantener si nuestro aparato responde linealmente. Con un gráfico absorbancia en función de concentración se informará hasta que valor de absorbancia hay linealidad por parte del equipo. Control de veracidad Este control se realiza luego de haber verificado los controles anteriores, y permite analizar la veracidad de los resultados obtenidos con el equipo. A través de este control se verifica la concordancia entre la absorbancia de referencia, obtenida con una solución standard en un equipo calibrado, y la absorbancia medida para la misma solución pero en el equipo que se está controlando. 6

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