El laboratorio en el diagnóstico y seguimiento de hepatitis virales. Octubre 2015, Lima - Perú Amadeo Sáez-Alquezar

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1 El laboratorio en el diagnóstico y seguimiento de hepatitis virales Octubre 2015, Lima - Perú Amadeo Sáez-Alquezar

2 Hepatitis por Virus Virus B de la hepatitis (HBV) Blumberg, B 1965 Virus A de la Hepatitis (HAV) Feinstone, s et al 1973 Virus Delta (HDV) Rizzetto, M 1977 Virus C de la hepatitis (HCV) Choo et al 1989 Virus E de la hepatitis (HEV) Reyes et al. 1990

3 Hepatitis por Virus Hepatitis por virus B (1965) Hepatitis por virus A (1973) HBV** HAV* Hepatitis por virus NoA NoB HNANB ( ) Periodo de 24 años Virus C de la hepatitis (1989) Responsable por el 80% - 90% de las hepatitis post transfusionales NANB (*): Hepatitis infecciosa; (**): Hepatitis por suero homólogo

4 Hepatitis por Virus Escenario actual Hepatitis por virus A Hepatitis por virus B Hepatitis por virus C Hepatitis por virus D Hepatitis por virus E Hepatitis No A-E HAV HBV HCV HDV HEV Virus Epstein Bar, Virus citomegálico, Herpes, otros

5 Características de los Virus de las Hepatitis A B C D E Agente HAV HBV HCV HDV HEV Tamaño nm Envoltorio No Si Si del HBV No Genoma RNA DNA RNA RNA RNA Formas de Transmisión Fecal/oral Si No No No Si Parenteral No Si Si Si No Sexual No Si Poco frecuente Formas Crónicas No 5 7% ~80% Si No Tamizaje en donantes Si No

6 Virus de las Hepatitis A E T. Fecal Oral B D C T. Parenteral Formas Crónicas Otros

7 El escenario actual para el diagnóstico, prevención, seguimiento y cura de las hepatitis virales es bastante promisor, si llevamos en consideración las herramientas que tenemos a disposición

8 El laboratorio para el Diagnóstico e Seguimiento de las Hepatitis por Virus Pruebas serológicas. o Marcadores serológicos (Ac, Ag, Ag/Ac) Pruebas de biología molecular o o Amplificación de ácidos nucleicos Secuenciación Pruebas bioquímicas o Enzimas, bilirrubinas, proteínas (A/G), TP. Pruebas de histología hepática o o Material de biopsia Otras no invasivas (elastografía / fibromax)

9 Herramientas para control de las hepatitis HEPATITIS DIAGNÓSTICO PREVENCIÓN TRATAMIENTO A SI VACUNA --- B SI VACUNA SI (Mejoria) C SI NO SI (> 90%) D SI (p/ B) (P/ B) E SI NO ---

10 Hepatitis por Virus A y E HAV y HEV HAV o Contacto personal o Agua y alimentos contaminados o Formas graves: raras (> con la edad) o Vacuna HEV o Agua y alimentos contaminados o Formas graves Embarazadas (3º trimestre) > con la edad

11 Hepatitis por Virus A: PREVENCIÓN Mejoría de los estándares Socio-económicos y de Higiene. En áreas endémicas para HAV: es indicada la vacunación de niños. La inmunogenicidad de la vacuna para hepatitis A es muy alta; se consigue del 97% al 100% de suero conversión después de una única dosis y de 100% con la segunda dosis. Vacunar viajantes que van de áreas no endémicas para áreas endémicas.

12 Marcadores Serológicos de la Hepatitis por Virus A

13 Casos de Hepatitis A por año Brasil : Casos de Hepatitis A por edad y por año; Brasil : Casos notificados

14 Marcadores Serológicos de la Hepatitis por Virus E

15 OMS, 2014 HEPATITIS B (HBV)

16 Epidemiologia (Virus de la hepatitis B) Aproximadamente 1/3 de la población mundial tiene evidencia serológica de infección actual o anterior por el VHB. 350 a 400 millones de individuos son portadores del antígeno de superficie de la Hepatitis B (AgHBs)

17 Vías de transmisión del HBV Persona a persona Sangre contaminada / Contacto sexual Grupos de riesgo Transfusión sanguínea / Trasplante de órganos Vertical (madre p/ el recién nacido) Uso de agujas y jeringas contaminadas Usuarios de drogas, nosocomial Accidentes de laboratorio; Contacto sexual con múltiples parejas; Hombres que hacen sexo con hombres; Hemodiálisis (pacientes y asistentes) Asistentes en salud / contacto domestico; Tattoos / body piercing

18 Epidemiología (Virus de la hepatitis B) El espectro de la enfermedad y la historia natural de la infección crónica por el VHB son diversos e inconstantes, variando de un estado de portador inactivo a una hepatitis B crónica (HBC) progresiva, que puede evolucionar para cirrosis y carcinoma hepatocelular (CHC) o Enfermedad hepática terminal o CHC: 0,5 1,0 millón de muertes por año y responsable por 5% a 10% de los casos de trasplante hepático

19 Infección por el HBV - Evolución Adultos 80% Asintomática 20% Enfermedad Aguda >1% Hepatitis Fulminante Niños Casi siempre Subclínica 5-7% Infección crónica 30% Cirrosis 23% En 5 anos Falencia hepática 5% a 10% Cáncer hepático Trasplante u óbito

20 Infección Crónica por el HBV Infección Riesgo de infección crónica Riesgo para Cáncer hepático Período Peri natal > 90% 25% Niños 1 a 5 años Niños (>5) Adultos 25 50% 25% 6 10% 15%

21 Virus de la Hepatitis B

22 HBV DNA circular de doble hélice parcialmente cerrada y envoltorio lipídico Genoma: nucleótidos 4 Regiones abiertas para lectura: S, P, C y X

23 Marcadores Serológicos durante la infección por el HBV AgHBs AgHBc AgHBe Anti-HBs Anti-HBc IgM Anti-HBc IgG Anti-HBe

24 Infección por el HBV Evolución normal

25 Infección por el HBV Forma crónica

26 Serología en individuos infectados por el HBV Inmunidad por infección natural Inmunidad por vacuna Hepatitis B crónica??

27 INFECCIÓN CRÓNICA POR EL HBV - FASES FASES AgHBe (+) Inmuno tolerante AgHBe (+) Inmuno reactivo AgHBe (-) Portador inactivo AgHBe (-) Hepatitis B crónica AgHBe (-) Hepatitis B oculta CARACTERISTICAS HBV DNA; ALT N; Inflamación Progresión para fibrosis; HBV DNA; ALT /oscila; Inflamación moderada o acentuada; progresión rápida para fibrosis; HBV DNA; ALT N; Riesgo para cirrosis o CHC Pérdida de AgHBs e soroconversión p/ anti-hbs (+) HBV DNA; ALT persistente o variable Histología: hepatitis activa Persistencia de HBV DNA en el hígado en la ausencia de AgHBs; HBV DNA sérico o indetectable

28 Hepatitis B Oculta Forma clínica clásica Ag HBs negativo después de del curso normal de la hepatitis. Se detecta el HBV DNA plasmático de forma persistente o intermitente (< 200 UI/mL) ALT en niveles normales En 80% de los casos anti-hbc (+) y/o anti-hbs (+) En 20% de los casos anti-hbc (-) y anti-hbs (-)

29 Hepatitis B oculta PERFIL Ag HBs Anti-HBc Anti-HBs Ag HBe Anti-HBe HBV DNA 1 Neg Pos Neg Pos/Neg Pos 2 Neg Pos Pos Pos/Neg Pos 3 Neg Neg Neg Pos/Neg Pos 80% 20%

30 Variabilidad antigénica y genética del HBV Subtipos Antígeno de superficie (AgHBs) Genotipos Grupos genómicos Mutantes Mutaciones en el genoma viral

31 Subtipos sorológicos do HBV Subtipos

32 Genotipos del HBV A B C D E F G H I - J Basados en la divergencia genética de 8% o más, de la secuencia completa de nucleótidos Sub-genotipos : Cuando ocurre divergencia entre los nucleótidos de 4% a 8%, dentro de un mismo genotipo Ejemplos A : 1, 2, 3, 4, 5 B : 1, 2, 3, 4 C: 1, 2, 3, 4 D: 1, 2, 3, 4, 5

33 Genotipos del HBV Zhang Y, Li C, Zhang Y, Zhu H, et al. (2013) Comparative Analysis of CpG Islands among HBV Genotypes. PLoS ONE 8(2): e doi: /journal.pone

34 Mutantes del HBV Generados espontáneamente durante el curso de la infección natural por el HBV Generados en ambiente de presión selectiva Uso de inmune profilaxis activa Uso de inmune profilaxis pasiva Tratamiento con antivirales

35 Mutantes en el determinante antigénico a del HBV Asa 2 del determinante a : G145R: Gly 145 sustituida por arg K141E: Lys 141 sustituida por glu Asa 1 del terminante a T126S T131N

36 Mutaciones en el gene S Fallas en la eficacia de la vacunación o Recién nacidos de madres AgHBs (+) (0,6-4,0%) Fallas de la inmune profilaxis en receptores de trasplante de hígado (11-66%) Re-infecciones Exacerbación en casos de hepatitis B crónica Fallas en la detección del AgHBs por kits diagnósticos comercializados (Ex: G145R) o Importancia de Ac monoclonales

37 Hepatitis por Virus B - Prevención Inmunización pasiva Inmune globulina: Protección corta (2-3 meses) Inmunización activa Vacuna: Protección larga (años) o Esquema: Tres dosis (0-1-6 meses) o Eficacia Respuesta adecuada: anti-hbs > 10 UI/ml o Protección (> 15 años) 1ª dosis: 30-50% - 2ª dosis: 75% - 3ª dosis: 96% Menor en inmune comprometidos y en personas de edad No se recomiendan refuerzos

38 El laboratorio p/ detección de la infección por el HBV Pruebas Indirectas Detectan la presencia de anticuerpos contra el HBV Anti-HBs, anti-hbc, anti-hbe Pruebas Directas De biología molecular para DNA HBV Presencia del Ag HBs METODOLOGÍAS ELISA, CLIA, Pruebas Rápidas PCR, NAT

39 Ensayo Directo Sandwich : Detección de Ag (ELISA)

40 Prueba CLIA para detección del Ag HBs Devare_Sept. 2009

41 ELISA x CLIA ELISA CLIA Suporte Micro placa Partícula magnética Posibilidades Sensibilidad Especificidad Semejante Semejante Acceso aleatorio Velocidad Opciones Pequeño porte Gran porte Pequeño porte Gran porte Equipamientos Abiertos / Cerrados Cerrados Tendencia en los próximos años Disminución, principalmente en grandes rutinas Aumentar

42 Performance frente a mutantes del AgHBs Ly et al., ISBT Hanoi 2007; Ly et al., JCM 2006 Scheiblauer et al., JMV 2006; Moerman et al., ClinLab 2004 Weber et al., J Virol Meth 2006; Daver 2009

43 DETECÇÃO DE MUTANTES DEL AgHBs MUTANTES G145R; P120S/T125M/P127T/S143L; Y100S/T114S/T118V/N131T/K133I/F134N/P142S/T143L/G145K; S113T/T143S T123N/C124R; P120T; T123N; D144A; M133T/Y161F; Q129R/G130N/A166V; M133T/Y161F; Q129R/G130N/A166V; M133T; T118A/D144E; T125M/P127T/T143L; S143L; L109P/T127A/S143L; K141E/K160R; C147W; 122NT123; G119R; P120L; G119R; P120L; G119R/P120L; T126S ISBT XXth Regional Congress, Nagoya, 2009

44 Marcadores serológicos de la Hepatitis por virus delta

45 Diagnóstico de la infección por VHD AgHBs Anti-HBc IgM Anti-VHD IgM Anti-VHD Total Interpretación Co-infección + Neg + + +/- Neg + + +/- Neg Neg Súper Infección Infección anterior Ausencia de infección

46 Tratamiento de la Hepatitis B Crónica

47 Evaluación pre-terapéutica de la enfermedad hepática Evaluar la gravedad de la enfermedad hepática. Todos los parientes en primer grado y parejas sexuales de los enfermos con infección crónica por el HBV deben ser aconsejados a realizar los testes para marcadores serológicos del HBV (AgHBs, anti- HBc y anti-hbs) y a tomar vacuna caso sean negativos.

48 Objetivo del tratamiento en la Hepatitis B Crónica Mejorar la calidad de vida y la supervivencia, impidiendo el progreso de la enfermedad para cirrosis, cirrosis descompensada, enfermedad hepática terminal, CHC y muerte. Reducción de la actividad histológica que disminuye el riesgo de cirrosis y CHC Suprimir la replicación del HBV, de forma continua La infección crónica por el HBV no puede ser completamente erradicada debido a la persistencia del DNA circular cerrado ligado covalentemente (cccdna) en el núcleo de los hepatocitos infectados El genoma do HBV integra el genoma del huésped y puede favorecer la oncogénesis y el desarrollo de CHC

49 Persistencia de HBV-cccDNA intrahepático Emerging Microbes & Infections (2014) 3, e64;

50 Evaluación de la gravedad de la enfermedad hepática Marcadores Bioquímicos o ALT, AST, GGT, FA, Bilirrubinas, Albúmina y globulinas séricas Marcadores Hematológicos o Hemograma, TP Detección de la carga viral (DNA-HBV) o Início do tratamiento y seguimiento terapéutico (UI/mL) Biopsia Hepática o Grado de necro inflamación y de fibrosis Busca sistemática de otras causas de enfermedad hepática crónica

51 Drogas disponibles para el tratamiento de la hepatitis B crónica Interferón o PEG-IFN-2a o PEG-IFN-2b Análogos Nucleósideos o Lamivudina o Telbivudina o Entecavir Análogos Nucleótidos o Adefovir o Tenofovir

52 Definiciones de respuesta al tratamiento Respuesta Bioquímica o ALT (seguimiento hasta 2 años) Respuesta Serológica o AgHbe (para AgHBe +): AgHBs y anti-hbs (para todos los casos) Respuesta Virológica o o o DNA HBV < UI/mL (6 m 12 m tratamiento y 6-12 m fin tratamiento)* Parcial: disminución del DNA HBV de más de 1 log 10 UI/mL (6 m tratamiento)** Escape virológico / Resistencia Respuesta Histológica o < actividad necro inflamatoria y manteniendo el grado de fibrosis (*): IFN / PEG IFN (**): ANS

53 Normas de orientación clínica Hepatitis B crónica Ag HBe (+)

54 Normas de orientación clínica Hepatitis B crónica Ag HBe (-)

55 Incidencia cumulativa de resistencia del HBV a los ANS

56 Principales ventajas y desventajas en el tratamiento de la Hepatitis B Crónica con Interferón α peguilado (PEG-)IFN o con Análogos nucleós(t)idos ANs (PEG-)IFN ANs Duración limitada Efecto antiviral potente VENTAJAS DESVENTAJAS Ausencia de Resistencia Buena tolerancia > Tasas de seroconversión: anti-hbe y anti-hbs con 12 meses de tratamiento Administración oral Efecto antiviral moderado Duración indefinida Tolerabilidad inferior Riesgo de Resistencia Riesgo de efectos adversos Inyecciones subcutáneas Seguridad a largo plazo desconocida

57 Escore Metavir Para evaluar el grado de fibrosis en las hepatitis crónicas B y C F0: sin fibrosis F1: fibrosis portal y peri-portal sin septos F2: fibrosis portal y peri-portal con raros septos F3: fibrosis portal y peri-portal con muchos septos F4: cirrosis Para avaluar el grado de lesiones inflamatorias portales y necrosis hepatocelular A0: ausente A1: leve A2: moderada A3: grave

58 Alfa-2-macroglobulina Haptoglobina Apolipoptroteina- A1 GGT / ALT / AST Bilirrubina total Colesterol total Triglicéridos Glucemia Edad/sexo/peso/altura FibroMax Fibrosis Actividad

59 HCV

60 Virus de la Hepatitis C Descubierto en 1989

61 Hepatitis por Virus C - HCV 160 millones de personas infectadas en el Mundo (estimativa que no corresponde a la realidad pues muchas personas están infectadas y no lo saben) Hepatitis crónica (80% - 85%)* Cirrosis hepática (20%) Cáncer hepático (10% - 20%) (*): La principal causa de hepatitis crónica en el Mundo

62 Prevalencia estimada de Hepatitis C / por grupo de edad Brasil: Edad (años)

63 Transmisión del HCV La principal vía: parenteral Transfusión de Sangre Trasplante de órganos Entre usuarios de drogas intravenosas Por agujas y jeringas Esterilización inadecuada o reutilización Vertical Sexual (poco eficiente) Ocupacional

64 Infección por el virus de la Hepatitis C Infección aguda con recuperación Evolución para infección crónica Mod. CDC, 2002

65 HCV Título de Acs Periodo de ventana

66 Fase de eclipse Días después de adquirir el HCV

67 El laboratorio en la Detección de infección por el HCV Indirectos Detectan la presencia de anticuerpos contra el HCV Directos Pruebas de biología molecular para RNA HCV Presencia del Ag core del HCV Combinación Detectan la presencia de anticuerpos contra el HCV y del Ag core del HCV METODOLOGÍAS ELISA, CLIA, Pruebas Rápidas PCR, NAT

68 ELISA - Anti-HCV de 3ª Generación

69 ELISA - Anti-HCV de 3ª Generación Sensibilidad: ~ 98 % RFN en inmunodeprimidos (infección avanzada por HIV o trasplantados) Enfermedad renal crónica / hemodiálisis Infección inicial por el HCV Especificidad: > 99 % RFP Más frecuentes en poblaciones de baja prevalencia para HCV

70 Diagnóstico de la Hepatitis C aguda y crónica Pruebas diagnósticas de primera línea o Detección de anticuerpos Anti-HCV Cuando se sospecha de hepatitis C aguda o en pacientes inmunodeprimidos o Detección de anticuerpos Anti-HCV + HCV RNA

71 Diagnóstico de la Hepatitis C aguda y crónica Cuando la prueba para anti-hcv es REACTIVA o Realizar una prueba molecular HCV RNA sensible Individuos Anti-HCV Reactivos y HCV RNA Negativos. o Deberán ser sometidos nuevamente a una prueba HCV RNA, después de tres meses para confirmar la verdadera convalecencia

72 Pruebas de Biología molecular para HBV DNA HBV DNA PCR (Carga Viral) o 6,0 UI/mL (0,78 log 10 ) a UI/mL (8,04 log 10 ) Con el aumento de la sensibilidad de las pruebas Cuantitativas, la Prueba Cualitativa se hace desnecesaria

73 Ensayos HCV RNA Cualitativos disponibles (*): Tamizaje en donantes de sangre (#): LLD Kamili et al, Cin Infect Diseases; 2012

74 Ensayos HCV RNA Cuantitativos disponibles (&): solo para screening (*): Dynamic range Kamili et al, Cin Infect Diseases; 2012

75 Pruebas Rápidas Point-of-care Rapid Imunoassays

76 Interpretación de las pruebas para diagnóstico de la infección por el virus de la hepatitis C

77

78 Anti-HCV (ELISA o CLIA) Positivo No Reactivo Repetidamente Reactivo PCR Negativo Imuno blot Repetir em 3 meses Negativo Indeterminado Positivo Genotipos PCR PCR

79 CDC

80 Nomenclatura de los genotipos del Virus C

81 IDENTIFICACIÓN DE GENOTIPOS

82 Distribuição dos diferentes genótipos do VHC em diferentes regiões

83 Identificação de genótipos o A maioria dos métodos genotípicos comercializados se baseia na análise da região 5 UTR que contem suficientes polimorfismos para discriminar corretamente entre os genótipos do VHC mais prevalentes. O método de referência para a determinação, tanto do genótipo quanto do subtipo do VHC, é o sequenciamento direto do genoma completo do vírus e a posterior análise filogenética comparando a sequencia obtida com outras prototípicas Sequenciamento da região polimórfica do NS5B Hibridização inversa Kit Inno-Lipa / Sequenciamento Direto TRUGENE

84 Diagnóstico da hepatite C aguda Depois da fase aguda existem duas possibilidades: o Clearence espontâneo 20% - 25% o Evolução para infecção cônica persistente

85 Tratamiento de la Hepatitis crónica por Virus C No existe vacuna para la HCV. Tratamiento estándar para la HCV. o Combinación de Interferón-α peguilado y Ribavirina o Índice de cura variando de 43% para el genotipo 1. Nuevos antivirales: Telaprevir e Boceprevir o Usados en asociación con el tratamiento estándar. Nuevos antivirales vía oral - monoterapia

86 Medicamentos aprobados por la FDA Medicamento FDA status Ribavirina (Rebetol) 1998 Peginterferon alfa-2b / Peginterferon alfa-2a 2001 / 2002 Boceprevir / Telaprevir 2011 Simeprevir / Sofosbuvir 2013 Ledipasvir-sofosbuvir (Harvoni) Oct, 2014 Ombitasvir-paritaprevir-ritonavir and dasabuvir Dic, 2014 Ombitasvir-paritaprevir-ritonavir Jul, 2015 Daclatasvir Jul, 2015

87 Recomendaciones de la EASL para el tratamiento de la hepatitis C 2015

88 Terapia para Hepatite C crónica El objetivo es la cura de la infección por el HCV para prevenir cirrosis hepática, cirrosis descompensada, CHC, manifestaciones extra-hepáticas graves y muerte. Final de la terapia: HCV RNA indetectable en prueba sensible ( 15UI/mL) en 12 semanas (SVR12) y en 24 semanas (SVR24) después del inicio del tratamiento. En pacientes con Fibrosis y Cirrosis avanzadas la erradicación del HCV reduce, pero no elimina, el riesgo de CHC. En pacientes con Cirrosis descompensada la erradicación del HCV reduce la necesidad de trasplante hepático.

89

90

91 Hepatitis C crónica: Quien debe ser tratado y Cuando

92 Drogas para el tratamiento de la Hepatitis C Unión Europea

93 Hepatitis C Personas con Hepatitis C En general no tienen síntomas Pueden vivir por décadas sin que se sientan enfermos Pueden ser tratadas con suceso con los medicamentos disponibles actualmente.

94 Tamizaje para Hepatitis C crónica Se debe recomendar para la población en general. El tamizaje se puede basar en la detección de anticuerpos anti-hcv. Se podrán usar Pruebas Rápidas en situaciones específicas Cuando sean detectados anticuerpos anti-hcv, se deberá realizar una prueba sensible HCV-RNA

95 Tamizaje para Hepatitis C crónica Recomendación del CDC o Todas las personas nacidas entre 1945 y 1965 (también conocidas como baby boomer ) deben realizar una prueba para Hepatitis C.

96 Pruebas Anti-HCV en Baby boomer: Justificativas Adultos nacidos entre 1945 y 1965 son 5 veces más propensos a estar infectados por el VHC. Tres en cada cuatro (75%) de los adultos con HCV nacieron en esos años. El diagnóstico precoz y el tratamiento pueden ayudar en. la prevención del daño hepático (cirrosis y CHC) Nuevos antivirales con mayor eficacia para obtener la SVR

97 Bancos de Sangre Tamizaje Serológico

98 Tamizaje Serológico en Donantes de Sangre

99 Características de las pruebas de Ag HBs para uso en el tamizaje serológico de donantes PARÁMETRO Ag HBs SENSIBILIDAD ANALÍTICA detección de 0,13 UI / ml* CARACTERÍSTICAS SENSIBILIDAD COM DIVERSIDAD GENÉTICA Detección del mayor número de mutantes del gene S Detección de Genotipos / subtipos SENSIBILIDAD CLÍNICA Detección precoz ESPECIFICIDAD 99,6% (*): 2nd WHO International Standard

100 Anti-HBc total en el tamizaje serológico para interrumpir la transmisión de HBV por transfusión PARÁMETRO CARACTERÍSTICAS Anti HBc ELIMINAR EL RIESGO RESIDUAL DE TRANSMISIÒN DEL HBV 1- Pruebas para AgHBs con baja sensibilidad 2- Niveles de AgHBs indetectables 3- Mutantes en el determinante a del HBV 4- Hepatitis B oculta SENSIBILIDAD RECOMENDADA: 0,7 PEI / ml ESPECIFICIDAD RECOMENDADA: 99,6 %

101 Ventanas de Suero conversión VIRUS PRUEBA Reducción de Ventana Riesgo residual por Millón HIV RNA - PCR 11 días 1.01 HBV DNA - PCR 25 días 8.33 HCV RNA - PCR 59 días 2.72 REDS, NHLBI Retrovirus Epidemiology Study Busch, Kleinman, Korelitz, Schreiber

102 Muchas Gracias

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