11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : C12N 15/82

Transcripción

1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : C12N /82 C12N / C12N /29 A01H 1/02 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: k Fecha de presentación: k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Plantas con flores modificadas. k Prioridad: EP k 73 Titular/es: Aventis CropScience N.V. Jozef Plateaustraat Gent, BE k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Mariani, Celestina; Leemans, Jan y Greef, Willy de k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Ungría López, Javier ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 Plantas con flores modificadas. DESCRIPCION La presente invención se refiere a un método para restaurar la fertilidad de una planta de esterilidad femenina o esterilidad masculina nuclear transgénica a través del cruce de dicha planta estéril con una planta restauradora de la fertilidad transgénica para proporcionar una planta con la fertilidad restaurada transgénica que tiene una secuencia de ADN extraña del genoma nuclear de la planta restauradora que está integrado de forma estable en el genoma nuclear de la planta restaurada. La secuencia de ADN extraña de la presente invención contiene un ADN extraño (en adelante denominado ADN restaurador de fertilidad ) que 1) codifica una primera proteína o polipéptido que es inhibidor de una ribonucleasa y que, cuando se produce o superproduce en una célula de una flor, en particular, un órgano reproductor masculino o femenino de la misma, o una semilla o un embrión de la planta restaurada, impide la actividad en la célula de la flor, semilla o embrión de una segunda proteína o polipéptido que es la ribonucleasa y que, cuando se produce o superproduce en la célula de la flor, semilla o embrión, afectaría significativamente de manera negativa si no, en el metabolismo, funcionamiento y/o desarrollo de la célula de la flor, semilla o embrión; y 2) está en la misma unidad de transcripción, y bajo su control, que un primer promotor, que es capaz de dirigir la expresión del ADN restaurador de fertilidad al menos a la mismas células de flor o semilla o embrión de la planta restaurada en la que se está produciendo o superproduciendo el segundo ARN, proteína o polipéptido. La segunda proteína o polipéptido está codificadopor un ADN de esterilidad extraño que proviene del genoma nuclear de la planta estéril, que también está establemente integrado en el genoma nuclear de la planta restaurada y se encuentra bajo el control del promotor de la esterilidad que es capaz de: i) dirigir la expresión del ADN de la esterilidad de forma selectiva a células específicas de cada flor, en particular, al menos un órgano reproductor masculino o al menos un órgano reproductor femenino de la misma, o de cada semilla o de cada embrión de la planta restaurada y ii) hacer así que la planta restaurada tenga esterilidad masculina o femenina en ausencia de la expresión del ADN restaurador de fertilidad en las células de flor, semilla o embrión específicas. La secuencia de ADN extraña de la presente invención, transferida de la planta restauradora a la planta restaurada, es opcionalmente una secuencia de ADN quimérica extraña que también puede contener una segunda secuencia de ADN extraña ( primer ADN marcador ) que: 1) codifica un tercer ARN, proteína o polipéptido que, cuando está presente al menos en un tejido específico o células específicas de la planta, hace que toda la planta se pueda separar o distinguir fácilmente de otras plantas que no contienen el tercer ARN, proteína o polipéptido al menos en el tejido específico o células específicas de la planta; 2) se encuentra en la misma unidad de transcripción, y está bajo el control, de un segundo promotor que es capaz de dirigir la expresión del primer ADN marcador a al menos un tejido específico océlulas específicas de la planta; y 3) se encuentra en el mismo locus genético del genoma nuclear de la planta restaurada que el ADN restaurador de fertilidad. La presente invención se refiere asimismo a una secuencia de ADN quimérica extraña que contiene al menos un ADN restaurador de fertilidad bajo el control de al menos un primer promotor y que también puede contener, adyacente al (los) ADN restaurador(es) de fertilidad y el (los) primer(os) promotor(es), al menos un primer ADN marcador bajo el control de al menos un segundo promotor. La presente invención se refiere asimismo a: un vector que contiene la secuencia de ADN extraña de la presente invención y que es adecuado para la transformación de una célula vegetal, en virtud de lo cual se integra la secuencia de ADN de manera estable en el genoma nuclear de la célula; las células vegetales restauradoras de la fertilidad resultantes; cultivos de dichas células vegetales restauradoras de la fertilidad; una planta restauradora de la fertilidad y su material reproductor (v.g., semillas), que se puede regenerar a partir de dicha célula vegetal restauradora de la fertilidad y cuyo genoma nuclear contiene integrado de forma estable la secuencia de ADN extraña; una planta de fertilidad restaurada y su material reproductor que contiene integrado de forma estable en su genoma nuclear la secuencia de ADN extraña junto con al menos un ADN de esterilidad bajo el control de al menos un promotor de la esterilidad; y una célula de la planta de fertilidad restaurada así como cultivos de ella. La presente invención se refiere asimismo a un proceso para producir la planta restauradora y su material reproductor mediante la transformación de una célula de la planta con la secuencia de ADN extraña, en virtud de lo cual el ADN restaurador de fertilidad se encuentra 1) bajo el control del primer promotor y, opcionalmente, en el mismo locus genético que el primer ADN marcador bajo el control del segundo promotor y 2) establemente integrado en el genoma nuclear de las células de la planta. La invención se refiere asimismo a semillas híbridas producidas a través del cruce de: 1) la planta restauradora, que contiene preferiblemente también integrado de manera estable en su genoma nuclear, 2

3 el primer ADN marcador que codifica una proteína que confiere resistencia a un herbicida en la planta restauradora; con 2) una planta con esterilidad masculina o femenina nuclear que tiene establemente integrado en su genoma nuclear a) el ADN de esterilidad bajo el control del promotor de esterilidad y, adyacente al ADN de esterilidad, preferiblemente, dentro del mismo locus genético del genoma nuclear, b) un segundo ADN marcador, que codifica un cuarto ARN, proteína o polipéptido y que, preferiblemente, también confiere resistencia a herbicida a la planta estéril, bajo el control de un tercer promotor capaz de dirigir la expresión del segundo ADN marcador a al menos un tejido específico o células específicas en las que la expresión del segundo ADN marcador hace que la planta se pueda separar o distinguir fácilmente de las plantas en las que no existe dicha expresión. La presente invención se refiere en particular a las semillas híbridas que se producen a escala comercial, preferiblemente, en una población sustancialmente aleatoria, con mayor eficacia de la polinización cruzada y sin necesidad de un excesivo trabajo manual. Antecedentes de la invención La hibridación de plantes está reconocida como un importante proceso para producir retoños que tienen una combinación de las características deseables de las plantes progenitoras. El retoño híbrido resultante tiene con frecuencia la capacidad de superar las características de las plantas progenitoras, como por ejemplo, rendimiento, adaptabilidad a los cambios medioambientales y resistencia a las enfermedades. Dicha capacidad se denomina heterosis o vigor híbrido. En consecuencia, la hibridación se ha utilizado de forma extensiva para mejorar cultivos principales como maíz, caña de azúcar y girasoles. Por una serie de razones, relacionadas principalmente con el hecho de que la mayoría de las plantas se pueden polinizar tanto por autopolinización como por polinización cruzada, la polinización cruzada controlada de plantas sin una autopolinización significativa para producir una cosecha de semillas híbridas, ha sido difícil de conseguir a escala comercial. En la naturaleza, la inmensa mayoría de plantes de cultivo producen órganos reproductores masculinos y femeninos en la misma planta, normalmente en íntima proximidad entre sí dentrodelamisma flor. Esto favorece al autopolinización. Sin embargo, algunas plantas son excepciones como resultado de una morfología determinada de sus órganos reproductores que favorece la polinización cruzada. Estas plantas producen retoños híbridos con mejor vigor y adaptabilidad. Dicha morfología en Cannabis spp. (cáñamo) implica órganos reproductores masculinos y femeninos en plantas distintas. Otra morfología distinta en Zea mays (maíz) implica que los órganos reproductores masculinos y femeninos se encuentren en diferentes partes de la planta. Otra morfología distinta en Elaeis guineensis (aceite de palma) implica que los gametos masculinos y los femeninos fértiles se hagan fértiles en diferentes estadios del desarrollo de la planta. Algunas especies vegetales como Ananas comosus (piña), favorecen la polinización cruzada en virtud de la particular fisiología de sus órganos reproductores. Dichas plantas han desarrollado lo que se ha venido a llamar sistema de autoincompatibilidad en virtud del cual el polen de una planta no es capaz de fertilizar el gameto femenino de la misma planta o de otra planta con el mismo genotipo. Otras especies vegetales favorecen la polinización cruzada manifestando de forma natural lo que se ha venido a llamar la característica genómica de la esterilidad masculina. A través de esta característica, las anteras de las plantas se degeneran antes de que el polen producido por las anteras alcance la madurez. Véase: Male-Sterility in Higher Plants, M.L.H. Kaul, 1987, en: Monographs on Theoretical and Applied Genetics, Edit. Springer Verlag. Se cree que dicha característica natural de esterilidad masculina proviene de una amplia gama de mutaciones naturales relacionadas a menudo con deficiencias y que esta característica no se puede mantener fácilmente en especies vegetales que se autopolinizan predominantemente, ya que en condiciones naturales, no se producirán semillas. Algunos tipos de esterilidad masculina natural se codifican en el citoplasma, mientras que otros se codifican en el núcleo. Hay un tipo de esterilidad masculina que se debe a una combinación de esterilidad masculina codificada en el núcleo y esterilidad masculina codificada en el citoplasma. La esterilidad masculina que induce alelos nucleares es normalmente recesiva y únicamente las plantas que contienen el alelo citoplásmico de esterilidad masculina y que son homocigóticas para el alelo nuclear que induce esterilidad masculina tienen fenotípicamente esterilidad masculina. En este tipo de plantas, los alelos que inducen fertilidad masculina dominantes correspondientes o restauradores de la fertilidad producen un fenotipo de fertilidad masculina. En consecuencia, el retoño de esterilidad masculina de este tipo de planta puede adquirir fertilidad masculina a través de la polinización de plantas con esterilidad masculina con polen que contenga restauradores de la fertilidad. Como resultado, los retoños de plantas de este tipo tienen valor comercial cuando el producto económico es la semilla (v.g., para plantas como el maíz, el sorgo o el girasol). 3

4 La mayoría de los genes de esterilidad masculina naturales conocidas y sus genes restauradores de la fertilidad correspondientes no han sido utilizados para la reproducción o producción de nuevas variedades por dos razones fundamentales: a) calidad insuficiente de los genes responsables de la esterilidad masculina y las características de restauración; y b) la baja capacidad de polinización cruzada de los cultivos en los que se da. 1. Calidad de los genes 2 Para aprovechar todo el potencial del sistema esterilidad masculina/ restaurador de fertilidad, han de conseguirse varios requisitos de calidad: a) Estabilidad de los genes que codifican la esterilidad masculina en una amplio espectro de condiciones medioambientales diferentes. La mayoría de los sistemas que se conocen hoy en día, ya sean de codificación nuclear o citoplásmica, no presentan una estabilidad suficiente. Como consecuencia, en ciertas condiciones climatológicas no predecibles, se produce la autopolinización dentro de las plantas, y se recogen retoños heterogéneos. De acuerdo con los requisitos de certificación de semillas, no se tolera más de un 1 % de semillas no híbridas para la mayoría de los cultivos de campo. b) Ausencia de efectos secundarios en las plantas. Muchos genes de esterilidad masculina citoplásmicos inducen una disminución del vigor de la planta. Esto se puede tolerar hasta un determinado nivel, si el efecto en el vigor del híbrido ofrece una mejora significativa del cultivo en relación con el efecto negativo. Otro de los efectos secundarios que se ha observado en los cultivos que llevan genes de esterilidad masculina consiste en una mayor sensibilidad a algunos patógenos de las plantas (v.g., plantas de maíz portadoras de esterilidad masculina citoplásmica son altamente susceptibles a infecciones por Helminthosporium maydis). Asimismo, los genes restauradores presentan a menudo efectos secundarios negativos aunque, por lo general, no se deben a los propios genes, sino a genes íntimamente relacionados con los genes restauradores. Dichos efectos secundarios consisten, en la mayoría de los casos, en una mayor susceptibilidad a las enfermedades y las plagas, o en una disminución de la calidad del cultivo. 2. Eficacia de la polinización cruzada Para la producción de semillashíbridas a un coste aceptable es esencial una polinizacióncruzada razonablemente eficaz. Para la mayoría de los cultivos de campo que se adaptan escasamente a la polinización cruzada, no es nada realista asegurar una polinización cruzada a mano. Por lo tanto, se ha previsto la venta, como producto comercial, no del híbrido F1, sino del retoño F2 del mismo (v.g., algodón y trigo). Elinconvenientedeestemétodo radica, sin embargo, en la pérdida de homogeneidad y de heterosis, así como la segregación de combinaciones de genes útiles específicas. Para que un granjero garantice un alto rendimiento de un cultivo, conviene que los cultivos híbridos sean totalmente fértiles (a excepción de especies de polinización cruzada muy eficientes como el maíz y la colza de semilla oleaginosa). En particular, esto es el caso de los cultivos que forman polen pesado o pegajoso que no es transportado fácilmente por el viento (v.g., algodón), con cultivos que no son atractivos para los insectos polinizantes (v.g., trigo) y con cultivos que presentan cleistogamia (v.g., soja). Descripción detallada de la invención De acuerdo con la presente invención, se produce una planta restauradora de la fertilidad a partir de una sola célula de una planta transformando la célula vegetal de un modo muy conocido para insertar de forma estable, en el genoma nuclear de la célula, la secuencia de ADN extraña de la presente invención. La secuencia de ADN extraña comprende al menos un ADN restaurador de fertilidad que está bajo el control, y unido en su extremo, del primer promotor y está unido en su extremo 3 con señales de terminación (o regulación) de la transcripción adecuadas, incluyendo una señal de poliadenilación. De este modo, se produce o superproduce el primer ARN, proteína o polipéptido en células de al menos cada una de las flores de la planta restauradora, preferiblemente uno o más órganos reproductores masculinos ounoomás órganos reproductores femeninos de la misma, y/o semillas y/o embriones, de manera que cuando se cruza la planta restauradora con una planta con esterilidad femenina nuclear o con esterilidad masculina nuclear, se obtienen retoños con fertilidad femenina, fertilidad masculina híbridos. La secuencia de ADN extraña puede comprender asimismo al menos un primer ADN marcador que está bajoel control, y se une en su extremo, de un segundo promotor y está unido en su extremo 3 a señales de terminación de la transcripción adecuadas, incluyendo la señal de poliadenilación. El primer ADN marcador se encuentra preferiblemente en el mismo locus genético que el ADN restaurador de fertilidad, 4

5 en virtud de lo cual se produce el tercer ARN, proteína o polipéptido en al menos el tejido específico o células específicas de la planta restauradora de la fertilidad de manera que la planta se puede distinguir y/o separar fácilmente de otras plantas que no contienen el tercer ARN, proteína o polipéptido en el tejido específico o células específicas. Esto garantiza, con un alto grado de certidumbre, la segregación conjunta del ADN restaurador de fertilidad y el primer ADN marcador en el retoño de la planta. Preferiblemente, se transforma la célula de una planta (en particular una planta que pueda infectarse con Agrobacterium), de acuerdo con la presente invención, utilizando un vector que es un plásmido Ti desarmado que contiene la secuencia de ADN extraña y que es transportado por Agrobacterium. Esta transformación se puede llevar a cabo aplicando los procedimientos descritos por ejemplo en las publicaciones de patente europea y Los vectores de plásmido Ti preferibles contienen la secuencia de ADN extraña entre las secuencias frontera, o al menos está localizado a la izquierda de la secuencia de la frontera derecha del ADN-T del plásmido Ti. Naturalmente, se pueden utilizar otros tipos de vectores para transformar la célula vegetal, aplicando procedimientos como transferencia genética directa (tal como se describe, por ejemplo, en la publicación de patente europea ), transformación medida por polen (tal como se describe por ejemplo en la publicación de patente europea , publicación PCT WO8/0186 y publicación de patente europea ), transformación de protoplasto in vitro (tal como se describe por ejemplo en la patente EE.UU ), transformación mediada por virus de ARN vegetal (tal como se describe por ejemplo en la publicación de patente europea y patente EE.UU ) y transformación mediada por liposoma (tal como se describe por ejemplo en la patente EE.UU ). Preferiblemente, se obtiene una planta restauradora de la fertilidad según la invención transformando una célula vegetal con un vector de plásmido Ti desarmado que contiene la secuencia de ADN extraña con un ADN restaurador de fertilidad bajo el control de un primer promotor y, opcionalmente un primer ADN marcador bajo el control de un segundo promotor. El ADN marcador puede estar corriente arriba o corriente abajo del ADN restaurador de fertilidad en el vector de plásmido Ti, aunque, preferiblemente, los dos se encuentran en posición adyacente uno respecto a otro y están localizados entre las secuencias fronterizas o al menos, están localizados a la izquierda de la secuencia fronteriza derecha del vector de plásmido Ti, de manera que son transferidos juntos de forma apropiada al genoma nuclear de la célula vegetal. No obstante, si se desea, se puede transformar inicialmente la célula con la secuencia de ADN extraña que contiene el ADN restaurador de fertilidad y el primer promotor y transformarse posteriormente con el ADN marcador y el segundo promotor, insertado en el mismo locus genético en el genoma nuclear de la célula que el ADN restaurador de fertilidad, o se puede llevar a cabo la transformación al revés. Los vectores adecuados para este fin son los mismos que se han mencionado anteriormente para la transformación de células con la secuencia de ADN extraña. El vector preferible es el vector de plásmido Ti desarmado. La selección del ADN restaurador de fertilidad de la presente invención no es crítico, pero depende de la selección del ADN de esterilidad al que se debe la característica de esterilidad femenina o masculina que se va a restaurar, y debe corresponderse con éste. En particular, la producción o superproducción de la primera proteína o polipéptido codificada por el ADN restaurador de fertilidad tiene que neutralizar, bloquear, contrarrestar, superar o, si no, impedir la actividad específica de la segunda proteína o polipéptido que es una ribonucleasa codificada por el ADN de esterilidad en células de la flor, preferiblemente, células de al menos un órgano reproductor masculino o al menos un órgano reproductor femenino, o en células de semilla o en células de embrión de la planta restaurada. En las publicaciones de patente europea y , que se incorporan en el presente documento como referencia, se describen respectivamente ejemplos de ADN de esterilidad masculina y femenina a los que debe corresponder los ADN restauradores de la fertilidad de la presente invención, y cuya acción deben contrarrestar. Se puede seleccionar y aislar un ADN restaurador de fertilidad adecuado según el método convencional para superar los efectos del ADN de esterilidad en cualquiera de las células de una flor, en particular un órgano masculino o femenino, una semilla y/o un embrión, en el que el promotor de la esterilidad produce la expresión del ADN de esterilidad. Entre los ejemplos preferibles de ADN restauradores de fertilidad se incluyen: barstar que neutraliza la actividad de barnasa (que degrada moléculas de ARN por hidrolización del enlace detrás de cada radical guanina). Otros ejemplos más de ADN restauradores de fertilidad pueden ser combinaciones de uno o más de los diferentes ADN restauradores de la fertilidad que se han citado. El término extraño en relación con la secuencia de ADN extraña de la presente invención significa

6 que la secuencia de ADN extraña contiene un ADN restaurador de fertilidad extraño y/o un primer promotor extraño. El término extraño en relación con el ADN, como por ejemplo un ADN restaurador de fertilidad y un primer promotor, así como un primer ADN marcador, un segundo promotor y cualquier otro ADN de la secuencia de ADN extraña, significa que dicho ADN no se encuentra en el mismo entorno genómico de una célula vegetal, transformada con dicho ADN de acuerdo con la presente invención, que el ADN que se encuentra de forma natural en la célula de la planta, bacteria, animal, hongo, virus o similar, del que se origina dicho ADN. Esto implica, por ejemplo, que el ADN restaurador de fertilidad extraño o el primer ADN marcador puede ser: 1) un ADN nuclear de una planta de origen; 2) endógeno de la célula vegetal transformada (es decir, de una planta de origen con el mismo genotipo que la planta que se transforma); y 3) dentro de la misma unidad de transcripción que su propio promotor endógeno y señales de regulación de transcripción de extremo 3 (de la planta de origen) en la secuencia de ADN extraña de la presente invención de la célula vegetal transformada; pero 4) insertado en un lugar diferente del genoma nuclear de la célula vegetal transformada al que tenía en la planta de origen de manera que no está rodeado en la célula vegetal transformada por los genes que lo rodeaban de manera natural en la planta de origen. Un ADN restaurador de fertilidad extraño o un primer ADN marcador puede ser también, por ejemplo, 1) un ADN nuclear en una planta de origen; y 2) endógeno de la célula vegetal transformada; pero 3) en la misma unidad de transcripción que un promotor endógeno diferente (es decir no el mismo) y/o señales de regulación de transcripción de extremo 3 en una secuencia de ADN quimérica extraña de la presente invención en una célula vegetal transformada. Un ADN restaurador de fertilidad extraño o un primer ADN marcador puede ser también, por ejemplo, 1) un l/o nuclear en una planta de origen; y 2) endógeno de la célula vegetal transformada; pero 3) en la misma unidad de transcripción que un promotor heterólogo y/o señales de regulación de la transcripción de extremo 3 en una secuencia de ADN quimérica extraña de la presente invención en una célula vegetal transformada. Un ADN restaurador de fertilidad extraño o un primer ADN marcador puede ser también, por ejemplo, heterólogo para la célula vegetal transformada y en la misma unidad de transcripción que el promotor endógeno y/o señales de regulación de la transcripción 3 (v.g. del genoma nuclear de una planta con el mismo genotipo que la planta que se está transformando) en una secuencia de ADN quimérico extraña de la presente invención en una célula vegetal transformada. Un ejemplo de un ADN restaurador de fertilidad podría provenir del genoma nuclear de una planta con el mismo genotipo que la planta que se está transformando y codifica un inhibidor de una ribonucleasa, que es endógena de la planta que se está transformando, de manera que se superproduce la enzima en las plantas transformada para neutralizar la actividad de una ribonucleasa (es decir, una segunda proteína codificada por un ADN de esterilidad masculina o femenina) que podría afectar negativamente y de manera significativamente al metabolismo, funcionamiento y/o desarrollo de células de la flor, en particular, células de los órganos masculinos y femeninos, o células de la semilla o células embrionarias, en las que se expresa dicha enzima. Preferiblemente, cada ADN restaurador de fertilidad y primer ADN marcador es heterólogo para la célula vegetal que se transforma. Se entiende por heterólogo en relación con un ADN, como por ejemplo ADN restaurador de fertilidad, un primer o tercer promotor, un primer ADN marcador y cualquier otro ADN en la secuencia de ADN extraña de la presente invención, que dicho ADN no se encuentra de manera natural en el genoma nuclear de células de una planta con el mismo genotipo que la planta que se está transformando. Entre los ejemplos de ADN heterólogos se incluyen ADN de cloroplasto y mitocóndrico obtenidos de una planta con el mismo genotipo que la planta que se está transformando, aunque los ejemplos preferibles son ADN de cloroplasto, mitocóndrico y nuclear de plantas que tienen un genotipo diferente que la planta que se está transformando, ADNs de genomas animales y bacterianos, y ADNs cromosómicos y plasmídicos de genomas fúngicos y víricos. Se entiende por quimérico en relación con la secuencia de ADN extraña de la presente invención, que al menos uno de sus ADN restauradores de la fertilidad 1) no se encuentra de manera natural bajo el control de su primer promotor para uno de los ADN restauradores de fertilidad; y/o 2) no se encuentra de manera natural en el mismo locus genético que al menos uno de sus primeros ADN marcadores. Entre los ejemplos de secuencias de ADN quimérico extraño de la presente invención se incluyen: un ADN restaurador de fertilidad de origen bacteriano bajo el control de un primer promotor de origen vegetal; y un ADN restaurador de fertilidad de origen vegetal bajo el control de un primer promotor de origen vegetal; y en el mismo locus genético que el primer ADN marcador de origen bacteriano. Se entiende por flor el ser vivo vegetal que incluye todo el eje del brote, sépalos, pétalos, órganos reproductores masculinos (o estambres) y/o órganos reproductores femeninos (o carpelos) cuyo desarrollo total o parcial, atrasado o detenido podría prevenir el desarrollo y/o propagación de semillas viables a la flor o el desarrollo y/o propagación de sus gametos masculinos; se entiende por órgano masculino u órgano reproductor masculino el órgano completo de una flor que está relacionado con la producción del gameto masculino, así como una o más de sus partes individuales, como su antera, polen y filamento; 6

7 y por órgano femenino u órgano reproductor femenino, el órgano completo de una flor que está relacionado con la producción del gameto femenino y/o las semillas viables y/o embriones viables, así como una o más de sus partes individuales como su ovario, óvulo, estilo, estigma, corola, disco, septo, cáliz y placenta. Se entiende que embrión incluye todo el embrión de la planta, así como una o más de sus partes individuales como el eje del embrión y los cotiledones del embrión. Para que el ADN restaurador de fertilidad se expresa en al menos las células específicas de una planta con la fertilidad restaurada en la que se expresa el ADN de esterilidad, es preferible que el primer promotor, que controla la expresión del ADN restaurador de fertilidad, sea un promotor capaz de dirigir la expresión genética a al menos las mismas células de la planta con la fertilidad restaurada (es decir, las células de la flor específicas, preferiblemente células de los órganos masculinos o femeninos, o células de la semilla o células embrionarias), en las que se expresa selectivamente el ADN de esterilidad bajo el control del promotor de la esterilidad. Dicho primer promotor puede ser un promotor endógeno o un promotor exógeno y puede provenir del genoma nuclear o del genoma mitocrondria o de cloroplasto de una célula vegetal. En cualquier caso, el primer promotor es extraño para el genoma nuclear de la célula vegetal que se está transformando. El primer promotor puede ser un promotor constitutivo pero puede ser también el mismo promotor selectivo que el promotor de esterilidad. Preferiblemente, el primer promotor produce la restauración de la fertilidad a través de la producción de cantidades al menos suficientes del primer ARN, proteína o polipéptido restaurador de fertilidad de forma selectiva en la mismas células específicas de flor, semilla o embrión, en particular, en las mismas células de la flor específicas, que aquellas en las que se expresa el ADN de esterilidad. El primer promotor de la presente invención se puede seleccionar y asilar según el modo conocido desde una especie vegetal, por ejemplo, tal como se describe en la publicación de patente europea , que se incorpora aquí como referencia, en la que se describe el promotor de esterilidad masculina que dirige la expresión de un ADN de esterilidad de forma selectiva a las células de los estambres (v.g., antera) de una planta y que es eficaz para prevenir la expresión del ADN de esterilidad en otras partes de la planta; y la publicación de patente europea , que también se incorpora aquí como referencia, en la que se describe un promotor de la esterilidad femenina que dirige la expresión del ADN de esterilidad de forma selectiva a las células de las flores, en particular las células de un órgano femenino (v.g., pistilo), o las células de las semillas o las células embrionarias de una planta y que es eficaz para prevenir la expresión del ADN de esterilidad en otras partes de la planta. Por ejemplo, se puede identificar un primer promotor específico de tejido o de un órgano endógeno adecuado y aislarlo de la planta: 1. buscando un marn que esté presente solamente en la planta durante el desarrollo de sus flores, semillas o embriones, preferiblemente, sus anteras, polen, filamentos, ovarios, óvulos, estilo, estigma, placenta, cáliz, escultelo, septo, envoltura de la semilla, endosperma o cotiledones embrionarios; 2. aislando este marn específico; 3. preparando un cadn para este marn específico; 4. utilizando este cadn como sonda para identificar las regiones del genoma de la planta que contienen ADN que codifica el marn específico; y a continuación. identificando la porción del genoma de la planta que está corriente arriba (es decir, ) del ADN que codifica el marn específico y que contiene el promotor de este ADN. Los genes controlados por estos primeros promotores se pueden utilizar posteriormente como sondas, como en el paso 4 mencionado. En condiciones de hibridación, dicha sonda se hibridará con el ADN que codifica un marn específico en una mezcla de secuencias de ADN del genoma de otras especie vegetal (Maniatis y cols. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory). A continuación, como en el paso mencionado, se puede identificar un primer promotor específico para otra especie vegetal. Entre los ejemplos de primeros promotores y promotores de la esterilidad específicos para un órgano masculino se incluyen: el promotor PTA29, el promotor PTA26 y el promotor PTA13, tal como se describe en la publicación de patente europea , que han sido aislados del tabaco y son promotores específicos del tapete; así como cualquier promotor de un gen que codifique un marn específico del tapete hibridable con los genes TA29, TA26 ó TA13 de la publicación de patente europea , de los que se han aislado los genes PTA29, PTA26 y PTA13. Entre los ejemplos de primeros promotores y promotores de esterilidad específicos de los órganos femeninos se incluyen promotores específicos del estilo y/o el estigma, como por ejemplo PSTMG07, PSTMG08, PSTMG4B12 y PSTMG3C9, y el promotor específico del óvulo que corresponde al clon de cadn pmon98, tal como se describe en la publicación 7

8 de patente europea ; así como un promotor de un gen que codifica i) un estilo - estigma específico o ii) un marn específico de óvulo hibridable respectivamente con i) un gen específico de estilo estigma de tipo STMG o ii) el clon de cadn pmon98 de la publicación de patente europea Si está presentemás de un ADN de esterilidad nuclear en la planta estéril transgénica que se va a cruzar con la planta restauradora de la fertilidad transgénica de la presente invención, es posible que la planta restauradora necesite tener insertado en su genoma nuclear más de un ADN restaurador de fertilidad de la presente invención, que se corresponda en número con al menos el número de ADN de esterilidad del genoma nuclear de la planta estéril. Todos los ADN restauradores de la fertilidad pueden estar bajo el control de un primer promotor único, aunque preferiblemente, cada ADN restaurador de fertilidad está bajo el control de su propio primer promotor individual que dirigirá la expresión del primer ARN, proteína o polipéptido al menos a aquellas células en las que los promotores de esterilidad hacen que los ADN de esterilidad expresen el segundo ARN, proteína o polipéptido. Cada ADN restaurador de fertilidad está contiguo a su primer promotor y todos los ADN restauradores de la fertilidad y su primer promotor están preferiblemente contiguos unos a otros en las secuencias de ADN extrañas de la presente invención y en cualquier vector utilizado para transformar células vegetales con dichas secuencias de ADN extrañas. No obstante, no es necesario que los ADN restauradores de la fertilidad estén adyacentes entre sí en la secuencia de ADN extraña y, en algunos casos, pueden estar insertados en el genoma nuclear de la planta restauradora a través de eventos de transformación independientes. La selección del primer ADN marcador de la presente invención tampoco es crítico. Se puede seleccionar y asilar un primer ADN marcador adecuado según el modo conocido, de manera que codifique el tercer ARN, proteína o polipéptido que permita que las plantas que expresan el primer ADN marcador se distingan fácilmente y se puedan separar de plantas que no expresan dicho primer ADN marcador. En muchos casos, este primer ADN marcador codifica el mismo ARN proteína o polipéptido, ya que el segundo ADN marcador codifica en la planta con esterilidad masculina o femenina nuclear, la fertilidad que ha de ser restaurada de acuerdo con la presente invención. Entre los ejemplos de primer ADN marcador se incluyen los ADN marcadores de los genomas nucleares de plantas con esterilidad masculina o femenina nuclear descritas en las publicaciones de patente europeas y , que codifican proteínas o polipéptidos que: proporcionan un color distinguible a las células vegetales, como por ejemplo el gen A1 que codifica dihidroquercetin-4-reductasa (Meyer y cols. (1987) Nature 3, ) y el gen glucuronidasa (Jefferson y cols. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. ( PNAS ) 83, 8447); proporcionan una característica morfológica específica a una planta, como por ejemplo un crecimiento enano o una forma diferente de las hojas; confieren a la planta tolerancia a las condiciones extremas, como por ejemplo la que viene dada por el gen que codifica superóxido dismutasa, tal como se ha descrito en la solicitud de patente europea , que es la aplicación prioritaria que se reivindica en la publicación de patente europea ; confiere resistencia a las enfermedades y las plagas a la planta, como por ejemplo la que viene dada por un gen que codifica una endotoxina de Bacillus thuringiensis que confiere resistencia a los insectos, tal como se describe en la publicación de patente europea ; o confiere a la planta resistencia a las bacterias, como la que viene dada por el péptido bacteriano descrito en la publicación de patente europea Los primeros ADN marcadores codifican terceras proteínas o polipéptidos que inhiben o neutralizan la actividad de herbicidas como por ejemplo: el gen sfr y el gen sfrv que codifica enzimas que confieren resistencia a los inhibidores de glutamina sintetasa, como por ejemplo Bialaphos y fosfinotricina, tal como se describe en la publicación de patente europea ; y genes que codifican enzimas diana modificadas para determinados herbicidas que tienen una menor afinidad a los herbicidas que las enzimas endógenas producidas de forma natural, como por ejemplo una glutamina sintetasa modificada como diana para fosfinotricina, tal como se describe en la publicación de patente europea y una - enolpiruvilshikimato-3- fosfato sintasa modificada como diana para glufosato, tal como se describe en la publicación de patente europea Otros primeros ADN marcadores codifican terceras proteínas que neutralizan la acción del herbicida bromoxynil (Stalker y cols. (1988) en: Genetic Improvements of Agriculturally important Crops. Ed: R.T. Fraley, N.M. Frey and J. Schell. Cold Spring Harbor Laboratories) o el herbicida sulfonilurea (Lee y cols. (1988) EMBO J. 7, ) o el herbicida 2,4 D (descrito en el Segundo Simposium Internacional de Biología Molecular de las Plantas, Jerusalem, 13-18, noviembre 1988). El segundo promotor de la presente invención, que controla el primer ADN marcador, se puede seleccionar y aislar también según el modo conocido, de manera que el primer ADN marcador se exprese, o bien de manera selectiva en uno o mástejidos específicos o células específicas, o bien de forma constitutiva en toda la planta, según se desee dependiendo de la naturaleza del tercer ARN, proteína o polipéptido. En muchos casos, el segundo promotor es el mismo que el tercer promotor que controla el segundo ADN 8

9 marcador en la planta con esterilidad masculina o femenina, cuya fertilidad ha ser restaurada con arreglo a la presente invención. Por ejemplo, si el primer ADN marcador codifica resistencia a herbicida, puede resultar útil tener un primer ADN marcador expresado en todas las células de la planta, utilizando un segundo promotor constitutivo fuerte como por ejemplo un promotor 3S (Odell y cols. (198) Nature 313, 8-812), un promotor 3S 3 (Hull and Howell (1987) Virology 86, ), el promotor del gen de la nopalina sintetasa ( PNOS ) del plásmido Ti (Herrera-Estrella (1983) Nature 3, 9-213) o el promotor del gen de la octopina sintasa ( POCS [De Greve y cols. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), ]). Si el primer ADN marcador codifica una proteína que confiere resistencia a enfermedad, puede resultar útil tener el primer ADN marcador expresado selectivamente en tejido dañado utilizando, por ejemplo, un segundo promotor que sea un promotor TR, como por ejemplo el promotor TR1 ótr2 del plásmido Ti (Velten y cols. (1984) EMBO J. 3, ). Si el primer ADN marcador codifica una resistencia a herbicidas, puede ser útil tener el primer ADN marcador expresado selectivamente en el tejido verde utilizando como segundo promotor, por ejemplo, el promotor del gen que codifica la pequeña subunidad de Rubisco (publicación de patente europea ). Si el primer ADN marcador codifica un pigmento, puede ser útil seleccionar el segundo promotor para que el primer ADN marcador esté expresado en células específicas, como por ejemplo células de pétalos, células de hojas o células de semillas, preferiblemente en la capa exterior de la envoltura de la semilla. Se puede identificar y aislar según un modo conocido un segundo promotor específico de tejido, adecuado para inclusión en la secuencia de ADN extraña de la presente invención en una planta restauradora o una planta restaurada según la presente invención, en virtud de lo cual se puede distinguir fácilmente la planta como portadora del primer ADN marcador bajo el control del segundo promotor. Esto se puede llevar a cabo: 1. buscando un marn que esté presente solamente en la planta durante el desarrollo de un tejido específico, como por ejemplo, los pétalos, las hojas o las semillas; 2. aislando este marn específico de tejido; 3. preparando un cadn a partir de este marn específico de tejido; 4. utilizando este cadn como sonda para identificar las regiones del genoma de la planta que contienen ADN que codifica el marn específico de tejido; y a continuación. identificando la porción del genoma de la planta que está corriente arriba del ADN que codifica el marn específico de tejido y que contiene el promotor para dicho ADN. Si está presentemás de un primer ADN marcador en la secuencia de ADN extraña de la presente invención, todos los primeros ADN marcadores pueden estar bajo el control de un solo segundo promotor, pero preferiblemente, cada primer ADN marcador está bajo el control de su propio segundo marcador individual. Más preferiblemente, cada primer ADN marcador está bajo el control de su propio segundo promotor y codifica un tercer ARN, proteína o polipéptido diferente, proporcionando diferentes características distinguibles a la planta transformada. En cualquier caso, el (los) primer(os) ADN marcador(e)s y segundo(s) promotor(es) deberán estar contiguos entre sí y con uno o más ADN restaurador(es) de la fertilidad en la secuencia de ADN extraña de la presente invención y en cualquiera de los vectores utilizados para transformar células vegetales con la secuencia de ADN extraña. Por lo general es preferible que el primer ADN, proteína o polipéptido codificado por el ADN restaurador de fertilidad prevenga sustancialmente la actividad del segundo ARN, proteína o polipéptido codificado por el ADN de esterilidad, en el citoplasma o el núcleo de las células de la planta en las que se expresa el ADN de esterilidad. No obstante, cuando se desea el transporte de la primera proteína o polipéptido y/o la tercera proteína o polipéptido desde el citoplasma a los cloroplastos o mitocondrias de las células de plantas transformadas, la secuencia de ADN extraña puede incluir además un ADN extraño adicional que codifica un péptido de tránsito. El ADN adicional se encuentra entre el ADN restaurador de fertilidad y el primer promotor cuando se va a transportar así la primera proteína o polipéptido, y se encuentra entre el primer ADN marcador y el segundo promotor cuando se va a transportar así la tercera proteína o polipéptido. Se entiende por péptido de tránsito un fragmento de polipéptido que está asociado normalmente con una proteína o subunidad de proteína de cloroplasto o mitocondria y que se produce en una célula como proteína precursora codificada por el ADN nuclear de la célula. El péptido de tránsito es responsable del proceso de translocación de la proteína o subunidad de cloroplasto o mitocondria codificada en el núcleo al cloroplasto o mitocondria y, durante dicho proceso, se separa el péptido de tránsito o se elimina proteolíticamente de la proteína o subunidad de cloroplasto o mitocondria. Se pueden proporcionar uno o más de dichos ADN adicionales en la secuencia de ADN extraña de la invención para transportar una o más primeras o terceras proteínas o polipéptidos, tal como se 9

10 describe de forma general en la publicación de patente europea y la publicación de patente europea (supra) y en: Van den Broeck y cols. (198) Nature 313, ; Schatz (1987) Eur. J. of Bioch. 16, 1-6; y Boutry y cols. (1987) Nature 328, Un ejemplo de un péptido de tránsito adecuado para el tranporte a citoplastos es el péptido de tránsito de la pequeña subunidad de la enzima RUBP carboxilasa (publicación de patente europea ) y un ejemplo de un péptido de tránsito para el transporte a mitocondria es el péptido de tránsito de la enzima Mn superoxido dismutasa (publicación de patente europea ). En la secuencia de ADN extraña de la presente invención, se pueden seleccionar señales de terminación de la transcripción 3 entre aquellas que son capaces de proporcionar una terminación de transcripción correcta y poliadenilación de marn en células vegetales. Las señales de terminación de la transcripción pueden ser las naturales del gen o ADN extraño que se va a transcribir o pueden ser extrañas o heterólogas. Entre los ejemplos de señales de terminación de transcripción heterólogas se incluyen se incluyen las del gen de la octopina sintasa (Gielen y cols. (1984) EMBO J. 3, 83-84) y el gen7 T-ADN (Velten y Schell (198) Nucleic Acids Research ( NAR ) 13, ). Asimismo, de acuerdo con la presente invención, se puede utilizar un cultivo de células vegetales que contengan la secuencia de ADN extraña de la presente invención, para regenerar las plantasrestauradoras de la fertilidad dominantes homocigóticas realizando la transformación necesaria: en un cultivo celular haploide (Chuong and Beversdof (198) Plant Sci. 39, ) y duplicando después el número de cromosomas a través de técnicas muy conocidas (v.g., utilizando conchicina); o alternativamente, en un cultivo celular diploide y cultivando después anteras de plantas regeneradas para producir progenie haploide que se puede hacer diploide posteriormente. Véase: Plant Tissue and Cell Culture, Plant Biology 3, A.R. Liss, Inc. N.Y. (1987). De esta forma, la secuencia de ADN extraña se encontrará enlaforma homocigótica en el genoma nuclear de cada una de las células vegetales así transformadas del cultivo. Esto es preferible para un cultivo de células vegetales que contenga un ADN restaurador de fertilidad bajo el control de un primer promotor que dirige al expresión genética en un estadio determinado del desarrollo de: i) los gametos masculinos de la planta, como por ejemplo el polen, sobre todo después de la meiosis, ii) los gametos femeninos de la planta, como por ejemplo los óvulos, sobre todo después de la meiosis, o iii) células derivadas de los gametos masculinos o femeninos, como por ejemplo células de semilla o embrionarias, de manera que el ADN restaurador de fertilidad esté presente y se pueda expresar en todos los gametos masculinos o femeninos o las células de la planta derivados de ellos. Asimismo, de acuerdo con la presente invención, se proporcionan procesos para la producción de semillas híbridas que pueden crecer para transformarse en plantas con la fertilidad restaurada. Uno de dichos procesos consiste en el cruce de una planta de fertilidad femenina y esterilidad masculina nuclear que incluye al menos un segundo ADN marcador bajo el control de al menos un tercer promotor, con una planta restauradora de la fertilidad masculina nuclear homocigótica que incluye al menos un ADN restaurador de fertilidad masculina nuclear bajo el control de al menos un primer promotor pero sin el primer ADN marcador que sea igual al segundo ADN marcador. En este proceso, se siembran las plantas con fertilidad masculina y esterilidad masculina al azar y, tras la polinización, se utiliza el marcador selecccionable, codificado por un segundo ADN marcador, para eliminar las plantas restauradoras de la fertilidad, para asegurar que sólo se recogen semillas de plantas con esterilidad masculina. Con ello se garantiza que todas las semillas recogidas son híbridos y fértiles. Otro proceso consiste en el cruce de: una planta restauradora de la fertilidad femenina y con esterilidad masculina nuclear que incluye un primer ADN marcador nuclear bajo el control de un segundo promotor y un ADN restaurador de fertilidad femenina nuclear bajo el control de un primer promotor en forma homocigótica, con una planta restauradora de esterilidad femenina y fertilidad masculina nuclear que incluye al menos el mismo ADN marcador nuclear bajo el control de un segundo promotor y un ADN restaurador de fertilidad masculino nuclear bajo el control de un primer promotor en una forma homocigótica. Las plantas progenitoras tanto con esterilidad masculina como con fertilidad masculina se pueden cultivar en una población sustancialmente aleatoria, de manera que aumenta la posibilidad de una polinización cruzada, sin necesidad de patrones de plantación exactos y, utilizando la característica codificada por el primer ADN marcador, se pueden recoger semillas híbridas fértiles al 0 %. Preferiblemente, en ambos procesos, el primer ADN marcador está bajo el control de un segundo promotor constitutivo y codifica una tercera proteína o polipéptido que hace que la planta estéril sea resistente a un herbicida determinado. A continuación, se pueden destruir los genotipos no deseados antes de la polinización cruzada, empleando un herbicida determinado. Un proceso de acuerdo con la presente invención para cruzar 1) plantas restauradoras de la fertilidad que contienen ADN restaurador de fertilidad integrado de manera estable en su genoma nuclear y transmisible a través de generaciones como un alelo dominante de acuerdo con la invención con 2) plantas con esterilidad masculina o femenina que contienen un ADN de esterilidad, preferiblemente tanto un ADN

11 de esterilidad como un segundo ADN marcador, integrados de manera estable en su genoma nuclear y transmisible a través de generaciones como alelos dominantes de acuerdo con las publicaciones de patente europeas y proporciona una alternativa, así como varias ventajas con respecto a los sistemas utilizados actualmente para reproducir y obtener cultivos híbridos, tal como se describe a continuación: 1. Para cultivos que no se polinizan fácilmente por polinización cruzada, para los cuales la cosecha valiosa desde el punto de vista económico es la semilla y que tienen velocidades de multiplicación bajas, como por ejemplo cereales (v.g., trigo, cebada y avena), arroz, algodón y muchas legumbres (v.g., soja y guisantes), el proceso de la presente invención ofrece la posibilidad de producir retoños fértiles híbridos al 0 %, garantizando de este modo un conjunto de semillas alto y un rendimiento normal. Un ejemplo de una estrategia típica para producir plantas híbridas utilizando como plantas progenitoras plantas progenitoras con esterilidad femenina y esterilidad masculina y un restaurador de sus respectivas esterilidades, puede incluir las siguientes etapas (donde FH1 significa esterilidad femenina asociada a resistencia a herbicida 1, FR significa restaurador de la esterilidad femenina, M1H1 significa esterilidad masculina 1 asociada a resistencia a herbicidas 1, M2H2 significa esterilidad masculina 2 asociada a resistencia a herbicida 2, RM1 significa restaurador de la esterilidad masculina 1, A significa líneas progenitoras femeninas y B significa líneas progenitoras masculinas): A. Desarrollo de planta progenitora femenina A 1Aa) Transformación de la planta A con un ADN restaurador de fertilidad según la presente invención que codifica un primer ARN, proteína o polipéptido (que neutraliza específicamente el producto de expresión del ADN de esterilidad femenina en el progenitor masculino) y que está bajo el control de un primer promotor que dirige la expresión genética a al menos las mismas células que aquellas en las que ha de expresarse el ADN de esterilidad femenina en la planta masculina. Esto da lugar aa RF/rf. 1Ab) Autopolinización de A RF/rf, dando lugar a un 2 % de plantas A RF/rf. 1Ac) Transformación de A RF/rf con una secuencia de ADN quimérico que incluye un ADN de esterilidad masculina 1 bajo el control de un promotor específico de órgano masculino y un ADN marcador que confiere resistencia a un herbicida 1. Esto da lugar a la planta de esterilidad masculina A RF/RF ;M1H1/mh. 1Ad) Multiplicación de la planta de esterilidad masculina cruzando: A RF/RF ;M1H1/nh RF/RF ;mh/mh xa para dar retoños que consisten en: 0 % de A RF/RF ;M1H1/mh : esterilidad masculina 1; resistente a herbicida 1 y 0 % de A RF/RF ;mh/mh : fertilidad masculina, sensible a herbicidas. Se siembra esta mezcla en sucesivas generaciones de escala superior con respecto al progenitor femenino, y se utiliza el herbicida 1 en filas o bloques de filas alternas para crear reservas progenitoras femeninas puras. Las filas o bloques de fila en las que no se aplica el herbicida se utilizan como fuente de polen. Se recoge solamente la semilla de las filas o bloques de filas tratados con herbicida para constituir la siguiente generación. B. Desarrollo de la planta progenitora masculina B Para la producción económica de B, la línea progenitora de esterilidad femenina requiere el uso de dos ADN de esterilidad diferentes. El primero es un ADN de esterilidad femenina bajo el control de un promotor que dirige la expresión genética de forma selectiva a las células del órgano femenino de la planta yestá asociado a un ADN marcador que confiere resistencia a herbicida 1. El segundo es un ADN de esterilidad masculina (diferente del ADN de esterilidad masculina 1 y denominado ADN de esterilidad masculina 2 ), bajo el control de un promotor que dirige la expresión genética de manera selectiva a las células de los órganos masculinos de la planta y está asociado a un segundo ADN marcador que confiere resistencia a herbicida 2. 1Ba) Transformación de la planta B con una secuencia de ADN extraña de la invención que codifica un primer ARN, proteína o polipéptido que neutraliza específicamente la actividad del ADN de esterilidad masculina 1 expresado en el progenitor femenino y que está bajo el control de un primer promotor que dirige la expresión genética a al menos las mismas células de los órganos masculinos en las que se expresa el ADN de esterilidad masculina 1 de la planta progenitora femenina. Esto da lugar a B RM1/rm. 11

12 1Bb) Autopolinización de B RM1/rm, dando lugar a un 2 % de B RM1/RM Bc) (1) Transformación de B BRM1/RM1 con una secuencia de ADN quimérico que incluye el ADN de esterilidad femenina bajo el control de un promotor que dirige la expresión genética de forma selectiva a las células de los órganos femeninos de la planta y un ADN marcador que confiere resistencia al herbicida 1. Esto da lugar a una planta de esterilidad femenina B RM1/RM1;FH1/fh. (2) Transformación de B RM1/RM1 con una secuencia de ADN quimérico que incluye el ADN de esterilidad masculina 2 bajo el control de un promotor específico de órgano masculino y un ADN marcador que confiere resistencia a herbicida 2. Esto da lugar a la planta de esterilidad masculina B BM1/RM1;M2H2/mh. 1Bd) (1) Multiplicación de la planta de esterilidad masculina de 1Bc) (2) cruzando: B BM1/RM1;M2H2/mh xb BM1/RM1;mh/mh dando retoños que consisten en: 0 % de B BM1/RM1;M2H2/mh : esterilidad masculina, resistentes a herbicidas y 0 % de B BM1/RM1;mh/mh : fertilidad masculina, sensible a herbicidas. (2) Multiplicación de la planta de esterilidad femenina de 1Bc) (1) cruzando: B RM1/RM1;M2H2/m;fh/fh x B BM1/RM1;mh/mh:FH1/fh que se plantan en filas separadas, dando lugar a los siguientes genotipos en las filas de esterilidad masculina: 2 % B BM1/RM1;M2H2/m;FH1/fh :estéril y resistente a herbicidas 1 y 2, 2 % B BM1/RM1;mh/mh;FH1/fh : esterilidad femenina y resistente a herbicida 1, 2 % B BM1/RM1;M2H2/mh;fh/fh : esterilidad masculina y resistente a herbicida 2, y 2 % B RM1/RM1;mh/mh;fh/f h : fertilidad y sensible a herbicidas. 1B3) Esta mezcla se puede volver a utilizar como progenitor masculino (B RM1/RM1;mh/mh;FH1/fh )en cruces de multiplicación posteriores, en virtud de lo cual el rociado de un herbicida 1 en cada generación elimina las plantas de fertilidad femenina y mantiene así lalínea progenitora masculina. Esta mezcla se plantará en filas o bloques de filas alternas con la mezcla obtenida en 1Bd (1), tratándose dicha mezcla con el herbicida 2 para eliminar las plantas fértiles masculinas. Alternativamente, se puede cultivar la mezcla obtenida en 1Bd) (2) como tal y tratarse filas alternas con el herbicida 1 o con el herbicida 2. En tales circunstancias, no es necesaria la etapa 1 Bd) (1). C. Producción de semilla híbrida AB 4 0 Se siembran al azar las mezclas obtenidas en las etapas 1Ad) y 1Be). Antes de que se produzca la polinización cruzada, se pulverizan con el herbicida 1 para eliminar todos los genotipos no deseados. Tiene lugar la polinización cruzada con: A RF/RF ;rm/rm;m1h1/mh;fh/fh xb RM1/RM1/rf/rf;mh/mh;FH1/hf dando lugar a: 2 % AB RF/rf;M1H1/mh;rm/RM1;FH1/fh 2 % AB RF/rf;M1H1/mh;rm/RM1;fh/fh 2 % AB RF/rf;mh/mh;rm/RM1;FH1/fh 2 % AB RF/rf;mh/mh;rm/RM1;fh/fh que constituyen semilla híbrida fértil al 0 %. 2. Dependiendo de las características especiales del cultivo que se reproduce, se puede simplificar la estrategia general que se ha expuesto. Entre dichas características especiales se incluyen: (2.1) Si el cultivo experimenta una polinización cruzada razonable o buena a través de insectos, se puede reducir la proporción relativa de la línea progenitora B en la mezcla sin que ello afecte al rendimiento del cultivo (v.g., algodón, legumbres como Pisum, alfalfa, colza de semilla oleoginosa ymaíz). Alternativamente, se puede aplicar un esquema de reproducción mucho más simplificado para un cultivo que implica un progenitor femenino al que se le ha dado esterilidad masculina y resistencia a herbicida y un progenitor masculino portador del gen restaurador de fertilidad para la esterilidad masculina. 12

13 2 Esto permitirá la siguiente estrategia: Cruce: A MH/mh xb RM/RM cultivado al azar o en filas de cultivos que no florecen sincrónicamente. Tratamiento con herbicidas tras la polinización cuando se siembran aleatoriamente. Rendimiento: 0 % AB MH/mh;RM/rm Y0%AB mh/mh;rm/rm, que constituye retoños híbridos fértiles al 0 %. (2.2) En el caso de que el retoño F2 represente el producto de semilla comercial (v.g., algodón), se puede aplicar la siguiente variante de estrategia: a) Producción por transformación de plantas con esterilidad masculina de la línea progenitora A, para dar A M/m;r/r ; b) Producción mediante 2 eventos de transformación independientes de plantas restauradoras de fertilidad portadoras de dos loci genéticos independientes de su genoma nuclear del gen restaurador de fertilidad cuyo producto neutraliza de manera específica la actividad del gen de esterilidad masculina en la planta de esterilidad masculina de a) y obtención por autopolinización de ambos genes restauradores en forma homocigótica, para dar B m/m;r1;r1;r2/r2 c) Cruce de A M/m;r/r xb m/m;r1/r1;r2/r2 y Rendimiento 0 % AB M/m;R1/r;R2/r y0%ab m/m;r1/r;r2/r que constituyen retoños fértiles híbridos al 0 %. d) Autopolinización de la mezcla obtenida en c). La mitad de los retoños se representan en la tabla 1, a continuación, solamente 1 de un total de 64 plantas fue estéril (indicada con un * en la tabla 1), y todas las demás fueron fértiles. Este resultado convierte a este proceso en económicamente valioso. TABLA 1 AB/AB sr1r2 sr1r2 Sr1R2 sr1r SR1R2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 SR1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 Sr1R2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 Sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 sr1r2/sr1r2 (2.3) Si el ADN de esterilidad masculina se une a otro ADN marcador distinto al que codifica resistencia a herbicidas 2, v.g., un gen de color, las plantas portadoras de este ADN de esterilidad masculina podrían ser eliminadas fácilmente sin dañar a las demás plantas. Alternativamente, el ADN de esterilidad masculina 2 se podría introducir sin ADN marcador seleccionable. La eliminación de plantas portadoras del ADN de esterilidad masculina 2 podría realizarse por selección manual, debiéndose realizar únicamente a pequeña escala (véase (1) Bd), anterior). (2.4) Si el tejido de las plantas progenitoras que se van a transformar está constituido de material haplido, esto podría reducir considerablemente la posterior reproducción, presentándose los genes dominantes que codifican esterilidad en forma homocigótica. (2.) Si el valor de la semilla, o el coste de la mano de obra, permite la eliminación manual de los genotipos no deseados, al menos hasta las últimas etapas antes de la producción híbrida, se podría simplificar el sistema general. 3. Otro ejemplo de estrategia de reproducción en el que se utiliza esterilidad masculina y femenina en combinación con el sistema restaurador de fertilidad de la invención incluiría las siguientes etapas: 13

14 3A. Desarrollo de la línea progenitora femenina A Aa) Transformación de la línea A con la secuencia de ADN extraña que incluye el ADN restaurador de fertilidad de la invención que: codifica un primer ARN, proteína o polipéptido que neutraliza de manera específica la actividad del producto de un ADN de esterilidad femenina expresado en el progenitor masculino; se encuentra bajo el control de un primer promotor que dirige la expresión del ADN restaurador de la fertilidad a al menos las mismas células de los órganos femeninos que aquellas en las que se expresa el ADN de esterilidad femenina del progenitor masculino; y está adyacente al primer ADN marcador que codifica resistencia al herbicida 2. Esto da lugar a A RF H2/rfh. Transformación también, en paralelo, de la línea A con una secuencia de ADN que incluye un ADN de esterilidad masculina que está bajo el control de un promotor específico de órgano masculino; y que está adyacente a un segundo ADN marcador que codifica una resistencia a herbicida diferente (es decir, al herbicida 1) de la codificada por el primer ADN marcador. Esto da lugar a A MH1/mh 3Ab) Cruce de A RF H2/rfh;MH1/mh, dando lugar a RF H2/rfh;MH1/mh 2 % de A RF H2/rfh;mh/mh 2 % de A 2 % de A rfh/rfh;mh1/mh 2 % de A rfh/rfh;mh/mh RF H2/rfh;MH1/mh Pulverizado de herbicidas 1 y 2, seleccionando A 3Ac) Autopolinización de A RF H2/rfh RF H2/rfh xa dando lugar a 2 % de A RF H2/F RH2, que puede mantenerse por auto-polinización. 3Ad) Cruce de A RF H2/RF H2;mh/mh RF H2/rfh;MH1/mh xa Esto da lugar a: RF H2/RF H2;MH1/mh 2 % de A RF H2/RF H2;mh/mh 2 % de A RF H2/rfh;MH1/mh 2 % de A RF H2/rfh;mh/mh 2 % de A en virtud de lo cual, se pueden seleccionar las planta de esterilidad masculina, que tienen el ADN restaurador de fertilidad en forma homocigótica, por pulverización con el herbicida 1 y por cruce de ensayo con la línea A progenitora. 3Ae) Mantenimiento de la línea progenitora femenina A por cruce de: A RF H2/RF H2;MH1/mh RF H2/RF H2;mh/mh xa B. Desarrollo de la línea progenitora masculina B 3Ba) Transformación de la línea B con una secuencia de ADN extraña que incluye un ADN restaurador de fertilidad según la invención que: codifica un primer ARN, proteína o polipéptido que neutraliza de manera específica la actividad del producto de un ADN de esterilidad masculina expresado en el progenitor femenino; se encuentra bajo el control de un primer promotor que dirige la expresión del ADN restaurador de fertilidad a al menos las mismas células del órgano masculino que aquellas en las que está expresado el ADN de esterilidad masculina; y está adyacenteaunprimeradn marcadorquecodificaresistenciaaherbicida2.estodalugarab RMH2/rmh. Transformación, en paralelo, también de la línea B con una secuencia de ADN que incluye ADN de esterilidad femenina que: está bajo el control de un promotor específico de órgano femenino; y está adyacente a un segundo ADN marcador que codifica resistencia al herbicida 1. Esto da lugar ab FH1/fh. Bb) Cruce de B RMH2/rmh;fh/fh xb rmh/rmh;fh1/fh, que da lugar a: 2 % de B RMH2/rmh;FH1/fh, 2 % de B RMH2/rmh;fh/fh, 14

15 % de B rmh/rmh;fh1/fh, 2 % de B rmh/rmh;fh/fh, Aislamiento de B RMH2/rmh;FH1/fh por pulverizado con herbicidas 1 y 2. 3Bc) Autopolinización de B RMH2/rmh xb RMH2/rmh, para dar lugar a 2 % de B RMH2/RMH2,que se puede mantener por autopolinización. 3Bb) Cruce de B RMH2/RMH2 xb RMH2/rmh;FH1/fh dando lugar a 2 % de B RMH2/RMH2;FH1/fh, 2 % de B RMH2/RMH2;fh/fh, 2 % de B RMH2/rmh;FH1/fh, 2 % de B RMH2/rmh;fh/fh, en virtud de lo cual se seleccionan las plantas de esterilidad femenina que tienen el ADN restaurador de fertilidad en forma homocigótica pulverizando el herbicida 1 y por cruce de ensayo con la línea B progenitora. 3Be) Mantenimiento de la línea progenitora masculina B por cruce de: B RMH2/RMH2;fh/fh xb RMH2/RMH2;FH1/fh. C. Procedimiento alternativo para el desarrollo de planta progenitora masculina o femenina (A o B se designan ambos con C). 3Ca) Transformación de la línea C con una secuencia de ADN extraña que incluye un ADN restaurador de fertilidad según la invención que codifica un primer ARN, proteína o polipéptido que neutraliza de manera específica la actividad del producto de un ADN de esterilidad expresado en el otro progenitor; se encuentra bajo el control de un primer promotor que dirige la expresión del ADN restaurador de fertilidad a al menos las células en las que se expresa el ADN de esterilidad del otro progenitor; y está adyacente al primer ADN marcador que codifica resistencia a herbicida 2. Esto da lugar a C RH2/rh. 3Cb) Autopolinización de C RH2/rh xc RH2/rh, produciendo un 2 % de C RH2/RH2 que se puede mantener por autopolinización. 3Cc) Transformación de C RH2/RH2 con una secuencia de ADN que incluye un ADN de esterilidad que está: bajo el control de un promotor específico de órgano masculino o femenino y está adyacente a un segundo ADN marcador que codifica resistencia al herbicida 1. Esto da lugar a C RH2/RH2;SH1/sh (donde S significa esterilidad masculina o femenina). 3Cd) Mantenimiento de la línea C a través del siguiente cruce: C RH2/RH2;SH1/sh xc RH2/RH2;sh/sh 3D Producción de semilla híbrida AB Se siembran aleatoriamente las mezclas obtenidas en las etapas 3Ae) y 3Be) o la mezcla obtenida en la etapa 3cd). Antes de que se produzca la polinización cruzada, se pulverizan con los herbicidas 1 y 2 para eliminar todos los genotipos no deseados. Esto da lugar a los siguientes cruces: A RF H2/RF H2;rm/rm;MH1/mh;f h/fh x RF H2/RF H2;rf/rf ;FH1/fh;mh/mh A Esto da lugar a los siguientes retoños: RF H2/rf;RMH2/rm;MH1/mh;FH1/fh 2 % de AB RF H2/rf;RMH2/rm;MH1/mh;fh/fh 2 % de AB RF H2/rf;RMH2/rm;mh/mh;FH1/fh 2 % de AB RF H2/rf;RMH2/rm;mh/mh;f h/fh 2 % de AB que constituye semillas fértiles híbridas al 0 %.

16 4. Otras ventajas del sistema restaurador de fertilidad de la presente invención, en combinación con los sistemas de esterilidad masculina o femenina descritos en las publicaciones de patente europea y , en comparación con los sistemas anteriores son: 2 a) Un esquema de producción a prueba de impericia, con varios marcadores distinguibles y seleccionables para controlar la calidad; b) Una considerable reducción de la complejidad al nivel del multiplicador de semilla final, que es esencial para obtener una producción fiable y unos costes de producción menores; y c) Una reducción del tiempo necesario para la producción de una semilla híbrida comercial. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención. Las figuras que se mencionan en los ejemplos son las siguientes: La figura 1 representa un mapa del vector ptve74 del ejemplo 1. La figura 2 presenta la secuencia de ADN del gen barstar, utilizado en el ejemplo 1, e indica la secuencia mutada de su sitio ClaI. A no ser que se especifique de otro modo en los ejemplos, todos los procedimientos para la obtención y manipulación de ADN recombinante se llevaron a cabo tal como se describe en Maniatis y cols. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Los plásmidos y vectores utilizados en los ejemplos, a continuación, han sido depositados en el Deutsche Sammlung Für Mikroorganismen und Zellculturen (DSM ), Mascheroder Weg 1B, D-30 Braunscheweig, República Federal de Alemania en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest: Plásmido o vector N acceso DSM Fecha pmb de marzo de 1988 pgsc de marzo de Ejemplo 1 Construcción de una secuencia de ADN quimérico de PTA29 y un gen barstar Se construye un plásmido denominado ptve74, representado en la figura 1, ensamblando los siguientes fragmentos de ADN conocidos con el promotor PTA29: 1. Un fragmento de vector, que incluye secuencias de frontera T-ADN, derivado de pgsc1700 (Cornelissen y Vandewiele (1989) NAR 17 (1) 19-29) en el que ha sido suprimido el gen β-lactamasa; localizados entre las secuencias fronterizas, se encuentran los siguientes fragmentos de ADN 2 y 3; 2. Una secuencia quimérica que contiene el cassette de promotor PTA29 de la publicación de patente europea , fundido en marco en el codón de iniciación ATG con un gen de Bacillus amyloliquefaciens que codifica barstar, que es el inhibidor celular de la ribonucleasa extracelular, Barnasa (Hartley y cols. (1972) Preparative Biochemistry 2 (3) ; Hartley and Smeaton (1973) J. Biol. Chem. 248 (16), ); se llevan a cabo los siguientes pasos: a) Se muta la secuencia de nucleótido GCAC, en las posiciones 7 a corriente arriba del primer codón ATG en la secuencia de nucleótido AGCG, para obtener un sitio de clonación ClaI adecuado en el primer codón metionina de la secuencia de codificación (véase figura 2); esto se lleva a cabo utilizando mutagénesis dirigida a sitio (publicación de patente europea , que es la solicitud de prioridad reivindicada en la publicación de patente europea ) y proporciona pmc-tpbsc; los extremos protuberantes de ClaI son digeridos por la enzima, SI, y se aísla el gen barstar como el fragmento ClaI-HindIII de 3 nucleótidos (Figura 2); y b) Se funde el fragmento de PMCTPBSC ClaI-HindIII tratado con SI con el fragmento NCoI-HindIII tratado con SI de pmb3 (publicación de patente europea ) y con un fragmento de restricción que contiene señales de extremo 3 del gen de nopalina sintetasa ( NOS ) para terminación de transcripción y poliadenilación (An y cols. (198) EMBO J. 4 (2), 277); y 16

17 Una secuencia quimérica que contiene un promotor de Arabidopsis Rubisco SSU ( PSSU o PS- SUARA ), un neo gen que codifica resistencia a kanamicina (publicación de patente europea ) y las señales de extremo 3 del gen de octopina sintasa ( OCS ) (Dhaese y cols. (1983) EMBO J. 2, 419). ptve74 es un vector T-ADN de tipo binario que contiene, dentro de las secuencias fronterizas de T-ADN, tres secuencias químéricas: PNOS-neo y PSSU-sfr que comprende los primeros ADN marcadores bajo el control de sus propios segundos promotores; y PT29-barstar en el que barstar es un ADN restaurador de fertilidad cuya expresión bajo el control del primer promotor PTA29 específico de tapete neutralizara, en células de tapete de una planta que sería sino de esterilidad masculina, la actividad de Barnasa codificada por un ADN de esterilidad bajo el control de un promotor de la esterilidad específico de tapete, tal como se describe en la publicación de patente europea Ejemplo 2 Introducción de la secuencia de ADN quimérico del ejemplo 1 en tabaco y colza de semilla oleaginosa Se construye una cepa de Agrobacterium recombinante movilizando ptve14 (del ejemplo 1) desde E. coli a Agrobacterium tumefaciens C8C1 Rif R que contiene pmp90 (Koncz y Schell (1986) Mol. Gen. Genetics 4, ). Se utiliza el puerto de cepa Agrobacterium resultante pmp90 y ptve74 para transformar discos de hoja de tabaco (N. tabacum Petite Havane SR1) utilizando los procedimientos generales descritos por ejemplo en la publicación de patente europea , y para transformar colza de semilla oleaginosa (Brassica napus) con arreglo al procedimiento de Lloyd y cols. (1986) Science 234, y Klimaszewska y cols. (198) Plant Cell Tissue Organ Culture 4, Carbenicilina se utiliza para eliminar las cepas de Agrobacterium tras la infección. Se seleccionan los callos transformados sobre sustrato que contienen 0 ug/ml kanamicina, y se regeneran callos resistentes en las plantas. Tras la incubación de brotes y raíces, se transfieren los transformantes al invernadero y se los deja crecer hasta que florecen. Se examinan las flores, que presentan una morfología completamente natural. Se utiliza el polen de estas flores para polinizar las plantas de colza de semilla oleaginosa y tabaco con esterilidad masculina nuclear que contienen el gen Barnasa como ADN de esterilidad, bajo el control del promotor de esterilidad PTA29 específico para células de tapete, descrito en el ejemplo 13 de la publicación de patente europea Se analizan los retoños de estas plantas de esterilidad masculina polinizadas, encontrándose que un 7 % de sus flores no presentan el fenotipo de esterilidad masculina (es decir, ausencia de una capa de tapete normal en los estambres de sus flores). Huelga decir que la presente invención no se limitaa la transformación de una planta específica. La invención se refiere a cualquier planta, cuyo genoma nuclear se puede transformar con un ADN restaurador de fertilidad bajo el control de un primer promotor que puede dirigir la expresión del ADN restaurador de fertilidad de forma selectiva a al menos las células de las flores de la planta, en particular, a al menos un órgano femenino o al menos un órgano masculino de las mismas, y/o semillas y/o embriones, en virtud de lo cual la planta se puede tanto autopolinizar, como polinizar por polinización cruzada. Por ejemplo, la presente invención se refiere a plantas como maíz, colza de semilla oleaginosa, trigo, arroz, girasol, caña de azúcar, tomate, lechuga, pimiento, sorgo, soja, guisantes, alfalfa, hierbas, tréboles, zanahorias, calabaza, puerro, cebolla, tabaco, petunia, cacao y árboles de cítricos. Asimismo, la presente invención no está limitada a los plásmidos y vectores específicos que se han descrito en los ejemplos anteriores, sino que abarca cualquier plásmido y vector que contenga el ADN restaurador de fertilidad bajo el control del primer promotor. Asimismo, la presente invención no está limitada a los primeros promotores específicos que se han descrito en los ejemplos anteriores, como por ejemplo el promotor PTA29, sino que abarca también cualquier secuencia de ADN que codifique un primer promotor capaz de dirigir la expresión de un ADN restaurador de fertilidad a al menos las células de las flores, semillas y/o embriones de la planta, en las que la expresión de un ADN de esterilidad causaría, si no, que la planta tuviera esterilidad masculina o femenina. A este respecto, el primer promotor de la presente invención abarca: los promotores descritos en la publicación de patente europea para su uso en el control de la expresión de un ADN de esterilidad de manera selectiva en las células del estambre de la planta a la que se le va a dar esterilidad masculina; y los promotores descritos en la publicación de patente europea para su uso en el control de la expresión de un ADN de esterilidad de manera selectiva en células de las flores, semillas o embriones de una planta a la que se le va dar esterilidad femenina. Alternativamente, el primer pro- 17

18 motor puede ser un promotor constitutivo para la planta, siempre y cuando el primer ARN, proteína o polipéptido no afecte negativamente de forma significativa al funcionamiento, metabolismo o desarrollo de células en las que se expresa en ausencia de expresión del ADN de esterilidad. Por otra parte, la presente invención no está limitada a los ADN restauradores de la fertilidad específicos que se han descrito en los ejemplos anteriores, sino que abarca cualquier secuencia de ADN que codifique una primera proteína o polipéptido que, en una planta con la fertilidad restaurada, neutraliza, bloquea, contrarresta, supera o, si no, previene la actividad de la segunda proteína o polipéptido que es una ribonucleasa que está codificada por el ADN de esterilidad bajo el control del promotor de esterilidad y que, de otro modo, afectaría negativamente de forma significativa al metabolismo, funcionamiento y/o desarrollo de las células de las flores, semillas o embriones de la planta. Asimismo, la presente invención no queda limitada a los primeros ADN marcadores específicos que se han descrito en los ejemplos anteriores, sino que abarca cualquier secuencia de ADN que codifica un tercer ARN, proteína o polipéptido que confiera a al menos un tejido de la planta específico o a células vegetales específicas, en las que se expresa dicha secuencia de ADN, una característica diferenciada en comparación con ese mismos tejido de la planta específico o células vegetales específicas en las que no se expresa dicha secuencia de ADN

19 REIVINDICACIONES 1. Un ADN recombinante que comprende un primer ADN quimérico que comprende: a) un ADN restaurador que codifica una proteína que es un inhibidor de una ribonucleasa, y b) un primer promotor que dirige la expresión a al menos células específicas de una flor, una semilla y/o un embrión de una planta encontrándose dicho ADN restaurador en la misma unidad de transcripción que dicho primer promotor y bajo el control de dicho primer promotor. 2. El ADN recombinante de la reivindicación 1 en el que dicho inhibidor es capaz de neutralizar la actividad de la ribonucleasa extracelular barnasa de Bacillus amyloliquefaciens. 3. El ADN recombinante de la reivindicación 2 en el que dicho inhibidor es barstar con una secuencia de aminoácido como la codificada por la secuencia de codificación que comienza en la posición de nucleótido 11, figura El ADN recombinante de la reivindicación 3 en el que dicho ADN restaurador comprende la secuencia de codificación que comienza en la posición de nucleótido 11, figura 2.. El ADN recombinante de la reivindicación 4, en el que dicho ADN restaurador es el fragmento ClaI-HindIII de la figura El ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó,que también comprende un segundo ADN quimérico que comprende: (c) un ADN marcador que codifica un ARN, proteína o polipéptido marcador que, cuando está presente en al menos un tejido específico o en al menos células específicas de una planta, hace que la planta sea fácilmente separable de otras plantas que no contienen dicho ARN, proteína o polipéptido marcador en dicho tejido específico o células específicas; y (d) un segundo promotor capaz de dirigir expresión de dicho ADN marcador al menos a dicho tejido específico o células específicas; estando dicho ADN marcador en la misma unidad de transcripción que dicho segundo promotor y bajo el control de dicho segundo promotor. 7. El ADN recombinante de la reivindicación 6, en el que dicho ADN marcador codifica una proteína o polipéptido que confiere color a al menos dicho tejido específico o células específicas; o codifica una proteína o polipéptido que confiere a dicha planta una tolerancia a las condiciones extremas, resistencia a una enfermedad o una plaga o resistencia bacteriana. 8. El ADN recombinante de la reivindicación 7, en el que dicho ADN marcador codifica una endotoxina de Bacillus thuringiensis que confiere resistencia a los insectos, o codifica un péptido bactericida que confiere resistencia bacteriana. 9. El ADN recombinante de la reivindicación 6 en el que dicho ADN marcador codifica una enzima diana modificada para un herbicida que tiene una afinidad para el herbicida más baja que la enzima diana sin modificar.. El ADN recombinante de la reivindicación 9 en el que dicho ADN marcador codifica una proteína o polipéptido que se selecciona del grupo de una -enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa modificada como diana para el herbicida, glufosfato y una glutamina sintetasa modificada como diana para el inhibidor de glutamina sintetasa, incluyendo fosfinotricina. 11. El ADN recombinante de la reivindicación 6, en el que dicho ADN marcador codifica una proteína o polipéptido que inhibe o neutraliza la actividad de un herbicida. 12. El ADN recombinante de la reivindicación 11, en el que dicho ADN marcador codifica una proteína o polipéptido que confiere resistencia a un inhibidor de glutamina sintetasa, incluyendo fosfinotricina. 13. El ADN recombinante de la reivindicación 12 en el que dicho ADN marcador es un gen sfr o sfrv. 19

20 2 14. El ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, siendo dicho segundo promotor un promotor constitutivo, un promotor que puede inducirse por herida, un promotor que dirige expresión de forma selectiva al tejido vegetal que tiene actividad fotosintética, o un promotor que dirige expresión genética de forma selectiva a las células de la hoja, las células de los pétalos o las células de las semillas.. El ADN recombinante de la reivindicación 14, en el que dicho segundo promotor es un promotor 3S, un promotor 3S 3, un promotor Pnos, un promotor TR1 ó TR2 o un promotor SSU. 16. El ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a que incluye además: (e) un primer ADN que codifica un péptido de tránsito capaz de transportar dicho inhibidor a un cloroplasto o mitocondria de dichas células del estambre: encontrándose dicho primer ADN en la misma unidad de transcripción que dicho ADN restaurador y dicho primer promotor y entre dicho ADN restaurador y dicho primer promotor; y/o (f) un segundo ADN que codifica un péptido de tránsito capaz de transportar dicho marcador, proteína o polipéptido a un cloroplasto o mitocondria de al menos dicho tejido específico o células específicas; encontrándose dicho segundo ADN en la misma unidad de transcripción que dicho ADN marcador y dicho segundo promotor y entre dicho ADN marcador y dicho segundo promotor. 17. El ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en las que dicho primer promotor es un promotor constitutivo. 18. El ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en las que dicho primer promotor dirige expresión al menos a las células del órgano masculino de una planta. 19. El ADN recombinante de la reivindicación 18 en el que dicho primer promotor dirige expresión de manera selectiva a las células del estambre de la planta. 3. El ADN recombinante de las reivindicaciones 18 ó 19 en el que dicho primer promotor dirige expresión a uno o más tipos de células del estambre seleccionadas del grupo que consiste en células de antera, polen y filamento. 21. El ADN recombinante de la reivindicación en el que dicho primer promotor dirige expresión a células de la antera. 22. El ADN recombinante de la reivindicación 21 en el que dicho primer promotor es un promotor de un gen vegetal endógeno seleccionado del grupo gen TA29 del tabaco, el gen TA26 del tabaco, el gen TA13 del tabaco, un gen que codifica un marn hibridable con dicho gen TA29, un gen que codifica un marn hibridable con dicho gen TA13 y un gen que codifica marn hibridable con dicho gen TA El ADN recombinante de la reivindicación 22 en el que dicho primer promotor es el promotor TA29 contenido en el fragmento NcoI-HindIII de plásmido pmb3, DSM ElADNrecombinantedecualquieradelasreivindicaciones1a6enelquedichoprimerpromotor dirige expresión al menos a las células del órgano femenino de una planta. 2. El ADN recombinante de la reivindicación 24 en el que dicho primer promotor dirige expresión de manera selectiva a las células de los órganos femeninos de una planta. 26. El ADN recombinante de las reivindicaciones 24 ó 2 en el que dicho primer promotor dirige expresión a uno o más tipos de células del órgano femenino seleccionado del grupo células del ovario, óvulo, estilo, estigma o septo. 27. El ADN recombinante de la reivindicación 26 en el que dicho primer promotor es un promotor que dirige expresión a células del estilo y/o estigma, como por ejemplo el promotor del gen STGM4B12 endógeno del tabaco, el gen STGM3C9 endógeno del tabaco, el promotor del gen STGM07 endógeno del tabaco o el promotor del gen STGM08 endógeno del tabaco. 28. El ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que es parte del genoma nuclear de una célula de una planta o de una semilla.