Fundación Maní Argentino

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1 Fundación Maní Argentino Aspectos epidemiológicos del Groundnut ringspot virus en cultivos de maní Antecedentes En Córdoba, el cultivo de maní es afectado naturalmente por Groundnut ringspot virus (GRSV, Tospovirus). Esta virosis muestra valores de prevalencia variables entre las distintas campañas agrícolas y un desplazamiento hacia el sur de la región manisera. Es posible que este hecho esté relacionado con la presencia de trips vectores capaces de transmitir el GRSV a maní desde otros cultivos o malezas infectadas, favoreciendo la dispersión del virus hacia nuevas zonas maniseras sin antecedentes de la enfermedad. Se sabe que un patosistema está conformado por tres factores biológicos que deben coincidir en un entorno adecuado para desarrollar una epidemia, éstos son: el patógeno viral, los insectos vectores, y las plantas hospederas tanto del virus como de los vectores. La complejidad ecológica del patosistema aumenta sustancialmente cuando existen varias especies o razas del virus y mientras mayor es el número tanto de especies vectoras como de hospedantes alternativos presentes. Sin embargo, hasta el momento no se conoce si existe o no variabilidad genética entre los distintos aislamientos de GRSV que infectan maní, no se han efectuado estudios prolongados (durante varios ciclos de cultivo) sobre la presencia de insectos capaces de transmitir esta virosis y tampoco se posee información acerca de la naturaleza de las fuentes primarias de infección, ni cómo el virus se dispersa entre los distintos cultivos y a larga distancia. Hipótesis de trabajo En Córdoba, el cultivo de maní es afectado naturalmente por Groundnut ringspot virus (GRSV, Tospovirus). Esta virosis muestra valores de prevalencia variables entre las distintas campañas agrícolas y un desplazamiento hacia el sur de la región manisera. Es posible que este hecho esté relacionado con la presencia de trips vectores capaces de transmitir el GRSV a maní desde otros cultivos o malezas infectadas, favoreciendo la dispersión del virus hacia nuevas zonas maniseras sin antecedentes de la enfermedad. Objetivo general El presente proyecto tiene como objetivo general caracterizar molecularmente el Groundnut ringspot virus y estudiar distintos aspectos epidemiológicos de la enfermedad. Objetivos específicos 1- Determinar la variabilidad molecular a nivel geográfico del GRSV. 2- Identificar las distintas especies de trips presentes en el cultivo. 3- Conocer la dinámica poblacional de trips vectores en el cultivo y relacionarla con la incidencia de la virosis. 4- Identificar malezas y/o cultivos que actúan como hospederas tanto del GRSV como de sus trips vectores.

2 Metodología de trabajo 1- Determinar la variabilidad molecular a nivel geográfico del GRSV. 1.A- Recolección de muestras: Durante la campaña agrícola se evaluarán lotes comerciales de maní distribuidos en distintas localidades de la región manisera de Córdoba. En cada lote se realizará un muestreo dirigido y se tomarán muestras provenientes de maníes que manifiesten síntomas típicos de infección por Tospovirus: severo achaparramiento, superbrotación de yemas axilares, disminución del tamaño de los folíolos y clorosis severa, anillos cloróticos y diseños lineales en las hojas. También se inspeccionarán lotes aledaños a los de maní sembrados con otros cultivos estivales y se recolectarán malezas que muestren síntomas similares a los causados por virus. Para confirmar la presencia del virus todas las muestras serán analizadas por DAS-ELISA utilizando antisueros específicos para GRSV y TSWV (Agdia Inc.). 1.B.- nucleicos: se realizará la técnica de antígeno captura seguida de una RT- PCR utilizando el kit Access RT-PCR System (Promega Corp.) junto con cebadores específicos para amplificar el gen que codifica para la nucleoproteína del virus (N), una porción del gen L que codifica para la polimerasa viral (RdRp) y el gen precursor de las glicoproteínas (G N y G C ) presentes en la cápside viral. 1.C.- Clonado y secuenciación: Los fragmentos de ADN amplificados serán clonados utilizando el kit TOPO TA Cloning for Sequencing (Invitrogen Corp., San Diego, CA, USA) siguiendo las indicaciones del fabricante. La presencia de colonias recombinantes portadoras del inserto esperado, será corroborada mediante: a) Análisis de clones mediante la técnica de PCR directo con los iniciadores universales T7 (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3') y T3 (5'-CAA TTA ACC CTC ACT AAA GG-3') y b) Purificaciones de ADN plasmídico proveniente de colonias blancas y posterior digestión de los mismos con la enzima de restricción EcoRI (Promega Corp.). Los ADN plasmídicos aptos para secuenciación se obtendrán utilizando un kit de purificación (QIAGEN Plasmad Mini Kit 100, Hilden, Alemania), según el protocolo recomendado por el fabricante. La concentración y calidad del ADN purificado se determinará por lectura a A 260 en espectrofotómetro (DU640B spectrophotometer, Beckman Coulter TM, USA). Los clones se secuenciarán en Macrogen Inc., República de Corea. 1.D.- Análisis genéticos: Las secuencias de nucleótidos (nt) y aminoácidos (aa) deducidos de cada gen de los distintos aislamientos virales se compararán entre sí y con otras secuencias disponibles en el National Center of Biotechnology Information (NCBI, sitio web: Los alineamientos múltiples para análisis de porcentajes de identidad y análisis filogenéticos se obtendrán con la opción Clustal W utilizando el programa DNASTAR (DNASTAR 2001, Lasergene software). Mediante el uso de herramientas bioinformáticas se construirán haplotipos con los loci provenientes de las distintas localidades, separadas por año, y se determinarán los siguientes datos: porcentaje de diversidad,

3 varianza genética, tasa de mutación, mutaciones sinónimas y no sinónimas, presencia de recombinaciones. 2- Identificar las distintas especies de trips presentes en el cultivo. 2.A.- Se visitarán distintos lotes comerciales de maní distribuidos por toda el área manisera de la provincia de Córdoba. En cada uno de ellos se determinará la presencia o ausencia En algunos lotes seleccionados al azar, se tomarán muestras de trips y se almacenarán en tubos con alcohol al 70%. Cada uno de los trips adultos recolectados será montado sobre porta espécimen para su identificación en el Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola (IMYZA) del INTA Castelar. 3- Conocer la dinámica poblacional de trips vectores en el cultivo y relacionarla con la incidencia de la virosis. 3.A.- Para determinar la fluctuación poblacional de trips en el maní se trabajará en lotes implantados en la EEA INTA Manfredi. En cada lote se tomarán muestras de trips presentes en las hojas y flores de plantas seleccionadas al azar. Las mismas se seguirán a lo largo de todo el período de evaluación, comenzando 14 días después de la siembra. La colecta de trips se realizará semanalmente y los mismos se almacenarán en tubos con alcohol al 70%. Cada uno de los trips adultos recolectados será montado en porta espécimen para su posterior identificación. 3.B.- La incidencia del GRSV en cada lote de maní se determinará siguiendo un diseño en W con 5 estaciones en cada brazo y en cada estación se evaluarán 20 plantas seguidas en el surco por presencia o ausencia de síntomas. Las plantas que presenten síntomas de infección viral serán analizadas por DAS- ELISA utilizando antisueros comerciales específicos para GRSV (Agdia Inc., Elkhart, IN, USA). 4- Identificar malezas y/o cultivos que actúan como hospederas tanto del GRSV como de sus trips vectores. 4.A.- Se realizará una prospección durante el ciclo del cultivo y durante los meses en que el mismo no se encuentra implantado. Durante la misma se efectuarán muestreos en diferentes localidades de la región manisera de Córdoba. Se recolectarán hojas jóvenes provenientes de cultivos y malezas que presenten síntomas típicos de infección viral. Todas las muestras colectadas serán procesadas en el laboratorio para su evaluación serológica a través de la técnica de DAS-ELISA utilizando antisueros específicos para GRSV (Agdia Inc.). También se tomarán muestras de trips en aquellas plantas sintomáticas para luego proceder a su identificación. Dichas acciones se llevarán a cabo con la colaboración de profesionales y personal técnico de la EEA- INTA Manfredi y el IMYZA-INTA Castelar.

4 Cronograma de trabajo Período Actividades O N D E F M A M J J A S 2011/ / /2014 Revisión bibliográfica Análisis de datos y publicación de los resultados. Revisión Bibliográfica Análisis de datos y publicación de los resultados. Revisión Bibliográfica

5 Grupo de trabajo Ing. Agr. (PhD) Sergio Lenardon Ing. Agr. (Dra.) Soledad de Breuil Biól. (Dr.) Fabián Giolitti Ing. Agr. Nicolás Bejerman

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