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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : C12Q 1/32 G01N 33/73 A61D 19/04 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Ensayo predictivo del resultado de la fertilización in vitro (FIV). k Prioridad: GB 9984 k 73 Titular/es: Royal Free Hospital School of Medicine Rowland Hill Street London NW3 2PF, GB k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Cooke, Brian y Michael, Anthony k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Ungría López, Javier ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Campo técnico La presente invención se refiere a un ensayo que es predictivo del resultado de la fertilización in vitro (FIV) en mamíferos, incluyendo humanos. Antecedentes de la invención La técnica de FIV ha sido utilizada con éxito en pacientes humanos con problemas de infertilidad desde A pesar de la extensa investigación es todavía un procedimiento difícil e incluso en las mejores clínicas de FIV se consigue generalmente una tasa de éxito de sólo el %. La FIV es un procedimiento caro y puede ser también psicológicamente traumático para una paciente. Se requieren procedimientos quirúrgicos para recoger los óvulos para la FIV y después de la fertilización, se requiere más cirugía para implantar los óvulos fertilizados en el útero. La receptora debe luego esperar durante un periodo de tiempo antes de que pueda determinarse si se ha establecido o no el embarazo. En algunos casos, puede que el embarazo no se establezca nunca a pesar de repetidos intentos y estos casos representan un gasto considerable para la sociedad, en términos financieros y humanos. Por tanto, hasta que puedan mejorarse las tasas de éxitodelafiv,sería deseable el poder identificar las receptoras para las que es poco probable que la FIV tenga éxito antes del tratamiento, de tal forma que tales pacientes eviten los costes anteriormente mencionados del procedimiento de FIV. Se cree que la hormona esteroidea adrenal, el cortisol, influye en la maduración de la célula germinal femenina (el oocito) y en el desarrollo de células ováricas en cultivo (Orly & Sato (1979) Cell 17, 29; Patino & Thomas, (1990) J. Exp. 06 2, 97). Recientemente, Fateh y col. (1989, Fertil. Steril. 1, 38-41) han informado que existe una asociación entre la concentración de cortisol en el fluido folicular y la madurez del oocito. El enzima 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (EC ) convierte el cortisol a su forma inactiva, cortisona. Benediktsson y col. (J. Endocrinology (1992) 13, 3-8) informan de la presencia de 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11β-HSD) en oocitos de rata. Los resultados de Benediktsson y col. sugieren un papel para la 11β-HSD en la modulación de la función ovárica. Se han caracterizado dos isoformas de 11β-HSD; una forma hepática y una forma renal. Nuestros hallazgos iniciales sugieren que ambas isoformas se expresan en el tejido ovárico. En la presente invención, la referencia a 11β-HSD incluye ambas isoformas. Descripción de la invención Estudios tales como los mencionados anteriormente han tendido a enfocarse sobre la relación entre la madurez del oocito o los niveles hormonales y el éxito de la fertilización in vitro. Sinembargo, hemos encontrado sorprendentemente que una vez que se ha conseguido la fertilización y que se ha realizado la segunda parte del procedimiento de FIV, a saber la implantación, hay una potente correlación inversa entre los niveles de 11β-HSD en el entorno del oocito en el momento de la reco gida y el posterior establecimiento del embarazo. Esta correlación existe independientemente de la madurez del oocito o de otros factores que pueden afectar la fertilización. La presente invención se refiere por tanto a métodos de ensayo y a kits de ensayo que pueden ser utilizados para predecir el resultado de la FIV en un paciente femenino. La invención se refiere también a tales métodos y kits para utilización en un método de diagnóstico con el fin de determinar el resultado de la FIV o la idoneidad de un paciente femenino para el tratamiento de FIV. Aunque nuestra invención descrita posteriormentehasidodesarrolladaapartirdelainvestigación en pacientes femeninos humanos, será aplicable a cualquier hembra de mamífero y puede ser utilizada para aumentar el éxito de, por ejemplo, programas de cría en cautividad de especies amenazadas o la cría comercial por FIV de ganadería tal como ganado vacuno o caballos. Así en un aspecto la invención comprende un método para predecir el resultado de la FIV que comprende: (i) determinar el nivel de 11β-hidroxiesterodide deshidrogenasa (11β-HSD) en una muestra biológica de un sujeto hembra; y (ii) predecir a partir del nivel determinado de 11β-HSD la probabilidad de establecer el embarazo en dicho sujeto por FIV. En lo que se refiere a la etapa (i), la muestra puede ser un fluido corporal o un tejido tal como el tejido del entorno del oocito tal como las células de la granulosa luteínicas o las células foliculares recuperadas por ejemplo de los folículos ováricos de mujeres sometidas a la recuperación de oocitos para fertilización in vitro y transferencia del embrión. Alternativamente las muestras pueden ser aspirados foliculares, obtenidos por ejemplo según un criterio para pacientes externas antes de admisión a un programa de FIV. La muestra puede contener también células almacenadas (normalmente congeladas) procedentes del entorno de un oocito. Otras muestras incluyen orina, fluido folicular y plasma. Breve Descripción de la Figura La Figura 1 muestra la relación de la actividad de la 11β-HSD ovárica respecto al resultado de la transferencia del embrión en FIV (FIV-TE). Fertilizaciones fallidas = fallo total para fertilizar cualquier oocito recuperado. No embarazadas = pacientes con oocitos que fueron fertilizados pero que no resultaron embarazadas después de la transferencia del embrión. Modos para Realizar la Invención El nivel de 11β-HSD puede ser determinado directamente o indirectamente. Para los fines de la invención el nivel de 11β-HSD puede ser medido como una cantidad o en términos de actividad. Los métodos directos incluyen ensayos enzimáticos para determinar el nivel de actividad 11β-HSD que implican el suministro de un sustrato a la muestra, por ejemplo 3 H-cortisol, y la medida de la conversión del sustrato (por ejemplo a 3 H-cortisona) por el enzima. 3 H-Cortisol y 3 H-cortisona pueden ser separados por cromatografía en capa fina y luego cuantificados. Esto

3 3 ES T3 4 proporcionará una medida directa de la actividad enzimática, y se prefiere por esta razón. En un ensayo típico, puede utilizarse una concentración de 3 H-cortisol de 0 nm aproximadamente, aunque puede utilizarse cualquiera desde nm hasta 00 nm o más. Los métodos indirectos para medir 11β-HSD incluyen el medir los niveles de cortisol y cortisona de la muestra, y determinar la proporción de los dos como una medida indirecta de la actividad enzimática. En tal caso, cuanto más elevado sea el nivel de cortisona en relación con cortisol, más elevada será la actividad del enzima. Los niveles de cortisol y cortisona pueden ser medidos por métodos conocidos per se (por ejemplo por métodos de inmunoensayo que han resuelto cortisol y cortisona por TLC/HPLC). Están disponibles kits asequibles comercialmente para el ensayo de cortisol (ver por ejemplo Encyclopedia of Chemical Technology de Kirk-Othmer, 1982, Vol. 19, páginas ). Alternativamente, la 11-HSD podría ser medida por inmunoensayo o por técnicas similares de unión de ligandos. Esto proporcionará una indicación de la cantidad del enzima, que puede ser correlacionada con la actividad enzimática. Por ejemplo, podría utilizarse un anticuerpo monoclonal capaz de unirse al enzima en métodos de inmunoensayo tales como RIA o ELISA. Están también disponibles en la técnica métodos para determinar y obtener ligandos que se unan con afinidad elevada a un analito específico; ver por ejemplo WO89/09088 titulada Paralog Affinity Chromatography. Podría medirse también la expresión del enzima 11-HSD por inmunocitoquímica utilizando un anticuerpo monoclonal. Tales técnicas proporcionarán una medida de la cantidad de 11-HSD presente, que puede ser correlacionada con la actividad enzimática. Aunque aquí nos referimos a la determinación de los niveles de 11β-HSD se comprenderá apar- tir de lo precedente que ésta incluye las medidas indirectas mencionadas anteriormente. Una vez que se ha medido el nivel de 11β- HSD, el resultado puede ser utilizado para predecir la probabilidad del establecimiento con éxito de embarazo en un sujeto femenino sometido a tratamiento de FIV. En nuestros estudios, hemos medido los niveles de 11β-HSD como la cantidad de cortisol convertido en cortisona por mg de proteína por 4 horas para obtener una medida directa de la actividad enzimática. Hemos encontrado que aquellos sujetos con actividades enzimáticas inferiores a pmoles/mg/4 horas aproximadamente tienen una tasa de embarazo de más del 80% después de la transferencia del embrión. En contraste, los sujetos con actividades enzimáticas que oscilaban de 1 a 111 pmoles/mg/4 horas no quedaban embarazadas aunque la fertilización de sus oocitos hubiera tenido aparentemente éxito. Aquellas personas expertas en la técnica apreciarán que aunque en nuestra investigaciónhemos determinado un nivel de corte de la actividad de 11β-HSD por encima del cual las pacientes no habían quedado embarazadas (y por debajo del cual las pacientes habían mejorado significativa mente la probabilidad de un embarazo con éxito), el valor es una medida estadística y pueden utilizarse otras medidas y umbrales. En la práctica de la invención, lo más importante es conseguir la consistencia del ensayo, y por tanto cada médico individual (o equipo de FIV) será capaz de establecer su propio método de ensayo particular y de determinar su propio nivel de corte. Esto podría ser establecido llevando a cabo primeramente un estudio histórico en muestras de pacientes previas. De este modo, el nivel de una actividad enzimática de pmoles/mg/4 horas mencionado anteriormente representa la medida que nosotros hemos utilizado en nuestros estudios como un límite adecuado. Sin embargo, si se fueran a medir los niveles de 11β-HSD de cualquiera de las otras formas anteriormente mencionadas, sería deseable realizar, utilizando procedimientos de rutina, un control utilizando nuestro método de ensayo para determinar la relación entre nuestros resultados y los resultados de otros métodos, con el fin de realizar comparaciones directas. Una vez que ha sido determinado el nivel de 11β-HSD, puede ser utilizado para determinar la probabilidad del establecimiento de embarazo por FIV en una paciente. Por ejemplo, hemos utilizado nuestra invención en muestras de pacientes a las que se habían recogido ya oocitos, fertilizado in vitro e implantado. Generalmente, se recogen varios óvulos y se fertilizan para que en el caso de un fallo en el establecimiento del embarazo, puedan ser implantados más óvulos fertilizados. Realizando el método de la presente invención, es posible predecir, en el caso de que no se haya establecido el embarazo, si es probable que la implantación de los oocitos almacenados tenga éxito. Si los niveles de 11β-HSD en tales pacientes están significativamente por encima del nivel asociado con un embarazo con éxito, entonces sería un ahorro de tiempo, dinero y estrés para la paciente no emprender más intentos de implantación con los oocitos almacenados recogidos y fertilizados al mismo tiempo que los implantados previamente y para los que están disponibles datos sobre la 11β- HSD. La presente invención puede ser realizada también antes de la implantación, antes de la fertilización de los oocitos recogidos o incluso antes de la recogida de tales oocitos. En tales casos, será posible para el médico(oparalaclínica de FIV) decidir si intentar o no incluso una primera implantación. De este modo, la presente invención puede ser utilizada para proporcionar un métodoparapredecir el resultado de la FIV en un sujeto femenino que comprende: (i) retirar una muestra biológica del sujeto; (ii) determinar el nivel de 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11β-HSD) en dicha muestra; y (iii) predecir a partir del nivel determinado de 11β-HSD la probabilidad de establecer un embarazo por FIV en dicha paciente. Las muestras biológicas adecuadas incluyen 3

4 ES T3 6 las mencionadas aquí anteriormente. Esta realización de la invención puede ser utilizada para seleccionar probables candidatos para un programa de FIV. Una vez que ha sido seleccionado un candidato, será deseable confirmar su idoneidad durante el procedimiento de FIV mediante la repetición de ensayos para 11β-HSD durante la parte inicial del procedimiento de FIV. De este modo, la invención puede ser también utilizada en un método para establecer la probabilidad de un tratamiento de FIV con éxito en una paciente que comprende: (i) retirar oocitos de un sujeto femenino junto con una muestra biológica; (i ) fertilizar dichos oocitos in vitro; (ii) determinar el nivel de 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11β-HSD) en dicha muestra; y (iii) predecir a partir del nivel determinado de 11β-HSD la probabilidad de establecer un embarazo por FIV en dicho sujeto. Opcionalmente, esta realización de la invención comprende además: (iv) implantar los oocitos fertilizados en el sujeto femenino. Las muestras biológicas preferidas incluyen las células de la granulosa luteínicas. En una realización alternativa, la invención puede ser utilizada en un método que comprende: (i) retirar oocitos de un sujeto femenino junto con una muestra biológica; (ii) determinar el nivel de 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11β-HSD); (iii) predecir a partir del nivel determinado de 11β-HSD la probabilidad de establecer un embarazo por FIV en dicho sujeto; y (iii ) fertilizar oocitos de aquellos sujetos cuyo nivel de 11β-HSD esté por debajo de un umbral predeterminado. Opcionalmente, este método comprende además: (iv) implantar los oocitos fertilizados en el sujeto femenino. Las muestras biológicas preferidas incluyen células de la granulosa luteínicas. Aunque las dos realizaciones anteriores son practicadas deseablemente en pacientes que han sido ya analizadas antes de la recogida de los oocitos para determinar los niveles adecuados de 11β-HSD, pueden ser también practicadas en pacientes que no han sido sometidas a tal selección inicial. La invención encuentra aplicación en programas de selección a gran escala de receptoras potenciales de FIV que han sido remitidas a, o que se han presentado ellas mismas a, clínicas de FIV. En esta realización, la invención comprende: (i) seleccionar una población de pacientes femeninos que buscan tratamiento para la infertilidad por FIV por los niveles de 11β- HSD; y (ii) seleccionar de la población a aquellas pacientes que tengan niveles de 11β-HSD por debajo de un umbral predeterminado para el tratamiento de FIV. En particular, se prefieren como receptoras adecuadas para el tratamiento de FIV aquellas pacientes que tengan niveles de 11β-HSD en el entorno del ovario, especialmente en las células de la granulosa luteínicas, por debajo de un umbral predeterminado. Por la utilización de la presente invención, será posible para las clínicas de FIV distribuir más eficazmente los recursos, de tal forma que las pacientes con niveles elevados de 11β-HSD en el entorno de un oocito recuperado, que no es probable que queden embarazadas por el tratamiento de FIV, no sean tratadas. Los niveles de 11β-HSD en un sujeto femenino pueden ser monitorizados durante un periodo de tiempo con el fin de establecer si tienen lugar o no cambios favorables para una FIV con éxito. Hemos encontrado que los niveles de 11β-HSD ovárica en pacientes individuales varía entre ciclos menstruales consecutivos y por tanto las pacientes pueden ser monitorizadas de acuerdo con la invención para obtener un oocito que sea de un entorno con niveles favorables (esto es, bajos) de 11β-HSD. Las pacientes pueden ser tratadas también para modular o bloquear la actividad de la 11β- HSD in vivo antes de la recogida de los oocitos. Por ejemplo, podrían introducirse en la paciente anticuerpos contra la 11β-HSD con el fin de inhibir la actividad del enzima. Esto es análogo alosmétodos de tratamiento de tumores o de otras condiciones utilizando terapia de anticuerpos. Para los fines de esta invención,eltérmino anticuerpo, a no ser que se especifique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos completos que conservan su actividad de unión a un antígeno diana tumoral. Tales fragmentos incluyen los fragmentos Fv, F(ab ) y F(ab ) 2,asícomo anticuerpos de una única cadena. Además, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados, por ejemplo como los descritos en EP-A-2390 (Winter). Puede ser también posible inhibir la actividad de la 11β-HSD utilizando otras hormonas glucocorticoides o análogos de las mismas que compiten con el cortisol por la 11β-HSD. Tales hormonas oanálogos de las mismas pueden ser obtenidas mediante la selección de hormonas candidatas o de análogos de las mismas añadiéndolas al ensayo descrito en el Ejemplo 1 para ver si pueden competir con 3 H-cortisol por la 11β-HSD, e inhibir así la actividad del enzima. Las hormonas candidatas o los análogos de las mismas pueden ser luego sometidas a selección mediante la administración de una cantidad eficaz de una hormona o de un análogo de la misma a sujetos femeninos que están siendo sometidos a tratamiento de FIV y que se ha encontrado que tienen niveles

5 7 ES T3 8 de 11β-HSD que son desfavorables para establecer un embarazo después de FIV-TE. La cantidad de hormona o de análogo de la misma a administrar necesitará ser determinada por el médico, teniendo en cuenta la actividad de la hormona y la condición de la paciente. Esto puede ser conseguido sin dificultad, dado que tales hormonas son utilizadas a menudo en la práctica clínica en las clínicas de fertilidad. Las hormonas o los análogos de las mismas pueden ser administradas por cualquier vía adecuada, por ejemplo oralmente o por inyección. Para la administración, la hormona o el análogo de la misma puede ser formulada con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. De tales formas, será posible modular los niveles de actividad de la 11β-HSD en una paciente que desee someterse a FIV para que el resultado de la FIV sea un éxito. Los anticuerpos contra la 11β-HSD pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados por la tecnología de hibridomas convencional utilizando las proteínas o fragmentos peptídicos de las mismas, como inmunógeno. Los anticuerpos policlonales pueden ser también preparados por medios convencionales que comprenden inocular un animalhuésped, por ejemplo una rata o un conejo, con un péptido de la invención y recuperar el suero inmune. La utilización de inhibidores de 11β-HSD permitirátambién el tratamiento in vitro de los oocitos recogidos para reducir la actividad del enzima antes de la fertilización de los oocitos. Esto puede conseguirse poniendo en contacto una cantidad eficaz de tal inhibidor, por ejemplo una hormona ounanálogo de la misma según se mencionó anteriormente, con una muestra que contenga un oocito y tejido circundante tal como células de la granulosa luteínicas, con el fin de inhibir la actividad de la 11β-HSD en la muestra. La muestra y el inhibidor pueden ser puestos en contacto bajo condiciones estériles tal como las utilizadas típicamente para FIV. Pueden proporcionarse kits para utilización en la realización del ensayo de la invención. Tales kits incluyen al menos un reactivo útil para la detección de la actividad 11β-HSD. Reactivos adecuados incluyen anticuerpos, u otros reactivos de unión a ligandos adecuados, contra la 11β- HSD unidos opcionalmente a una marca. Marcas típicas son aquellas utilizadas comúnmente en procedimientos de inmunoensayo, por ejemplo peroxidasa de rábano picante. Alternativamente, el kit puede contener anticuerpos, u otros reactivos de unión a ligandos adecuados, contra cortisol y/o cortisona. El kit puede contener también estándares, por ejemplo cantidades predeterminadas de cortisona, cortisol o 11β-HSD, alguno de los cuales o todos pueden estar marcados con una marca detectable. El kit puede contener también cofactores enzimáticos, por ejemplo NAD o NADP que son convertidos a NADH o NADPH respectivamente. El kit puede ser empleado para la medida de 11β-HSD para utilización en un método de diagnóstico, pronóstico y/o tratamiento de FIV de un sujeto femenino. La invención proporciona además la utilización de un reactivo para la detección de 11β-HSD para el pronóstico de la probabilidad de establecer un embarazo por FIV en un sujeto femenino. Los anticuerpos, fragmentos y variantes de los mismos anteriormente mencionados, y otros reactivos de unión a ligandos adecuados, que pueden estar marcados opcionalmente con una marca detectable, pueden ser utilizados para la fabricación de un kit de diagnóstico para utilización en el tratamiento o diagnóstico de la idoneidad para FIV. Los niveles de 11β-HSD pueden ser también ensayados mediante el análisis de los niveles de ARNm de 11β-HSD presentes en las muestras obtenidas. Con el fin de conseguir esto, puede utilizarse ADNc de 11β-HSD (Tannin y col., (1991) J. Biol. Chem. 266, ) o fragmentos del mismo como sonda para determinar los niveles de 11β-HSD en el entorno del oocito. Tales sondas pueden ser también formuladas en kits de una manera análoga a los descritos para anticuerpos, y pueden contener ácidos nucleicos control. Pueden diseñarse sondas para el gen de la 11β- HSD para utilización como sondas, por ejemplo para utilización en un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos. Los siguientes ejemplos ilustran la invención. Ejemplo 1 Métodos Se indujo un desarrollo folicular múltiple en pacientes de FIV por la administración de busurelina y gonadotropinas exógenas. Los folículos fueron aspirados transvaginalmente y las células de la granulosa aisladas de los aspirados foliculares utilizando un gradiente de Percoll al % (v/v). Después de lavar con solución salina tamponada con fosfato, las células se suspendieron a una densidad de x 4 células/ml en medio de cultivo mixto (1:1 Ham s F-12:DMEM) suplementado con suero de ternera fetal al % (v/v). Las células fueron luego cultivadas durante 3 días a37 C con sustitución diaria del medio. En el cuarto día de cultivo se ensayó la actividad de la 11β-HSD incubando las células durante 4 horas en medio libre de suero que contenía 3 H-cortisol 0 nm. Al final del ensayo, se extrajeron los esteroides del medio de cultivo con cloroformo, se concentraron en acetato de etilo y se separaron por cromatografía en capa fina (TLC). Las áreas del cortisol y de la cortisona se visualizaron en la placadetlcporlaabsorción de luz ultravioleta. Se transfirieron después a viales de centelleo y se determinó larelación cortisona:cortisol por contaje en centelleo líquido. Después de corrección por la actividad específica del 3 H-cortisol y por la concentración de la proteína celular en cada pocillo de cultivo, las actividades de 11β-HSD se expresaron como la cantidad de cortisol convertida en cortisona/mg de proteína/4 horas. El límite más bajo de detección del ensayo (representado en la Fig. 1 por la línea de puntos horizontal) era igual a pmoles/mg/4 horas. Resultados La distribución de las actividades de 11β- HSD, agrupadas por el resultado de la FIV-TE, se presentan en la Fig. 1. Las células de 13 de las 29 pacientes de este estudio carecían de

6 9 ES T3 actividad 11β-HSD detectable. De estas 13 pacientes 11β-HSD negativas, 2 (esto es, el 1,4%) no tuvieron fertilización de ninguno de los oocitos recuperados mientras que 9 de las 11 pacientes restantes quedaron embarazadas, dando una tasa de embarazo del 81,8% en la transferencia del embrión. En contraste, 16 pacientes tenían actividades 11β-HSD detectables que oscilaban desde 1,61 a 111,2 pmoles/mg/4 horas. De estas 16 pacientes 11β-HSD positivas, (esto es, el 31,3%) tuvieron un fallo total de fertilización (sólo se muestran dos en la Figura 1) y ninguna de las 11 pacientes restantes quedó embarazada en la transferencia de embrión. Mientras que la tasa de fallo de fertilización total parece ser más elevada entre las pacientes con células 11β-HSD positivas, las tasas globales de fertilización no diferían significativamente entre las pacientes con células 11β-HSD positivas y 11β-HSD negativas. Ejemplo 2 Se recuperaron células de la granulosa de aspirados foliculares de 16 mujeres sometidas a recuperación de oocitos en 2 ciclos consecutivos. Después de un precultivo de 3 días en medio su- 1 2 plementado con suero según se describió anteriormente en el Ejemplo 1, las células se incubaron durante 4 horas en medio libre de suero que contenía [ 3 H]-cortisol 0 nm y se calcularon las actividades de 11β-HSD como en el Ejemplo 1. De las 11 pacientes cuyas células tenían actividad 11β-HSD detectable en sus ciclos de tratamiento iniciales, solamente 6 tenían células 11β-HSD positivas en sus ciclos repetidos. De forma similar, de las pacientes estudiadas con ciclos iniciales 11β-HSD negativos, solamente 2 tenían ciclos repetidos 11β-HSD negativos. Por tanto, no había una asociación significativa entre la presencia o ausencia de actividad 11β-HSD ovárica detectable en ciclos consecutivos de FIV- TE (Chi 2 =0,042, n.s.). Además, las tasas de embarazo clínico fueron del 0% y del 67% para los ciclos repetidos 11β-HSD positivos y 11β-HSD negativos respectivamente. De este modo, la actividad de la 11β-HSD ovárica puede variar para una paciente dada entre los ciclos de FIV-TE. Esta actividad enzimática se refiere a la probabilidad de concepción por FIV-TE independientemente en ciclos de tratamiento iniciales y repetidos

7 11 ES T3 12 REIVINDICACIONES 1. Un método para predecir el resultado de la FIV que comprende: (i) determinar el nivel de la 11β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11β-HSD) en una muestra biológica de un paciente femenino; y (ii) predecir a partir del nivel determinado de 11β-HSD la probabilidad de establecer un embarazo por FIV en dicho sujeto. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la muestra es tejido del entorno del oocito. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 en el que la muestra es un aspirado folicular. 4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la muestra comprende células de la granulosa luteínicas.. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el sujeto hembra es una hembra humana. 6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el nivel de 11β-HSD es medido como actividad enzimática. 7. Un método de acuerdo con la reivindicación en el que la actividad de la 11β-HSD es determinada midiendo la tasa de conversión de cortisol acortisona. 8. Un método para seleccionar una población femenina por su idoneidad para FIV que comprende: (i) seleccionar por los niveles de 11β-HSD muestras biológicas de una población de sujetos femeninos que solicitan tratamiento para la infertilidad por FIV; y (ii) seleccionar de la población para tratamiento por FIV a aquellas pacientes que tengan un nivel de 11β-HSD por debajo de un umbral predeterminado. 9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende además la reselección de las pacientes con niveles de 11β-HSD por encima del nivel umbral predeterminado por los niveles de 11β-HSD en los ciclos de ovulación subsiguientes.. Utilización de un reactivo para el ensayo del nivel de la 11β-HSD en una muestra biológica de un sujeto femenino para el pronóstico de la probabilidad del establecimiento de embarazo por FIV en el sujeto femenino NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva. 7

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