Tema 11. Herramientas de la genética molecular
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- Lucas Ruiz Caballero
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1 Tema 11. Herramientas de la genética molecular Genética CC. Mar Objetivos Técnicas de clonación Construcción de genotecas e identificación de secuencias Mapas de restricción Amplificación (PCR) Secuenciación Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 2
2 Clonación molecular La clonación molecular consiste en hacer muchas copias de un segmento de DNA: 1. Aislar el DNA de un organismo 2. Cortar el DNA en pedazos con enzimas de restricción, y insertar cada fragmento en un vector de clonación, creando una molécula de DNA recombinante. 3. Introducir la molécula de DNA recombinante en un hospedador (p.e., E. coli, levadura, una célula vegetal o animal) para que éste se replique, produciendo múltiples copias idénticas de la molécula de DNA recombinante denominadas clones. Amplificación del DNA recombinante Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 3 Definiciones Enzima de restricción: enzima capaz de cortar el DNA en un lugar determinado, denominado diana o sitio de restricción. Diana o Sitio de restricción: secuencia de DNA, generalmente simétrica, que es reconocida por una enzima de restricción. Vector de clonación: molécula de DNA artificial capaz replicarse en un organismo hospedador (p.e. en una bacteria). DNA recombinante: molécula de DNA creada artificialmente a partir de fragmentos con orígenes distintos. Clon: Copias idénticas de la molécula de DNA recombinante. Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 4
3 Restricción del sitio EcoRI. Este sitio es simétrico y palindrómico Enzimas de restricción Los enzimas de restricción o endonucleasas reconocen una secuencia de bases específica en el DNA denominada diana o sitio de restricción, y la cortan hidrolizando un enlace fosfodiéster. Se encuentran de forma natural en bacterias, con función defensiva. En muchos casos los sitios de restricción son simétricos y palindrómicos Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 5 Diversidad de las enzimas de restricción 400+ enzimas Se nombran a partir del organismos del que fueron aisladas (en itálica), a veces indicando la cepa, más número romanos La mayoría reconocen sitios de restricción con 4 o 6 pb. Enzimas de restricción Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 6
4 Corte de restricción Cortes de restricción romos (SmaI) y pegajosos (B amhi, PstI). Cortes romos (p.e. SmaI) o pegajosos (p.e. BamHI, EcoRI) Fragmentos cortados con una misma enzima pueden unirse entre sí. Sellando los huecos con una DNA ligasa, estos fragmentos producen una molécula completa de DNA con un sitio de restricción regenerado. Con suficiente ligasa se pueden unir fragmentos con extremos romos Corte y ligamientos de fragmentos con EcoRI y DNA lig asa Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 7 Otras enzimas DNA ligasas: catalizan la formación de enlaces fosfodiéster entre el 5' fosfato y el 3' OH de dos nucleótidos de DNA. Se usan para unir covalentemente cadenas de DNA. RNA ligasas: catalizan la formación de enlaces fosfodiéster en el RNA. Se usan para unir covalentemente cadenas de RNA. Fosfatasas alcalinas: eliminan grupos fosfato de los extremos 3 o 5 del DNA. Quinasas polinucleótido: añaden fosfato al extremo 5 del DNA o RNA. Exonucleasa: eliminan nucleótidos del extremo 3 del DNA Transferasa terminal: añaden homopolímeros (e.g., poli(a)) al extremo 3 del DNA. Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 8
5 Vectores de clonación Un vector de clonación es una molécula de DNA artificial capaz replicarse en un organismo hospedador. Plásmidos Fagos Cósmidos Cromosomas artificiales de levaduras (YACs) Cromosomas artificiales de bacterias (BACs) Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 9 Plásmidos Los plásmidos bacterianos son elementos extracromosomales circulares que se replican autónomamente en la célula. Deben incluir: Una secuencia de origen de replicación (ori) Un marcador dominante que permita su selección Sitios únicos de restricción, de forma que se pueda insertar un fragmento de DNA. Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 10
6 Plásmido puc19 Permite la clonación de fragmentos de 2-3 kb, y en algunos casos 5-10 kb. Número de copia alto (E. coli admite 100). Gen de resistencia a la ampicilina (amp R ) Cluster de sitios únicos de restricción para múltiples enzimas (sitio de clonación múltiple o polylinker ). Gen lacz +. Cuando se clona un fragmento de DNA en este sitio, no se puede producir!-galactosidasa funcional. Plásmido de clonación puc19 Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 11 Clonación puc19 1. Se corta el plásmido con un enzima de restricción. 2. Se corta el DNA con el mismo enzima de restricción. 3. Los fragmentos DNA se mezclan con el plásmido cortado. Por azar algunos fragmentos se insertan en el plásmido. 4. El plásmido recombinante se introduce en E. coli por transformación. 5. Las colonias de E. coli se cultivan en un medio con ampicilina (sólo crecen las que lleven el plásmido), y con X-Gal (las que posean clones recombinantes son de color blanco; las otras azules). Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 12
7 Vector de clonación del fago " Clonación con fago lambda Dos brazos en los extremos con los genes necesarios para el ciclo lítico (ciclo lisogénico eliminado). Segmento central prescindible delimitado por dos sitios EcoRI. Acomodan unos 15 kb de DNA. Clonación: Se corta vector y DNA y se mezclan. El DNA recombinante se mezcla con partes de fago para ensamblar partículas virales completas (DNA kb) Se infecta E.coli con estas partículas Replicación hasta fagos/ml Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 13 Cósmidos Cósmido Combinan características de plásmidos y fagos Sitio ori, amp R, de clonación y cos. El sitio cos es dónde se corta el concatámero de múltiples genomas " en fragmentos de 48 Kb para su empaquetamiento en las cabezas virales El sitio cos permite empaquetar kb de DNA en una partícula " que se replica como un plásmido. Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 14
8 Cromosomas artificiales de levadura (YACs) YAC Permiten clonar fragmentos de hasta 500 kb. Presentan las siguientes propiedades: Un telómero de levadura a cada lado (TEL) Una secuencia centromérica de levadura (CEN) Un marcador seleccionable (p.e., TRP1, URA3) Una secuencia de origen de replicación (ARS) Sitios de restricción únicos Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 15 Cromosomas artificiales de bacteria (BACs) Útiles para clonar fragmentos de hasta 200 kb en E. coli. Contienen el origen de replicación de un plásmido natural denominado factor F, un sitio de clonación múltiple, un marcador seleccionable y otros elementos. Pueden ser manipulados como plásmidos bacterianos normales. Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 16
9 Librerías de DNA recombinante o genotecas Una librería genómica o genoteca es una colección de clones que contiene al menos una copia de cada secuencia de DNA de un genoma. Estas librerías pueden ser usadas para aislar o estudiar un clon particular, por ejemplo aquél que contenga un gen de interés. Hay varios tipos: Librerías cromosómicas: contienen los fragmentos correspondientes a cromosomas individuales. Librerías de DNA complementario (cdna) Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 17 Construcción de librerías genómicas Cortar DNA genómico con enzimas de restricción y clonar los fragmentos resultantes en un vector de clonación Digestión total: muchos fragmentos; genes interrumpidos. Digestión mecánica: fragmentos mayores con extremos romos. Digestión parcial: población de fragmentos solapantes que representan todo el genoma. Digestión parcial para la construcción de librerías Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 18
10 Representación en librerías Los sitios de restricción se distribuyen de forma heterogénea => No todas las secuencias de un genoma están igualmente representadas en la librería. El número de clones (N) necesarios para incluir con probabilidad (P) todas las secuencias de un genoma depende del tamaño del genoma (g) y de los fragmentos clonados (f): N = ln( 1! P) ln 1! f g ( ) P=0.99, g(levadura)=12000 kb, f=15 kb => 3682 clones. Para una librería similar, g(humano)= kb, clones. Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 19 Síntesis de cdna Librerías de cdna Una librería o genoteca de cdna es una colección de clones que contiene al menos una copia de DNA de todos los mrnas aislados de una célula. Reflejan la actividad génica de un tipo de célula en un momento particular. La cola poli(a) facilita el aislamiento de los mrnas y la obtención del cdna: Se empareja poli(t) a la cola poli(a) Se extiende el poli(t) con retrotranscriptasa; híbrido DNA-RNA Se degrada el RNA con RNasa Síntesis de DNA con DNA polimerasa DNA ligasa Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 20
11 Clonación del cdna Se añade ligador ( linker ), DNA 8-12 pb., con un sitio de restricción. Corte restricción produce extremos pegajosos. Inserción en vector Si el cdna contiene un sitio de restricción como el de los ligadores, se utilizan adaptadores, ligadores que ya poseen extremos pegajosos. Clonación del cdna Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 21 Análisis de librerías de cdna Localización de clones mediante anticuerpos en librerías de cdna En librerías de cdna se puede localizar el clon de interés través de la proteína que codifica. Vectores de expresión: contienen un promotor y una señal de terminación entre los que se inserta el fragmento clonado Anticuerpos específicos marcados radiactivamente usados como sondas. Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 22
12 Localización de clones en plásmidos Transformación E. coli en medio selectivo Replicado a filtro Incubación filtro+sonda marcada Revelado: autorradiografía, quimoluminiscencia o detección colorimétrica Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 23 Localización de clones en fago " Fagos recen en bacterias formando placas de lisis Replicado a filtro ( levantado de placa ) Incubación filtro+sonda marcada Revelado: autorradiografía, quimoluminiscencia o detección colorimétrica Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 24
13 Otras técnicas de búsqueda Por complementación de mutaciones: se basa en la expresión del gen salvaje introducido en células con una forma defectuosa de ese gen. Con sondas heterólogas: se trata de utilizar genes de otros organismo como sondas. Tiene sentido entre especies próximas y/o genes conservados. Con sondas de oligonucleótidos: si se conoce algo de la secuencia aminoacídica de la proteína codificada por un gen se pueden fabricar oligonucleótidos (~20 nucleótidos) para ser utilizados como sonda. Complementación de mutaciones Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 25 Análisis de secuencias clonadas Las secuencias clonadas se utilizan para implementar una diversidad de experimentos, relacionados con su expresión, su estructura, o su secuencia. Mapas de restricción Southern blots mrnas: Northern blots Secuenciación del DNA Amplificación del DNA: PCR Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 26
14 Mapas de restricción Mapa de restricción: número y distribución de los sitios de restricción. 1. Cortar el fragmento de DNA con una o varias enzimas por separado. 2. Separar los fragmentos por tamaño: electroforesis 3. Inferir tamaños por calibración con controles 4. Construir el mapa Construcción de un mapa de restricción para EcoRI y B amhi para un fragmento clonado. Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 27 Electroforesis en gel La técnica de electroforesis en gel consiste en aplicar una carga eléctrica a través de una matriz porosa (almidón, agarosa) para separar fragmentos de DNA (o proteínas) de acuerdo a su tamaño y conformación. Los fragmentos más pequeños migran más rápido. Se utilizan como controles fragmentos de tamaño conocido ( ladder ). Se tiñe el gel con bromuro de etidio y se visualiza bajo luz UV. Electroforesis de DNA en gel de agarosa Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 28
15 Análisis de restricción de genes no clonados Los mapas de restricción de un fragmento de DNA también se puede construir sin clonarlo, siempre que se tenga una sonda adecuada (p.e., cdna, gen clonado de otro organismo): Southern blot 1. Se corta el DNA genómico con diferentes enzimas de restricción. 2. Separación por electroforesis 3. Se pasan los fragmentos a una membrana por Southern blot. 4. Se añade una sonda marcada al filtro, la cual hibrida con los fragmentos de DNA complementario, indicando su posición. Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 29 Análisis de mrnas El análisis de los tránscritos de genes es parecido al de los propios genes: 1. Se aíslan los mrnas de una célula. 2. Se separan los mrnas por electroforesis 3. Se pasan los fragmentos a una membrana nylon por Northern blot (igual al Southern blot ) 4. Se añade una sonda marcada al filtro, la cual hibrida con mrnas complementarios, indicando su posición. Este tipo de análisis es útil para estudiar los tamaños de los RNAs, su presencia, cantidad, etc. Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 30
16 Secuenciación del DNA El método más común es el método didesoxi o de terminación de cadena. 1. Desnaturalización DNA por calor + Cebador 2. 4 reacciones: DNA+cebador DNA polimerasa datp+dttp+dctp+dgtp ddntp (3 OH) para la síntesis 3. Separación en electroforesis de acrilamida 4. Revelado por autorradiografía Autorradiog rama de un g el de secuenciación Secuenciación de terminación de cadena Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 31 Secuenciación automática A día de hoy este procedimiento está automatizado. Se utilizan ddntp con diferentes colores, y los fragmentos se separan por electroforesis en una única calle que es examinada con un láser que determina que marcador fluorescente aparece en cada posición. Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 32
17 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Amplificación de fragmentos de DNA sin clonación Hacen falta cebadores Ciclos desnaturalización del DNA (94-95 ºC) emparejamiento de cebadores (37-65 ºC) síntesis DNA con Taq polimerasa (90-75 ºC) 2 nº ciclos moléculas. 20 ciclos (100 ) = copias del DNA original Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Genética CC Mar 2004/5 D. Posada, Universidad de Vigo 33
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