Clonación molecular. Clonar significa hacer copias idénticas

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1 INGENIERÍA GENÉTICA

2 Clonación molecular Clonar significa hacer copias idénticas Este término originalmente fue aplicado al procedimiento de aislar una célula y permitirle reproducirse creando una población de células idénticas Actualmente, la clonación molecular involucra la separación de un fragmento de DNA específico, unirlo a una pequeña molécula de DNA acarreador y luego replicar este DNA modificado miles o millones de veces mediante el incremento en el número de células así como por al aumento en el número de copias del DNA clonado en cada célula El resultado es una amplificación selectiva de un gen o segmento de DNA en particular

3 1 La clonación molecular involucra los siguientes pasos in a selective medium 5 1. Aislamiento del DNA a clonar y purificación del vector molecular 2. Corte del DNA usando enzimas de restricción 3. Unión del DNA exógeno en el vector molecular 4. Introducción del DNA recombinante en un organismo para su amplificación 5. Selección de las células que contienen el DNA recombinante

4 AISLAMIENTO DE DNA Lisis celular y de núcleos en el caso de eucariontes (detergentes, proteasas, cambios de presión) Separación del DNA del resto de los componentes celulares (principalmente proteínas). Desnaturalizantes de proteínas, solventes (fenolcloroformo) Repetir la extracción. Eliminación del fenol Formación de sal de ácido nucleico y precipitación con etanol o isopropanol Disolver el DNA (se concentra) Análisis del DNA

5 Análisis de ácidos nucléicos por espectrofotometría Espectro de absorción de DNA Estimación de la concentración de A.N. por espectrofotometría A 260 = 1 50 g/ml DNA dc 33 g/ml DNA cs 40 g/ml RNA También se mide la relación de abs. A 260 / A 280 =>

6 Análisis electroforético de ácidos nucléicos Separación en geles de agarosa (1 4%) Electroforesis horizontal. Migran al ánodo Tinción con bromuro de etidio o Sybr safe Intercala entre las bases del DNA Forman complejos fluorescentes

7 Separación electroforética de moléculas de DNA + (A) Geles de secuenciación (separación de bandas con 1 nt de diferencia) (B) Electroforesis para RFLP (separación entre 100 a 10,000 nt) (C) Electroforesis de campo pulsante (separación de DNA cromosomal) + +

8 Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas de DNA y cortan en esos sitios Son purificadas de bacterias Las enzimas de restricción son endonucleasas Rompen en sitios específicos del DNA Reconocen secuencias palindrómicas específicas de 4, 6, u 8 pb. Algunas generan extremos romos y otras generan extremos cohesivos, éstos pueden ser: - 5 protruyentes - 3 protruyentes

9 El corte del DNA con enzimas de restricción genera extremos romos 5 protruyentes 5 protruyentes Análisis 3 protruyentes

10 Las enzimas de restricción fueron aisladas de bacterias; su función natural es proteger contra DNA extraño

11 Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos (sticky) que pueden asociarse con otros semejantes DNA de un plásmido digerido con EcoRI DNA genómico digerido con EcoRI Extremos son compatibles Las bases de los extremos cohesivos se aparean, aunque quedan sin unir covalentemente

12 Vectores de clonación Plásmidos DNA doble cadena, circular, origen propio de replicación Se pueden clonar fragmentos entre 1,000 y 10,000 nucleótidos

13

14 Origen de replicación Permite que la molécula se replique en un cierto tipo de célula Características de los plásmidos Marcadores de resistencia a antibióticos Permiten la selección de bacterias transformadas con el plásmido o con el DNA recombinante

15 Características de los plásmidos Sitio múltiple de clonación: Sitios reconocidos por diferentes enzimas de restricción que solo cortan una vez en el plásmido

16 Operon Lac : regulación de la expresión de lacz Off On Inductor Jacob Monod

17 Resultado de romper el X-gal Cuando se cultivan colonias silvestres (wild type) en presencia de X-gal y se induce la expresión de galactosidasa con un inductor gratuito, el X-gal es cortado produciendo un pigmento azul, y por lo tanto las colonias son azules. -gal color azul IPTG: Inductor gratuito LB-agar IPTG + X-gal

18 -Complementación El gen lacz tiene dos mutantes: M15 y péptido que no son capaces de producir galactosidasa activa Sin embargo, cuando estos dos genes mutados se encuentran en una misma célula, el péptido se combina con la proteína -gal mutante generando una enzima -gal activa la cual rompe al X-gal, produciendo colonias azules. Fenotipos de los mutantes lacz en X-gal

19 Aplicación de la -complementación para la selección de moléculas recombinantes El MCS del vector está insertado entre el promotor y el péptido en el extremo 5 del gen lacz de E. coli Cuando el vector contiene un fragmento de DNA insertado en el MCS, la galactosidasa no es activa y por lo tanto el X-gal no es roto y no se producen colonias azules, las colonias son blancas.

20 LB-Amp+ IPTG+X-Gal

21 Inserción de DNA exógeno en un vector molecular a) Corte del DNA con enzimas de restricción b) Ligación del DNA foráneo con una DNA ligasa, incorporándolo al vector

22 Construcción de una molécula de DNA recombinante DNA A DNA B DNA AB ligasa Une covalentemente formando un enlace fosfodiéster

23 Reacción de ligación

24 Introducción de moléculas de DNA recombinante a bacterias hospederas Múltiples copias de DNA recombinante

25 Plásmido de bajo número de copias Plásmido de alto número de copias La transformación implica la introducción de DNA extraño a una célula hospedante

26

27 Los fagos como vectores de clonación

28 Cromosomas artificiales de bacteria (BAC s) Gen de -galactosidasa Se pueden clonar hasta 350,000 nt Medio con sustrato de -gal Colonias azules: plasmido nativo Colonias blancas: plasmido recombinante

29 Cromosomas artificiales de levadura (YAC s) Se pueden clonar hasta 1,000,000 nucleótidos

30 Bibliotecas genómicas DNA genómico Digestión con enzima de restricción

31 Bibliotecas de cdna RNA mensajero Cebador de oligo dt Reverso transcripción Síntesis de DNA doble cadena

32 Bibliotecas genómicas vs. Bibliotecas de cdna

33 BUSCANDO UN GENE EN LA BIBLIOTECA GENÓMICA

34 Hibridación y reconocimiento de secuencias con alta homología 65 o C 50 o C

35 Marcaje de un fragmento de DNA (obtención de una sonda) dctp[ 32 P]

36 BUSCANDO UN GENE EN LA BIBLIOTECA GENÓMICA

37 SECUENCIACIÓN DE DNA

38

39

40 Secuenciación de DNA por el método de Sanger No acepta elongación de la cadena de nucleotidos por la DNA polimerasa dsdna molde ( secuencia?) 4 desoxiribonucleótidos (dntps) cebador de DNA DNA polimerasa

41 SECUENCIACIÓN DE DNA

42 La lectura de la secuencia se hace de abajo hacia arriba

43 Secuenciación automatizada de DNA En una sola reacción se incluyen los cuatro dideoxys marcados con un fluoróforo distinto cada uno. No es necesario detener la reacción. Es posible secuencias fragmentos 800 pb Se lee con un láser y se almacena la secuencia en una computadora.

44 DETECCIÓN DE UN GENE ESPECÍFICO

45 Secuencia de pasos para la detección de genes específicos A nivel de genoma (DNA) Southern Blot A nivel de transcriptoma (RNA) Northern Blot 1. Aislamiento de DNA 2. Cortar con enzimas de restricción 3. Separar fragmentos por electroforesis 4. Desnaturalizar el DNA 5. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 6. Hibridar con sonda específica 7. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager 1. Aislamiento de RNA 2. Desnaturalizar el RNA 3. Separar por electroforesis desnaturalizante 4. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 5. Hibridar con sonda específica 6. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager

46 Bromuro de etidio Sonda 32 P

47 Southern Blot Northern Blot 28S 18S

48 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

49 La amplificación es exponencial En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento particular de interés

50 El uso de una DNA pol termoresistente ha permitido el desarrollo de la PCR Thermus aquaticus Taq DNA Polimerasa Great Fountain Geyser, Yellowstone. Manantial Temperatura C

51 Después del PCR los fragmentos se pueden clonar Los cebadores son diseñados con extremos reconocidos por enzimas de restricción

52 El PCR se puede utilizar como alternativa del Southern y Northern blot DNA: PCR Amplificación directa Exones + intrones RNA: RT-PCR 1. Transcripción reversa (obtención de cdna) 2. Amplificación por PCR Solo exones

53 Pruebas de identidad

54 La reacción de PCR tiene múltiples aplicaciones Detección de alelos mutantes caracterizados. Búsqueda de alelos mutantes no conocidos. Identificación de microorganismos patógenos. Caracterización de cepas del virus de la influenza Aislamiento de moléculas de DNA genómico y de cdna (Clonación de genes) Secuenciación de DNA Generación de mutantes puntuales. Estudiar la expresión génica.

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