Seminarios en Biotecnología y Bioseguridad de OGMs

Transcripción

1 Seminarios en Biotecnología y Bioseguridad de OGMs Agro-infiltración (expresión transitoria por transformación de Agrobacterium) Dra. Rocío Díaz de la Garza ITESM 14 de noviembre de :00 a 12:00 Hrs

2 Agro-infiltración (expresión transitoria por transformación de Agrobacterium)

3 TRANSFORMACIÓN ESTABLE vs TRANSITORIA EN PLANTAS UNA TRANSFORMACIÓN ESTABLE SIGNIFICA QUE ES HEREDABLE PARA QUE ESTO SUCEDA, EL ADN FORÁNEO DEBE DE INTEGRARSE AL GENOMA NUCLEAR O AL DEL CLOROPLASTO DE LAS CÉLULAS GERMINALES EN UNA TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA EL ADN FORÁNEO NO SE INTEGRA AL GENOMA DE LA CÉLULA EN TODOS SUS TEJIDOS (ÓVULOS O POLEN)

4 PARA QUÉ TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA EN PLANTAS? DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR TRANSCRIPCIÓN TRADUCCIÓN A. ADN (ácido desoxirribonucleico) B. marn (ácido ribonuleico mensajero) C. tarn (transferencia) D. Ribosoma E. Proteína Las proteínas pueden ser estructurales o pueden ser enzimas (catalizadores biológicos) que generen compuestos de interés

5 PARA QUÉ TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA EN PLANTAS? TRANSCRIPCIÓN TRADUCCIÓN Aún si el ADN no se integra al núcleo en todos los tejidos, éste puede leerse para generar proteínas de interés en la célula vegetal por un corto tiempo Estas proteínas por lo general son de alto valor (farmacia) También esta transformación es muy rápida (toma días expresar una proteína) y en el laboratorio es una técnica muy útil para estudiar múltiples aspectos de la biología vegetal desde el punto de vista científico

6 TRANSFORMACIÓN VEGETAL DOS TÉCNICAS BÁSICAS AGROBACTERIUM (TUMEFACIENS o RHIZOGENES) Transfiere el ADN a la célula vegetal y puede dar transformantes estables o transientes dependiendo del método de transformación BIOBALÍSTICA Utiliza micropartículas de oro o tugnsteno cubiertas de ADN y las dispara al tejido vegetal Genera transformantes estables cuando el ADN se incorpora al genoma del núcleo o cloroplasto de la célula

7 AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Agrobacterium tumefaciens Bacteria fitopatógena que se encuentra usualmente en suelos y causa la enfermedad conocida como agalla de corona en las plantas Esta bacteria tiene la habilidad de transferir genes a las plantas para que éstas produzcan metabolitos que benefician a la bacteria Agalla de corona

8 TRANSFERENCIA DE ADN DEL AGROBACTERIUM A LA PLANTA Los genes que normalmente transfiere son para que la planta genere compuestos que sirven de alimento al Agrobacterium y además genes que ocasionan un crecimiento indeterminado de la célula vegetal

9 USO DEL AGROBACTERIUM EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL Estos genes de la bacteria se cambian por los de interés Ti = Tumor- inducing plasmid Así, el Agrobacterium le puede transferir a la célula vegetal genes de cualquier origen (vegetal, animal, bacteriano, etc.)

10 Cómo se genera una transformación estable? A través de cultivo de tejidos in vitro Se infectan tejidos de la planta con el Agrobacterium que contiene nuestro gen de interés y otro de resistencia a un herbicida/antibiótico Se cultivan los tejidos in vitro y se induce la formación de una planta con el uso de fitohormonas Planta resistente al herbicida/antibiótico Alta posibilidad de que esté transformada de manera estable (sus semillas serán transgénicas y generarán plantas transformadas también)

11 Cómo se genera una transformación transitoria? También se utiliza Agrobacterium Pero no hay regeneración de una planta completa Se realiza por medio de infiltración del Agrobacterium a la célula vegetal Usualmente se utilizan vectores virales para tener más proteína acumulada en los tejidos de la planta Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013

12 USO DE VECTORES VIRALES Las primeras transformaciones transitorias tomaron ventaja de la capacidad de los virus de viajar a través de la planta (movimiento sistémico) para que así se expresara el transgén en la planta entera Gleba et al., Cur Op Plant Biotech 2007

13 COMPOSICIÓN GENÉTICA DE UN VECTOR DE VIRUS COMPLETO Gleba et al, Cur Op Plant Biol 2004 Vectores basados en el virus VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO (TMV siglas en inglés) TIENE LA CAPACIDAD DE REPLICARSE EN LA PLANTA Y FORMAR PARTÍCULAS VIRALES P - Promotor TMV Pol RNA- dependiente RNA polimerasa para la producción del mensajero MP Proteína de mobilidad GOI Gen de interés CP Proteína de la cápside T - terminador Nota: estos virus utilizados son fitopatógenos, es decir no representan ningún riesgo para la salud humana, sólo infectan plantas

14 VECTORES VIRALES Zhang et al., Plant Methods 2013 Las plantas se infectan ya desarrolladas con virus que expresan nuestro gen de interés Los virus se pueden mover sistémicamente a través de la planta Se infecta una célula vegetal El virus se mueve de célula a célula a través del plasmodesmata (canales de comunicación que existen en células vegetales) Virus del mosaico del narciso utilizado como vector para producir antocianinas

15 VECTORES VIRALES DECONSTRUIDOS La desventaja de utilizar virus completos es que la planta emplea muchos recursos en sintetizar las proteínas de la cápside viral Así, se empezaron a modificar estos vectores para que ya no la expresaran X X Gleba et al, Cur Op Plant Biol 2004

16 VECTORES VIRALES DECONSTRUIDOS Además se han hecho otros cambios en la secuencia de los vectores para que tuviera mejor expresión de los genes en la célula vegetal Aumentos en eficiencia de transfección y en los niveles de expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) Marillonnet et al., Nat Biotech 2005 Marillonnet et al., Nat Biotech 2005

17 VECTORES DECONSTRUIDOS PARA INFILTRACIÓN magnicon - Vectores producidos por Icon Genetics (compañía alemana). Son los más utilizados para las magninfecciones con Agrobacterium. Este sistema está basado en el virus del mosaico del tabaco (TMV) y el virus X de la papa Sistema de replicación de ADN geminiviral. Está basado en el virus del mosaico enano amarillo del frijol (BeYDV) Sistema de replicación basado en el virus del mosaico del caupí (CPMV)

18 Vectores virales deconstruídos Estas mejoras han dado como resultado que se necesite menos concentración de Agrobacterium para infectar con mayor eficiencia la planta y una mayor expresión de las proteínas de interés Más células transfectadas Chung et al., 2005

19 DIFERENCIAS EN EXPRESIÓN DE VECTORES VIRALES COMPLETOS Y DECONSTRUIDOS Las partículas virales completas viajan a través del floema de la planta hacia tejidos jóvenes Gleba et al., Cur Op Plant Biotech 2007 Infectando con Agrobacterium que contiene los vectores deconstruidos (que inclujyen una proteína de movilidad), en una semana se cubre casi toda la superficie foliar

20 AGROINFILTRACIÓN A nivel laboratorio se puede hacer con una jeringa Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013 A. Primero se realiza una pequeña herida en el envés de la hoja (en la figura se muestran hojas de Nicotiana benthamiana de plantas de 6 semanas) B. Luego se agrega la solución del Agrobacterium tumefaciens ya modificado con el vector viral y el gen de interés utilizando una jeringa sin aguja a través de la herida en los espacios intracelulares de la hoja

21 AGROINFILTRACIÓN DE PLANTA COMPLETA UTILIZANDO VACÍO La aplicación del vacío fuerza la formación burbujas de aire fuera de los estomas, entonces cuando se libera, entra con mayor facilidad del Agrobacterium por los estomas (orificios en las plantas en donde se realiza el intercambio de gases) Loh&Wayah, Asian Journal of Biotechnology, 2014 Al sumergir toda la planta en una solución diluida del Agrobacterium, y aplicar vacío se busca que entren miles de células en todas las hojas de la planta

22 EXPRESIÓN DE PROTEÍNA FLUORESCENTE DESPUÉS DE LA AGROINFILTRACIÓN JERINGA VACÍO ASPERJADO DE SOLUCIÓN DE AGROBACTERIUM Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013

23 Gleba et al., Cur Op Plant Biotech 2007 ESCALAMIENTO

24 COMPAÑÍAS PRODUCTORAS DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN PLANTAS Produce vacunas y proteínas terapéuticas en plantas a través de la expresión transiente Prueba clínica fase II en vacuna contra la influenza H5N1 Va a empezar fase II en vacuna tetravalente contra H1N1, H3N2 y dos influenzas B

25 COMPAÑÍAS Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013

26 ZMAPP COCTEL DE ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA EL ÉBOLA PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS DISEÑADAS POR MAPP BIOPHARMACEUTICAL, COMPAÑÍA QUE CONTRATÓ A KENTUCKY BIOPROCESSING PARA PRODUCIRLAS EN PLANTAS DE TABACO TRANSFORMADAS DE FORMA TRANSIENTE COMO RESPUESTA AL CONTAGIO DE TRABAJADORES ESTADOUNIDENSES Y ESPAÑOLES EN AFRICA, SE LES PROPORCIONÓ EL SUERO EXPERIMENTAL COMO TRATAMIENTO

27 OTRAS VACUNAS Y PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS EN DESARROLLO Gleba et al., Curr Topics in Microbiology & Immunology 2013

28 ENSAYOS PRECLÍNICOS DE PROTEÍNAS GENERADAS EN PLANTAS AGROINFILTRADAS CON VECTORES VIRALES Gleba et al., Curr Topics in Microbiology & Immunology 2013

29 VENTAJAS DE LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS EN PLANTAS vs. CÉLULAS DE MAMÍFERO COSTOS DE PRODUCCIÓN RENDIMIENTO RAPIDEZ EN EXPRESIÓN RAPIDEZ EN MANUFACTURA Sistema de expresión Cultivo de células de mamífero Tiempo para obtener miligramos de anticuerpo 2-6 meses 6-12 meses Animales transgénicos > 12 meses > 12 meses Tiempo para obtener gramos de anticuerpo *datos traducidos de PNAS 2006, 103:14645 Plantas transgénicas estables Magnifection (expresión transitoria con magnicon ) 12 meses > 24 meses 14 días días

30 AGROSPRAY Tecnología desarrollada por Nomad Bioscience GmbH, donde se asperja Agrobacterium con surfactantes (detergentes) Esta tecnología está en etapas tempranas, pero tiene gran potencial en agricultura y manufactura de biomateriales En agricultura se podría reprogramar transitoriamente un cultivo para ser resistente a plagas, a estrés abiótico o mejorar la producción de compuestos Las plantas no serían transgénicas y sólo se tendría que comprar el producto a asperjar Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013 Esta técnica de transformación transitoria está desarrollándose y representa un potencial para mejorar cultivos en invernadero o en el campo. Se tendría que crear un marco regulatorio para liberar Agrobacterium transformado (en el caso de asperjar en campo)

31 REGULACIÓN Todavía no existe un producto de expresión transitoria de plantas aprobado por alguna agencia regulatoria Hay discusiones preliminares en cómo regular estas plantas modificadas para su expresión transitoria y cómo manejar los productos de éstas Aun no existen guías claras sobre su regulación La agroinfiltración está considerada como una técnica nueva de mejoramiento vegetal en la mayoría de los foros

32 TALLER DE REGULACIÓN ORGANIZADO POR LA UNIÓN EUROPEA 2012 (JRC- Joined Research Center) PARTICIPARON DELEGACIONES DE ARGENTINA, AUSTRALIA, CANADÁ, JAPÓN, ESTADOS UNIDOS Y SUDÁFRICA

33 DEFINICIÓN - FAO

34 DINAMARCA

35

36

37 Agroinfiltración de flores: Puede llegar a dar plantas transformadas Se utiliza en el laboratorio muy comunmente para transformar Arabidopsis, la planta modelo En otras plantas es difícil utilizar esta técnica Se transforman células germinales y las semillas pueden llevar el transgén Arabidopsis thaliana photo by Vijay Singh

38 Procedimiento Se sumergen las plantas con inflorescencias en medio con Agrobacterium diluido (se puede aplicar vacío) Se dejan desarrollar y se colectan las semillas Además del transgén de interés se añade un gen de resistencia para poder seleccionar las semillas transgénicas, que son las que germinan y sobreviven No son necesarios los vectores virales Zang et al., Nat Protocols 2006

39 CONCLUSIONES La transformación transitoria de plantas con vectores de base viral es capaz de producir proteínas de alto valor en grandes cantidades y en corto tiempo En Norteamérica y Europa se han logrado desarrollos precomerciales importantes, los cuales incluyen pruebas de proteínas terapéuticas y vacunas en humanos en fase I La tecnología está a poco tiempo de tener productos aprobados por las agencias regulatorias Variantes de la transformación transitoria por agroinfiltración se están probando para mejorar agronómicamente plantas bajo cultivo protegido y en campo abierto Es necesario un marco regulatorio basado en un análisis de bioseguridad que permita el desarrollo de estas tecnologías en el país

40 Gracias!